蛋白表达纯化20110419

第一章蛋白表达纯化一、诱导表达分析1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜;2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜;3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时;4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。

二、蛋白纯化2.1重组蛋白的提取2.1.1 提取缓冲液20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。

如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。

Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。

2.1.2 方法1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30minutes at +4 °C)。

2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬；3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。

4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。

5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分析。

Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。

还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。

6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。

7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。

Note:含有8 M urea的样品可以直接电泳上样，但含有6 M guanidine hydrochloride的样品必须换成8 M urea才可上样。

蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total—RNA。

2、设计蛋白表达引物。

引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA。

4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。

表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon(DE3)等。

7、蛋白的诱导表达.1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0。

6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。

37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达).2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3）将有表达的菌株10％甘油保种,保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。

甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60％，使用时自己计算用量。

4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140—180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1％的葡萄糖用来抑制本底表达。

葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。

2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。

8、包涵体检测。

方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。

1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1。

5，约5h左右，视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。

2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1。

0左右（约2.5h～3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。

）注：菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

生物制药中的蛋白质表达与纯化技术生物制药是指利用生物技术和生物制备技术生产药品。

蛋白质是重要的生物大分子，在生物制药中，利用蛋白质表达技术制备蛋白质药物已经成为制备生物制药的重要手段之一。

在蛋白质表达和纯化中，重要的问题是选择适合的表达载体和表达宿主细胞，以及优化表达条件，提高表达能力和质量。

此外，表达的蛋白质需要纯化和质量控制等关键步骤，以保证药品的安全有效。

蛋白质表达技术蛋白质表达技术是指利用基因工程技术将目标蛋白质的编码基因导入到表达宿主细胞内，通过转录和翻译等过程表达出目标蛋白质。

根据表达载体的不同，蛋白质表达技术可分为细胞自主表达和外源表达两类。

细胞自主表达是指目标蛋白质能够在宿主细胞自身的代谢和生理过程中产生和积累。

这种表达方式常见于真核细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞等。

此外，还有一些原核细胞能够自主表达复杂蛋白质，如高等厌氧菌和嗜热菌等。

外源表达是指将目标蛋白质的编码基因插入到宿主细胞的表达载体中，通过改变细胞代谢和生理状态，促进目标蛋白质的表达。

目前，外源表达技术已经被广泛应用于生物制药领域。

外源表达常用的表达宿主细胞包括细菌、真菌、昆虫、植物和哺乳动物等。

在选择表达载体和表达宿主细胞时，需要考虑到许多因素，如表达载体的复制数目、启动子、选择标记、信号序列、表达宿主细胞的生长速度、生理状态、代谢途径等。

蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指将从表达宿主细胞中获得的蛋白质经过一系列的分离、纯化和检测等步骤，去除不必要的成分和杂质，提高目标蛋白质的纯度和活性。

在纯化过程中，需要根据目标蛋白质的生化性质和物理性质选择不同的分离和检测手段，例如亲和层析、逆向层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、凝胶电泳等。

亲和层析是利用亲和基团与目标蛋白质相互作用，实现目标蛋白质的纯化。

通常，亲和基团可与目标蛋白质的某种生化或物理性质相互作用，例如其特异抗原性、活性或生物学功能等。

例如，利用亲和层析纯化抗体、酶或膜受体等蛋白质时，通常采用大量的亲和基团，如包括Ni2 +、酵母己糖、自旋素、脂肪酸酰化酶亲和基团等。

蛋白质的表达和纯化技术概述蛋白质是生命体内最基本的组成部分之一，它们扮演着各种不同的角色，如催化酶、参与信号转导等。

了解蛋白质的结构和功能，能够帮助科学家研究生命过程和疾病发生的机制。

因此，蛋白质表达和纯化技术是现代生物学研究中的重要环节。

蛋白质表达技术蛋白质表达技术是指将目标蛋白质基因导入到宿主细胞中，使其能够在细胞内大量表达目标蛋白质的过程。

根据目标蛋白质的性质和功能需求，可以选择不同的表达系统，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。

大肠杆菌是最常用的表达系统之一。

其具有成本低、表达量高等优点，同时易于培养和操作。

但是，大肠杆菌的表达系统在表达复杂蛋白质时存在很多问题，如蛋白毒性、折叠错误等。

因此，针对不同类型的目标蛋白质，需要选择不同的表达系统，并优化其表达条件。

蛋白质纯化技术蛋白质纯化技术是指从混合物中纯化目标蛋白质的过程，包括初级纯化、中级纯化和高级纯化等步骤。

初级纯化包括离心、过滤和电泳等方法，主要是为了去除大分子和杂质。

中级纯化主要使用柱层析和凝胶电泳等技术，分离目标蛋白质和杂质。

最后，高级纯化主要通过高效液相色谱（HPLC）等手段，获得高纯度的目标蛋白质。

在进行蛋白质纯化时，需要考虑目标蛋白质的性质，如分子量、电荷性、亲和力等。

根据这些属性，可以选择合适的纯化方法，并进行优化。

同时，需要注意纯化过程的选择和条件设置，以确保目标蛋白质的活性和稳定性。

结论蛋白质表达和纯化技术对于生物学研究和生物制药等领域具有重要的意义。

在不同的研究领域中，选择合适的表达和纯化技术是确保研究成功的关键之一。

因此，对蛋白质表达和纯化技术的理解和掌握，有助于推动生物科技的发展。

蛋白质表达与纯化方法的探讨及其在生物学中的应用蛋白质是生物体内各种生化过程的基本组成部分，其表达量和纯度的控制对于生物学和医学研究至关重要。

本文将就常见的蛋白质表达和纯化方法进行探讨，同时介绍其在生物学中的应用。

一、蛋白质表达方法的选择目前常见的蛋白质表达方法包括细胞内、细胞外和体外。

其中细胞内表达指的是将目标蛋白质表达于细胞内，常见的细胞包括大肠杆菌、酵母等；细胞外表达指的是将目标蛋白质分泌至细胞外，常见的细胞包括酵母、昆虫细胞等；而体外表达则是将目标蛋白质通过类似于“原子层”沉积的方式在表面上合成。

在选择表达方法时，需要考虑蛋白质的性质，以及表达的目的和条件是否适合。

以细胞内表达为例，由于若干原因，有时难以获得需表达的目标蛋白质，如毒性等。

这时，可以采用融合蛋白质表达的方式。

融合蛋白质即将目标蛋白质与另一种蛋白质融合表达，使其易于纯化。

例如，常用的荧光标记融合蛋白质GFP就是一种常见的融合蛋白。

二、蛋白质纯化方法的选择蛋白质纯化的目的是获得高品质、高纯度的蛋白质。

至于纯化方法的选择，主要依赖于纯化条件，如目标蛋白质的大小、疏水性等等，和原料的来源等条件。

常用的纯化方法包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析、逆流层析等等。

这里我们简单介绍一下离子交换、凝胶过滤和融合蛋白质纯化。

离子交换法是一种基于蛋白质在离子力场中的电荷差异而进行分离的常用方法。

常见的离子交换树脂有丙烯酸树脂和羧甲基纤维素树脂。

这种方法具有分离效果好、操作简单等优点，但由于其在分离过程中使用了高浓度的盐溶液，因此有可能对蛋白质的结构和活性产生不良影响。

凝胶过滤法的主要原理是根据蛋白质的大小进行分离，通常使用分子筛、琼脂糖等材料。

相对于离子交换法，凝胶过滤法不需要使用盐溶液，因此对蛋白质的结构和活性影响相对较小。

不过，凝胶过滤法在分离过程中需要多次循环，操作较为繁琐。

融合蛋白质纯化则是通过利用融合蛋白质的亲和性将目标蛋白质和另一种蛋白质结合起来进行分离。

分子生物学实验中的蛋白质表达与纯化技术分享在分子生物学研究中，蛋白质表达与纯化是非常重要的实验技术。

蛋白质是生物体内最基本的功能分子，对于理解细胞生物学、疾病发生机制以及药物研发等方面都具有重要意义。

本文将分享一些常用的蛋白质表达与纯化技术，希望对读者在分子生物学实验中有所帮助。

一、蛋白质表达技术蛋白质表达是指在外源宿主中大量合成目标蛋白质的过程。

常用的蛋白质表达系统包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。

其中，大肠杆菌是最常用的宿主菌，其表达系统简单、成本低，适用于大规模蛋白质表达。

酵母表达系统具有高度的翻译后修饰能力，适用于复杂蛋白质的表达。

昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统适用于复杂蛋白质的表达，并能够实现正确的翻译后修饰。

在蛋白质表达过程中，关键的一步是选择适当的表达载体。

表达载体是将目标基因导入宿主细胞中进行表达的工具，常见的表达载体有质粒、病毒和细胞系等。

质粒是最常用的表达载体，可以通过转染、电穿孔或热激转化等方法导入宿主细胞中。

病毒载体则通过感染宿主细胞实现基因的表达，适用于高效表达大规模蛋白质。

细胞系则是将目标基因整合到宿主细胞染色体中进行表达，适用于稳定长期表达的需求。

二、蛋白质纯化技术蛋白质纯化是从复杂的混合物中分离出目标蛋白质的过程。

常用的蛋白质纯化技术包括亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤层析和透析等。

亲和纯化是利用目标蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化的方法。

常见的亲和基质有金属螯合树脂、抗体亲和树脂和亲和标签等。

金属螯合树脂利用金属离子与亲和标签之间的配位作用实现纯化，适用于带有亲和标签的蛋白质。

抗体亲和树脂则利用抗体与目标蛋白质之间的特异性结合实现纯化，适用于已有特异抗体的蛋白质。

亲和标签是将特定序列或蛋白质结构引入目标蛋白质中，通过与亲和基质之间的特异性结合实现纯化。

离子交换层析是利用目标蛋白质与离子交换基质之间的电荷相互作用进行纯化的方法。

离子交换基质通常是带有正或负电荷的树脂，通过调节缓冲液的离子浓度和pH值，实现目标蛋白质与基质的选择性结合和洗脱。

蛋白质表达和纯化技术的研究蛋白质是细胞生命活动的基础，其表达和纯化技术的研究在现代生物医学领域中具有至关重要的地位。

本文将从获得目的蛋白质的源头开始，对表达纯化技术的研究进行探讨。

一、目的蛋白质的来源目的蛋白质的来源包括天然源和人工合成源。

天然源包括细胞、组织、生物体等等，这些天然源已经通过基因转移技术获得了含有目的蛋白质的表达系统。

人工合成源则是通过化学方法合成的蛋白质，其合成的优点在于能够快速获得大量的高纯度蛋白质，但其缺点是成本较高且难以形成复杂结构。

二、表达技术的研究表达技术是指将蛋白质基因转移到表达宿主中，实现蛋白质的异源表达，由于其可大幅度提高蛋白质的产量并且满足目的蛋白质的特定需求，因而是蛋白质研究中的关键技术之一。

1、宿主选择宿主选择是表达技术的关键步骤。

宿主的选择应当考虑到以下因素：宿主的复杂度、宿主的发酵条件、宿主的易用性、宿主的稳定性、宿主的适应性等等，不同的宿主在表达过程中会出现各种情况，使得表达效果有所不同。

常用的宿主有：细菌、真菌、酵母、哺乳动物细胞（包括显胶质细胞和卵巢细胞等）等。

细菌表达是最常用的宿主，特别是大肠杆菌表达系统。

2、转染技术将蛋白质基因转移到表达宿主中需要转染技术的支持。

常见的转染技术包括：化学法、电穿孔法、微射流法等。

3、高效启动子的设计启动子是控制基因表达的开关，具有高效稳定的启动子是实现高产蛋白质表达的关键之一。

高效启动子的设计需要考虑到其启动效率、启动时间、特异性等多方面因素。

三、纯化技术的研究表达技术能够大幅度提高目的蛋白质的产量，但同时也会带来一定的杂质。

因此，浓度较低的目的蛋白质需要通过一系列方法进行纯化，使其达到较高的纯度。

这里介绍常用的三种纯化方法：亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。

1、亲和层析亲和层析是一种基于靶分子和配体之间亲和力的层析技术。

亲和层析通常依赖于目的蛋白质的某种生物活性，如酶活性、配体亲和性等等。

目的蛋白质将会与配体结合在亲和柱质量，其它成分则会集中在流出液中。

蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、设计蛋白表达引物。

引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因 c DNA.4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。

表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon（DE3）等。

7、蛋白的诱导表达。

1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。

37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。

动等原因，要及时调整。

溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。

5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。

注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。

2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟，60分钟足够裂解。

8、取得上清1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。

10000rpm，15min，4°离心。

沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。

轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。

（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。

平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。

）9、纯化上清---摸洗脱条件。

1）镍柱处理。

将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。

（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml 的枪将胶体吹散。

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蛋白原核表达纯化原理蛋白原核表达纯化是一种常用的生物技术方法，用于大量制备目标蛋白质。

该方法可以在原核细胞中直接表达目标蛋白，然后通过一系列的纯化步骤获得高纯度的蛋白质样品。

以下将详细介绍蛋白原核表达纯化的原理和步骤。

蛋白原核表达纯化的原理主要基于细菌细胞的生物特性。

在表达过程中，目标蛋白的基因会被插入到表达载体中，该载体会被转化到细菌细胞中。

转化后的细菌细胞会利用其自身的代谢机制表达目标蛋白。

蛋白原核表达纯化的步骤主要包括以下几个方面：第一步，构建表达载体。

在这一步骤中，目标蛋白的基因会被插入到表达载体的多克隆位点中。

这个过程可以通过PCR扩增目标基因，然后将其连接到表达载体上。

第二步，转化细菌细胞。

在这一步骤中，经过构建的表达载体会被转化到细菌细胞中。

转化可以使用化学方法或电穿孔等物理方法进行。

第三步，培养表达菌株。

转化后的细菌细胞会被培养在含有适当抗生素的培养基中。

培养的条件包括温度、pH值、搅拌速度等，这些条件可以根据目标蛋白的特性进行优化。

第四步，诱导表达。

在菌株达到一定的生长密度后，可以通过添加适当的诱导剂来诱导目标蛋白的表达。

诱导剂的选择可以根据目标蛋白的特性进行优化。

第五步，收获细胞。

在表达过程中，细菌细胞会合成大量的目标蛋白。

可以通过离心等方法，将细菌细胞从培养基中收获下来。

第六步，裂解细胞。

收获的细菌细胞需要被裂解，以释放目标蛋白。

常用的方法包括超声波、高压等物理方法，以及酶解等化学方法。

第七步，纯化目标蛋白。

裂解后的混合物中含有大量的杂质，需要通过一系列的纯化步骤来获得高纯度的目标蛋白。

常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。

经过以上步骤，蛋白原核表达纯化的过程就完成了。

这种方法可以高效地制备目标蛋白，并且可以根据需要进行优化。

蛋白原核表达纯化在生物医药、生物工程等领域有着广泛的应用前景，对于研究目标蛋白的结构和功能具有重要意义。

蛋白质表达和纯化技术的研究与应用近年来，蛋白质表达和纯化技术日益成熟和受到重视，其在生物医药、工业化学等领域的应用也越来越广泛。

本文将从蛋白质表达和纯化的基本概念入手，论述其研究和应用，并探讨其未来发展趋势。

一、蛋白质表达和纯化的基本概念蛋白质表达是指通过基因工程手段使目标蛋白在细胞内或细胞外进行表达的过程。

一般来说，蛋白质表达可以分为原核细胞和真核细胞表达两种方式。

其中，原核细胞表达利用大肠杆菌等细菌作为表达宿主，而真核细胞表达则通常采用哺乳动物细胞或酵母细胞。

蛋白质纯化则是指通过一系列化学、物理等方法将目标蛋白从混合样品中分离出来的过程。

纯化的方法包括离子交换、亲和层析、凝胶过滤等。

其中，亲和层析是一种常用的手段，其利用蛋白质与配体之间的非共价相互作用，如亲和性，选择性地将目标蛋白从混合物中分离出来。

二、蛋白质表达和纯化的研究和应用蛋白质表达和纯化技术的研究和应用已经广泛地涉及到生物医药、食品加工、饲料添加剂等多个领域。

下面会分别从三个方面来介绍其应用。

1、生物医药领域在生物医药领域中，蛋白质表达和纯化技术在制备重组蛋白、生产多肽类激素等方面发挥着重要的作用。

例如，通过表达重组人胰岛素，可以生产出纯化的胰岛素产品，治疗糖尿病等疾病。

此外，利用这种技术可制备重组人影响素和重组人乙肝疫苗等生物制品，广泛地应用于临床治疗。

2、食品加工领域蛋白质在食品加工领域中也有很大的应用。

采用蛋白质表达和纯化技术，可以制备豆腐、酱油等大豆制品，以及某些膳食营养补充剂等。

通过提高食品加工中的蛋白质含量和纯度，可以改善食品的质量和味道，增加其营养价值。

3、饲料添加剂领域蛋白质表达和纯化技术在饲料添加剂领域的应用也比较广泛。

通过制备高纯度的饲料添加剂，可以提高家禽、水产养殖等养殖业的生产效率，降低养殖成本。

同时，蛋白质在饲料添加剂中也起到了相当重要的营养作用，能够有效地提高动物的生长速度和肉质质量。

三、蛋白质表达和纯化技术的未来发展趋势目前，蛋白质表达和纯化技术还存在一些不足，例如表达效率不高、蛋白质结构易受到环境的影响等问题。

蛋白质的表达、分离、纯化实验流程蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。

实验步骤一：材料准备1. 实验材料：大肠杆菌BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒二：实验操作1.试剂准备：2.2. 获得目的基因①PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。

②通过RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。

3. 构建重组表达载体①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。

②PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。

4. 获得含重组表达质粒的表达菌种①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。

否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

③以此重组质粒DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。

5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37 ℃震荡培养过夜。

②按1:50 或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。

真核蛋白表达及纯化步骤
真核蛋白表达及纯化步骤如下：
1. 重组质粒构建：
a. 目的基因的获取：基因合成、PCR。

b. 线性载体的获取：载体酶切，获取线性载体。

c. 重组反应：根据连接酶说明，进行线性载体和目的基因片段的酶连；转化涂板（相应抗性）。

d. 质粒验证：质粒验证图，质粒测序验证。

2. 蛋白诱导表达：普适条件查看蛋白是否表达（如本实验室在BL21（DE3）中，37℃，1mM IPTG诱导表达5h）。

若不表达，更换载体、表达菌株等方法查看是否表达；若表达，继续进行下面实验。

3. 蛋白表达部位分析：分析蛋白是可溶性的还是不溶性的表达，即在超声后上清表达还是沉淀表达；是否与你的目标蛋白表达部位相同，相同进行后续蛋白表达条件优化。

4. 蛋白小量表达条件优化：优化诱导IPTG浓度、诱导温度。

5. 蛋白大量表达：根据小量表达优化的条件等比例放大培养。

6. 蛋白纯化：根据目标蛋白的性质（可溶性蛋白or膜蛋白）进行样本处理。

然后进行亲和纯化，获取目的蛋白。

生物化学中的蛋白质表达和纯化蛋白质是细胞中最基本的生物大分子之一，具有重要的结构和功能作用。

在生化实验研究中，常常需要大量的蛋白质作为实验材料。

蛋白质表达和纯化技术是生物化学研究中的关键技术之一。

本文将简要介绍蛋白质表达和纯化的原理和方法。

一、蛋白质表达技术蛋白质表达是将目的基因转录成RNA后再翻译成蛋白质的过程。

蛋白质表达主要有原核细胞和真核细胞两种方法。

原核细胞表达系统主要利用大肠杆菌，真核细胞表达系统则使用哺乳动物细胞，其主要的表达技术有以下几种：（一）重组蛋白质大规模表达重组蛋白质是指人为构建的同源或异源蛋白序列，利用基因工程技术将其导入到表达宿主中进行高效表达的蛋白质。

大肠杆菌是目前最常用的宿主。

一般来说，要将目的基因插入到选择性表达载体中，选用合适的启动子和终止子，将目的蛋白质与标签结合。

表达宿主随后被转化，蛋白质在生长过程中表达出来，随后进行纯化和鉴定。

（二）GST融合蛋白表达GST融合蛋白是利用GST (glutathione S-transferase)标签的蛋白质，将GST和目的蛋白质融合在一起表达，然后通过Glutathione 亲和层析纯化方法纯化目的蛋白质。

GST融合蛋白可以提高目的蛋白质的稳定性和可溶性，使得其在细胞内表达更加稳定。

（三）His标签蛋白表达His标签是一种聚组氨酸标签，可以与Ni2+螯合，因此可采用Ni2+亲和层析的方法纯化。

His标签融合蛋白表达时选择了较少的氨基酸标签，对目标蛋白的生物学性质和功能影响较小。

二、蛋白质纯化技术蛋白质表达和纯化是蛋白质生物化学研究的关键。

通常情况下，表达宿主细胞中的蛋白质必须经过纯化才能得到纯净的蛋白质，获得足够高纯度的蛋白质可用于测定其结构和功能。

（一）离子交换层析法离子交换层析法是利用蛋白质负荷（或正荷）的离子性质与相应的离子交换质团之间进行选择性结合的纯化方法。

离子交换层析法分为阴离子交换层析和阳离子交换层析两种。