Analysis on differentially expressed genes in watermelon rind color based on RNA–Seq

植物资源与环境学报，２０１９，２８（１）：１０－１５ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ收稿日期：２０１８－０６－１１基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１５６００８７）；黔南民族医学高等专科学校大学生创新创业项目（ＱＮＹＺ２０１７０７）；遵义医学院大学生创新项目（２０１７５１００９）；贵州省科学技术厅人才成长项目（ＫＹ［２０１７］１９４）；遵义医学院博士启动基金（Ｆ－８０９）作者简介：谢㊀欣（１９９０ ），女，贵州瓮安人，硕士研究生，主要从事药用植物分子遗传方面的研究工作㊂①通信作者Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｑｉａｎｇａｎｇ６９＠ｓｉｎａ．ｃｎ千里光茎和叶的差异表达基因分析谢㊀欣１，２，钱秋博言２，贺莉芳２，李㊀林１，杨春先１，左青青１，钱㊀刚１，①（１．遵义医科大学细胞生物学教研室，贵州遵义５６３０００；２．黔南民族医学高等专科学校护理系，贵州都匀５５８００３）摘要：以千里光（ＳｅｎｅｃｉｏｓｃａｎｄｅｎｓＢｕｃｈ．⁃Ｈａｍ．ｅｘＤ．Ｄｏｎ）强抗菌性植株ＳＣ－３２为研究对象，分别提取其茎和叶的总ＲＮＡ，经质量检测合格后构建ｃＤＮＡ文库，利用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２５００高通量测序平台对千里光茎和叶的ｃＤＮＡ文库进行转录组测序，筛选差异表达基因，并运用Ｎｒ㊁Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ㊁ＫＥＧＧ和ＣＯＧ数据库对差异表达基因进行功能分析㊂结果表明：从千里光茎和叶的ｃＤＮＡ文库中分别获得２６１４７０１６和２６９９６１１９个ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ，Ｑ３０值分别为９５ １７％和９４ ７４％，说明其转录组测序结果良好㊂从千里光的茎和叶中共筛选到１０９９１个差异表达基因，以茎中差异表达基因的表达量为准，叶中上调的差异表达基因有５５４２个，下调的差异表达基因有５４４９个㊂千里光的茎和叶中共有７６８３个差异表达基因被ＧＯ功能注释成生物过程㊁细胞组分和分子功能３个大类５３个亚类，且这些差异表达基因与信号传导途径㊁次生代谢过程㊁细胞组分合成和酶催化活性等密切相关㊂ＫＥＧＧ代谢通路分析结果表明：共有４５２７个差异表达基因，涉及５０个代谢通路，主要参与碳代谢㊁氨基酸生物合成及淀粉和蔗糖代谢㊂研究结果显示：千里光茎和叶的差异表达基因具有器官特异性，并且，其茎和叶的分化和形成与多糖和蛋白质累积密切相关㊂关键词：千里光；高通量测序；差异表达基因；茎和叶中图分类号：Ｑ９４６－３３；Ｑ７８６；Ｓ５６７ ２３＋９㊀㊀文献标志码：Ａ㊀㊀文章编号：１６７４－７８９５（２０１９）０１－００１０－０６ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－７８９５．２０１９．０１．０２ＡｎａｌｙｓｉｓｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｏｆＳｅｎｅｃｉｏｓｃａｎｄｅｎｓ㊀ＸＩＥＸｉｎ１，２，ＱＩＡＮＱｉｕｂｏｙａｎ２，ＨＥＬｉｆａｎｇ２，ＬＩＬｉｎ１，ＹＡＮＧＣｈｕｎｘｉａｎ１，ＺＵＯＱｉｎｇｑｉｎｇ１，ＱＩＡＮＧａｎｇ１，①（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，ＺｕｎｙｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｕｎｙｉ５６３０００，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＮｕｒｓｉｎｇ，ＱｉａｎｎａｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｆｏｒＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｄｕｙｕｎ５５８００３，Ｃｈｉｎａ），Ｊ．ＰｌａｎｔＲｅｓｏｕｒ．＆Ｅｎｖｉｒｏｎ．，２０１９，２８（１）：１０－１５Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇｓｔｒｏｎｇａｎｔｉ⁃ｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｌａｎｔＳＣ⁃３２ｏｆＳｅｎｅｃｉｏｓｃａｎｄｅｎｓＢｕｃｈ．⁃Ｈａｍ．ｅｘＤ．Ｄｏｎａｓｒｅｓｅａｒｃｈｏｂｊｅｃｔ，ｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｉｔｓｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｆｔｅｒｑｕａｌｉｆｉｅｄｂｙｑｕａｌｉｔｙｔｅｓｔ．ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｉｅｓｏｆｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｏｆＳ．ｓｃａｎｄｅｎｓｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２５００ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍ，ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄ，ａｎｄｔｈｅｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｅｓｗｅｒｅｃｏｎｄｕｃｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇＮｒ，Ｓｗｉｓｓ⁃Ｐｒｏｔ，ＫＥＧＧ，ａｎｄＣＯＧｄａｔａｂａｓｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔ２６１４７０１６ａｎｄ２６９９６１１９ｃｌｅａｎｒｅａｄｓａｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｉｅｓｏｆｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｏｆＳ．ｓｃａｎｄｅｎｓ，ａｎｄｔｈｅｉｒＱ３０ｖａｌｕｅｓａｒｅ９５ １７％ａｎｄ９４ ７４％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｉｔｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｉｓｆｉｎｅ．１０９９１ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓａｒｅｔｏｔａｌｌｙｓｃｒｅｅｎｅｄｆｒｏｍｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｏｆＳ．ｓｃａｎｄｅｎｓ．Ｔａｋｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｉｎｓｔｅｍａｓｓｔａｎｄａｒｄ，ｔｈｅｒｅａｒｅ５５４２ｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓａｎｄ５４４９ｄｏｗｎ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｌｅａｆ．７６８３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｏｆＳ．ｓｃａｎｄｅｎｓａｒｅｔｏｔａｌｌｙａｎｎｏｔａｔｅｄｂｙＧＯｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｏ５３ｓｕｂ⁃ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓｏｆ３ｍａｊｏｒｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓ，ｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ），ａｎｄｔｈｅｓｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓａｒｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙ，ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｃ第１期谢㊀欣，等：千里光茎和叶的差异表达基因分析ｐｒｏｃｅｓｓ，ｃｅｌｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄｅｎｚｙｍｅｃａｔａｌｙｚｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ｅｔｃ．ＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔｏｆＫＥＧＧｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｓｈｏｗｓｔｈａｔｔｈｅｒｅａｒｅ４５２７ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ，ｗｈｉｃｈｒｅｌａｔｅｔｏ５０ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｓ，ａｎｄｍａｉｎｌｙｉｎｖｏｌｖｅｉｎｃａｒｂｏｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ａｎｄｓｔａｒｃｈａｎｄｓｕｃｒｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ＩｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｏｆＳ．ｓｃａｎｄｅｎｓｈａｖｅｏｒｇａｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆａｒｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＳｅｎｅｃｉｏｓｃａｎｄｅｎｓＢｕｃｈ．⁃Ｈａｍ．ｅｘＤ．Ｄｏｎ；ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅ；ｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆ㊀㊀随着高通量测序（ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技术的快速发展，用于数字基因表达谱（ｄｉｇｉｔａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇ，ＤＧＥ）研究的深度测序技术不但广泛用于有参考基因组序列的物种分析，而且能够直观显示基因组的功能元件和剪切方式，确定基因的转录结构，量化各转录本在发育过程中和不同条件下表达水平的变化，以及对所有转录产物进行分类［１］，从而实现对无参考基因组序列的物种进行转录组学研究［２－３］㊂由于转录组测序蕴含了大量的基因表达信息和数据量，能够更加精确地定量分析特异基因的表达水平和等位基因转录本的特异表达，目前转录组测序已成为了解控制数量性状的基因组大规模表达情况的重要手段［４］㊂近年来，国内外研究者对部分经济作物和模式植物［５－８］进行了转录组测序研究，但在中医药领域研究中却处于起步阶段㊂千里光（ＳｅｎｅｃｉｏｓｃａｎｄｅｎｓＢｕｃｈ．⁃Ｈａｍ．ｅｘＤ．Ｄｏｎ）隶属于菊科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）千里光属（ＳｅｎｅｃｉｏＬｉｎｎ．），为重要的传统抗菌中草药，主要用于治疗风热感冒㊁目赤肿痛㊁泄泻痢疾及皮肤湿疹疮疖等［４，９］，具有良好的开发和利用前景㊂目前，关于千里光的研究主要集中在化学组分和药理学作用机制等［９］方面，而关于其功能基因组学的研究却极其匮乏㊂相关研究表明：千里光不同品种的抗菌性差异显著［４］，其不同部位的药效也有明显差异［１０］，因此，探明千里光不同器官的功能基因差异表达对于了解其药用成分积累和主要药理作用等具有重要意义㊂鉴于此，作者采用高通量测序技术对千里光强抗菌性植株ＳＣ－３２茎和叶的ｃＤＮＡ文库进行转录组测序分析，筛选出差异表达基因，并对这些差异表达基因进行功能分析，以期揭示千里光茎和叶的差异表达基因，为采用比较基因组学（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｅｔｉｃｓ）方法筛选菊科近缘药用植物茎和叶器官分化基因及其功能验证提供参考㊂１㊀材料和方法１ １㊀材料以移植到遵义医科大学细胞生物学教研室中药材种质资源大棚内的野生千里光（来自贵州省遵义市板山地区）强抗菌性植株ＳＣ－３２为实验材料，经遵义医科大学细胞生物学教研室钱刚教授鉴定㊂１ ２㊀方法１ ２ １㊀ＲＮＡ提取和ｃＤＮＡ文库构建㊀取千里光１年生植株从上到下第７枚叶以上部位的茎和叶样品各３份，每份０ １ｇ，置于液氮中充分研磨；采用Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司 提取总ＲＮＡ；用质量体积分数１％的琼脂糖凝胶和ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００微量分光光度计（美国ＮａｎｏＤｒｏｐ公司）检测提取的总ＲＮＡ的纯度㊁浓度和完整性㊂取检测合格的总ＲＮＡ约１μｇ，用带有Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）的磁珠富集ｍＲＮＡ；加入５ˑｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ，随机打断ｍＲＮＡ；以ｍＲＮＡ为模板，采用ＧｅｎｅＲａｃｅｒ试剂盒（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）构建ｃＤＮＡ文库㊂１ ２ ２㊀转录组测序及数据分析㊀使用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２５００高通量测序平台（美国Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司）对ｃＤＮＡ文库进行转录组测序㊂利用Ｔｒｉｎｉｔｙ软件将ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２５００高通量测序平台得到的ｒａｗｄａｔａ按顺序拼接成ｃｏｎｔｉｇ，利用ＴＧＩＣＬ软件进一步处理得到ｕｎｉｇｅｎｅｓ㊂利用ＦＡＳＴＱＣ软件对测序数据进行质量控制，剔除只含有测序接头序列的ｒｅａｄｓ㊁含Ｎ比例大于１０％的ｒｅａｄｓ以及低质量ｒｅａｄｓ（Ｑɤ１０的碱基数占整条ｒｅａｄ碱基数的５０％以上），从而获得高质量ｃｌｅａｎｄａｔａ；使用ＳＯＡＰａｌｉｇｎｅｒ／ＳＯＡＰ２软件将ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ比对到青蒿（ＡｒｔｅｍｉｓｉａｃａｒｖｉｆｏｌｉａＢｕｃｈ．⁃Ｈａｍ．ｅｘＲｏｘｂ．）的参考基因组中，每个ｃｌｅａｎｒｅａｄ最多错配５个碱基，统计ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ在参考基因组中的覆盖度；采用ＦＰＫＭ（ｆｒａｇｍｅｎｔｐｅｒｋｉｌｏｂａｓｅｏｆｅｘｏｎｍｏｄｅｌ１１植物资源与环境学报第２８卷㊀ｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎｍａｐｐｅｄｆｒａｇｍｅｎｔ）法计算基因表达量，并以ＦＣȡ２且ＦＤＲ＜０ ０１为筛选标准（ＦＣ为差异倍数，ＦＤＲ为错误发现率），利用ＤＥＧｓｅｑ软件［１１］筛选差异表达基因；利用ＢＬＡＳＴ软件（ｈｔｔｐ：ʊｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）将ｕｎｉｇｅｎｅｓ序列比对到ＮＣＢＩ的Ｎｒ㊁Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ㊁ＫＥＧＧ和ＣＯＧ（Ｅ值小于１ˑ１０－５）数据库中，利用Ｂｌａｓｔ２ＧＯ软件根据Ｎｒ注释信息进行ＧＯ注释，并利用ＷＥＧＯ软件［１２］对全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ进行ＧＯ功能分类统计㊂２㊀结果和分析２ １㊀转录组测序结果采用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２５００高通量测序平台对构建的千里光茎和叶的ｃＤＮＡ文库进行转录组测序，在对测序数据进行质量控制后，将ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ与青蒿参考基因组进行比对㊂结果显示：从千里光茎和叶的ｃＤＮＡ文库中分别获得２６１４７０１６和２６９９６１１９个ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ，Ｑ３０值分别为９５ １７％和９４ ７４％㊂在千里光茎和叶的ｃＤＮＡ文库中，比对到青蒿参考基因组中的ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ（ｍａｐｐｅｄｒｅａｄｓ）分别有２０７２２４９１和２１６１０１２０个，所占比例分别为７９ ２５％和８０ ０５％㊂其中，比对到参考基因组惟一位置的ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ（ｕｎｉｑｕｅｍａｐｐｅｄｒｅａｄｓ）分别有２６７４４４０和２５１６２３９个，所占比例分别为１２ ９１％和１１ ６４％；而比对到参考基因组多个位置的ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ（ｍｕｌｔｉｍａｐｐｅｄｒｅａｄｓ）分别有１８０４８０５１和１９０９３８８１个，所占比例分别为８７ ０９％和８８ ３６％㊂２ ２㊀差异表达基因筛选结果差异表达基因筛选结果（图１）表明：从千里光茎和叶中共筛选到１０９９１个差异表达基因，以茎中差异表达基因的表达量为准，叶中上调的差异表达基因有５５４２个，占茎和叶差异表达基因总数的５０ ４２％，而叶中下调的差异表达基因有５４４９个，占茎和叶差异表达基因总数的４９ ５８％㊂在筛选差异表达基因过程中，还发现４１０４５个表达量无显著差异的基因，并且，多数差异表达基因集中在－５ɤｌｏｇ２（ＦＣ）ɤ５㊁－ｌｏｇ１０（ＦＤＲ）ɤ２５区域㊂２ ３㊀差异表达基因功能分析２ ３ １㊀ＧＯ功能分类分析㊀采用ＢＬＡＳＴ软件对千里光茎和叶中获得的ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ进行比对，共有６１１７１个ｕｎｉｇｅｎｅｓ被注释，其中差异表达基因有７６８３个㊂ＦＤＲ：错误发现率Ｆａｌｓｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ；ＦＣ：差异倍数Ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ．红点表示上调的差异表达基因Ｒｅｄｄｏｔｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ；绿点表示下调的差异表达基因Ｇｒｅｅｎｄｏｔｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｄｏｗｎ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ；横向虚线以下及纵向虚线间的黑点表示表达量无显著差异的基因Ｂｌａｃｋｄｏｔｓｂｅｌｏｗｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｄａｓｈｅｄｌｉｎｅａｎｄｂｅｔｗｅｅｎｖｅｒｔｉｃａｌｄａｓｈｅｄｌｉｎｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｇｅｎｅｓｗｉｔｈｏｕｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌ．图１㊀千里光茎和叶中差异表达基因的火山图（以茎中差异表达基因的表达量为准）Ｆｉｇ．１㊀ＶｏｌｃａｎｏｐｌｏｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｏｆＳｅｎｅｃｉｏｓｃａｎｄｅｎｓＢｕｃｈ．⁃Ｈａｍ．ｅｘＤ．Ｄｏｎ（ｔａｋｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｓｔｅｍａｓｓｔａｎｄａｒｄ）ＧＯ功能分类结果表明：这些差异表达基因的功能被分成生物过程（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓ）㊁细胞组分（ｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）和分子功能（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ）３个大类，并被细分成５３个亚类（表１）㊂在生物过程大类中，被注释为代谢过程（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ）㊁细胞过程（ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓ）和单一生物过程（ｓｉｎｇｌｅ⁃ｏｒｇａｎｉｓｍｐｒｏｃｅｓｓ）的全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ和差异表达基因数量明显高于其他生物过程；在细胞组分大类中，被注释为细胞（ｃｅｌｌ）㊁细胞成分（ｃｅｌｌｐａｒｔ）㊁细胞器（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）㊁细胞膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）㊁细胞器成分（ｏｒｇａｎｅｌｌｅｐａｒｔ）和细胞膜成分（ｍｅｍｂｒａｎｅｐａｒｔ）的全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ和差异表达基因数量亦较高；在分子功能大类中，被注释为催化活性（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）和结合（ｂｉｎｄｉｎｇ）的全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ和差异表达基因数量也明显高于其他分子功能㊂值得注意的是，全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ和差异表达基因ＧＯ功能分类的富集趋势并不完全相同㊂根据千里光茎和叶中全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ和差异表达基因的ｔｏｐＧＯ前１０位分类统计结果（表２），被注释２１３１第１期谢㊀欣，等：千里光茎和叶的差异表达基因分析表１㊀千里光茎和叶中全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ和差异表达基因的ＧＯ功能分类Ｔａｂｌｅ１㊀ＧＯｆｕｎｃｔｉｏｎｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｌｌｕｎｉｇｅｎｅｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｏｆＳｅｎｅｃｉｏｓｃａｎｄｅｎｓＢｕｃｈ．⁃Ｈａｍ．ｅｘＤ．Ｄｏｎ㊀１）Ｎ１：全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ数量Ｎｕｍｂｅｒｏｆａｌｌｕｎｉｇｅｎｅｓ；Ｎ２：差异表达基因数量Ｎｕｍｂｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ．表２㊀千里光茎和叶中全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ和差异表达基因的ｔｏｐＧＯ前１０位分类统计结果Ｔａｂｌｅ２㊀ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅｔｏｐｔｅｎｏｆｔｏｐＧＯｏｆａｌｌｕｎｉｇｅｎｅｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｏｆＳｅｎｅｃｉｏｓｃａｎｄｅｎｓＢｕｃｈ．⁃Ｈａｍ．ｅｘＤ．Ｄｏｎ编号ＩＤＧＯ功能分类ＧＯｆｕｎｃｔｉｏｎｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎＮ１Ｎ２ＧＯ：００４４７６３单生物细胞过程Ｓｉｎｇｌｅ⁃ｏｒｇａｎｉｓｍｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓ２６３３９３４８１ＧＯ：００４４２３７细胞代谢过程Ｃｅｌｌｕｌａｒｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ３２２４２４０９５ＧＯ：００４４７１０单一生物代谢过程Ｓｉｎｇｌｅ⁃ｏｒｇａｎｉｓｍｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ２３０１４３３８８ＧＯ：００４４６９９单一生物过程Ｓｉｎｇｌｅ⁃ｏｒｇａｎｉｓｍｐｒｏｃｅｓｓ３３２５９４４６５ＧＯ：０００９９８７细胞过程Ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓ３８７６１４８８５ＧＯ：００４４２３８初级代谢过程Ｐｒｉｍａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ３１８６０３９２２ＧＯ：００４３１７０大分子代谢过程Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ２１６７６２４５３ＧＯ：００７１７０４有机物代谢过程Ｏｒｇａｎｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ３３４９９４３０８ＧＯ：０００８１５２代谢过程Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ３９７９３５３３５ＧＯ：０００８１５０生物过程Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓ４９４１７６４３６㊀１）Ｎ１：全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ数量Ｎｕｍｂｅｒｏｆａｌｌｕｎｉｇｅｎｅｓ；Ｎ２：差异表达基因数量Ｎｕｍｂｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ．植物资源与环境学报第２８卷㊀为单生物细胞过程（ｓｉｎｇｌｅ⁃ｏｒｇａｎｉｓｍｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓ，ＧＯ：００４４７６３）㊁细胞代谢过程（ｃｅｌｌｕｌａｒｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ，ＧＯ：００４４２３７）以及大分子代谢过程（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ，ＧＯ：００４３１７０）等１０个功能的全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ和差异基因数均较高，其中，被注释为生物过程（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓ，ＧＯ：０００８１５０）的全部ｕｎｉｇｅｎｅｓ和差异表达基因的数量最多㊂图中数据为差异表达基因数量Ｄａｔａｉｎｔｈｅｄｉａｇｒａｍｉｎｄｉｃａｔｅｎｕｍｂｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ．Ａ：细胞过程Ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓ；Ｂ：环境信息处理Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ；Ｃ：遗传信息处理Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ；Ｄ：代谢Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；Ｅ：生物体系Ｏｒｇａｎｉｓｍｓｙｓｔｅｍ．图２㊀千里光茎和叶中差异表达基因的ＫＥＧＧ代谢通路分析Ｆｉｇ．２㊀ＡｎａｌｙｓｉｓｏｎＫＥＧＧｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｏｆＳｅｎｅｃｉｏｓｃａｎｄｅｎｓＢｕｃｈ．⁃Ｈａｍ．ｅｘＤ．Ｄｏｎ总体来看，这些差异表达基因与信号传导途径㊁次生代谢过程㊁细胞组分合成和酶催化活性等功能密切相关㊂２ ３ ２㊀ＫＥＧＧ代谢通路分析㊀千里光茎和叶中差异表达基因的ＫＥＧＧ代谢通路分析结果（图２）表明：共有４５２７个差异表达基因，涉及５０个代谢通路，且大部分代谢通路属于代谢途径㊂其中，碳代谢途径的差异表达基因数量最多（３５２），占该通路差异表达基因总数的７ ７８％；其次为氨基酸生物合成途径，共有３２２个差异表达基因，占该通路差异表达基因总数的７ １１％；淀粉和蔗糖代谢途径的差异表达基因数量也较多（２１１），占该通路差异表达基因总数的４ ６６％；而柠檬酸循环（ＴＣＡ循环）途径的差异表达基因数量４１第１期谢㊀欣，等：千里光茎和叶的差异表达基因分析最少（３３），占该通路差异表达基因总数的０ ７３％㊂３㊀讨论和结论由于药用植物各部位的药用成分含量和种类不同［１３］，因此，研究药用植物各器官基因的转录水平既利于阐明植物的器官分化基因，也利于深入分析药用成分积累的次生代谢途径及调控网络［１４－１６］㊂本研究从千里光茎和叶的ｃＤＮＡ文库中分别获得２６１４７０１６和２６９９６１１９个ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ，Ｑ３０值分别为９５ １７％和９４ ７４％，说明其转录组测序结果良好㊂千里光的茎中含有大量的木质素，木质素对维持较高的硬度及承托全株重量具有重要作用［１７］，而叶是植物合成及储存营养物质（如淀粉和蔗糖等）的主要场所［１８］㊂本研究从千里光茎和叶中共筛选到１０９９１个差异表达基因，以茎中差异表达基因的表达量为准，叶中上调和下调的差异表达基因分别有５５４２和５４４９个；茎和叶中共有７６８３个差异表达基因被ＧＯ功能注释成生物过程㊁细胞组成和分子功能３个大类５３个亚类，且这些差异表达基因与信号传导途径㊁次生代谢过程㊁细胞组分合成和酶催化活性等密切相关㊂ＫＥＧＧ代谢通路分析结果显示：千里光茎和叶中有４５２７个差异表达基因，共涉及５０个代谢通路，大部分差异表达基因参与碳代谢㊁氨基酸生物合成及淀粉和蔗糖代谢，说明这些差异表达基因与细胞组分合成和体内的生物合成等密切相关，其中，参与碳代谢和氨基酸合成的差异表达基因较多，据此推测千里光茎和叶的器官分化需要积累大量的多糖和蛋白质㊂千里光还含有丰富的次生代谢产物，包括生物碱类㊁酚酸类㊁黄酮类㊁挥发油类和萜类等［９］，其中，类黄酮是千里光的主要抗菌成分之一［１９］，而供试植株ＳＣ－３２具有强抗菌性［４］，本研究发现参与类黄酮合成的差异表达基因有４４个，说明这些差异表达基因主要参与千里光体内类黄酮的合成㊂据此认为，参与千里光茎和叶中类黄酮合成的差异表达基因可能在佐证类黄酮是千里光重要抗菌成分及千里光抗菌数量性状等方面具有重要作用㊂综上所述，千里光茎和叶的差异表达基因具有器官特异性，其茎和叶的分化和形成与多糖和蛋白质积累密切相关㊂参考文献：［１］㊀祁云霞，刘永斌，荣威恒．转录组研究新技术：ＲＮＡ－Ｓｅｑ及其应用［Ｊ］．遗传，２０１１，３３（１１）：１１９１－１２０２．［２］㊀邹承武，宋㊀玮，宋慈安，等．基于ＲＮＡ－Ｓｅｑ技术分析在金属矿上部生长的芒萁的差异表达基因［Ｊ］．植物资源与环境学报，２０１７，２６（２）：１－９．［３］㊀江香梅，伍艳芳，肖复明，等．樟树５种化学类型叶片转录组分析［Ｊ］．遗传，２０１４，３６（１）：５８－６８．［４］㊀钱㊀刚，敖弟书，段鹏敏，等．千里光抗菌作用的数量性状分析［Ｊ］．武汉植物学研究，２０１０，２８（１）：６７－７１．［５］㊀李㊀穆，程志远，石㊀莹，等．基于ＲＮＡ－Ｓｅｑ技术的甘蔗参考转录组建立及分析［Ｊ］．分子植物育种，２０１５，１３（２）：３５５－３６０．［６］㊀ＷＡＮＧＸ，ＹＡＮＧＺ，ＷＡＮＧＭ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＢＲＡＮＣＨＩＮＧＥＮＺＹＭＥ１ｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｉｎｇａｇｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｆａｍｉｌｙ１３ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｉｎｖｉｔｒｏｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ，２０１４，１１７：２７９－２９１．［７］㊀王兴春，杨致荣，张树伟，等．拟南芥不定芽发生早期的数字基因表达谱分析［Ｊ］．生物工程学报，２０１３，２９（２）：１８９－２０２．［８］㊀ＭＡＧＢＡＮＵＡＺＶ，ＡＲＩＣＫⅡＭ，ＢＵＺＡＴ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｉｃｅ⁃Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｇｌｕｍａｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ，２０１４，１５：７５５．［９］㊀徐定平，周鑫堂，郜红利，等．千里光化学成分和药理作用研究进展［Ｊ］．中国药师，２０１４，１７（９）：１５６２－１５６５．［１０］㊀李㊀燕，韩忠耀，魏学军．不同采收期和部位黔产千里光中总黄酮㊁绿原酸和金丝桃苷含量动态比较［Ｊ］．天津中医药大学学报，２０１８，３７（２）：１５５－１６０．［１１］㊀ＡＮＤＥＲＳＳ，ＨＵＢＥＲＷ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｕｎｔｄａｔａ［Ｊ］．ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１１：Ｒ１０６．［１２］㊀ＹＥＪ，ＦＡＮＧＬ，ＺＨＥＮＧＨ，ｅｔａｌ．ＷＥＧＯ：ａｗｅｂｔｏｏｌｆｏｒｐｌｏｔｔｉｎｇＧＯａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００６，３４：２９３－２９７．［１３］㊀王梦夏，郭方遒，孙㊀琼，等．高效液相色谱法结合化学计量学测定千里光中四种活性成分的含量［Ｊ］．分析科学学报，２０１４，３０（２）：２１９－２２２．［１４］㊀吴㊀琼．三种产萜类药用植物转录组分析和产地适宜性研究［Ｄ］．北京：中国医学科学院，２０１０：３５－５１．［１５］㊀赵振宇，王仕玉，郭凤根，等．转录组测序及其在药用植物上的应用［Ｊ］．基因组学与应用生物学，２０１７，３６（２）：８２０－８２５．［１６］㊀梁㊀烨，陈双燕，刘公社．新一代测序技术在植物转录组研究中的应用［Ｊ］．遗传，２０１１，３３（１２）：１３１７－１３２６．［１７］㊀肖玉菲，袁剑英，刘海龙，等．桉树４个无性系茎部差异分析［Ｊ］．中南林业科技大学学报，２０１７，３７（１０）：６１－６６．［１８］㊀夏叔芳，于新建，张振清．叶片光合产物输出的抑制与淀粉和蔗糖的积累［Ｊ］．植物生理学报，１９８１，７（２）：４９－５６．［１９］㊀张文平，刘志春，张文书，等．千里光对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌生物合成的影响［Ｊ］．广东医学，２００９，３０（１１）：１６３４－１６３５．（责任编辑：佟金凤）５１。

qpcr数据分析结果导言qPCR（定量聚合酶链反应）是一种常用的基因表达分析技术，能够对给定的基因在样本中的表达进行定量分析。

在生物医学研究中，qPCR数据的分析和解读是非常重要的环节。

本文将针对qPCR数据的分析结果进行解读和讨论。

数据分析结果根据实验设计和操作规程，我们成功地进行了qPCR实验，获得了一系列的数据。

在数据分析过程中，我们首先对数据进行了计算和标准化，然后进行了差异表达分析和功能分析。

数据计算和标准化为了得到准确的表达量数据，我们对原始的实时荧光定量数据进行了计算和标准化处理。

首先，我们根据标准曲线测定了每个样本的实际拷贝数。

然后，我们使用内参基因对不同样本之间的扩增效率进行了标准化，以消除扩增效率的差异对结果的影响。

最后，我们计算得到了每个样本中目标基因的表达量。

差异表达分析为了寻找在不同样本之间的基因表达差异，我们对标准化后的表达量数据进行了差异表达分析。

我们使用了统计学方法来确定哪些基因在样本之间存在显著差异的表达水平。

通过设定一定的差异倍数和显著性水平的阈值，我们筛选出了差异表达的基因。

功能分析为了进一步理解差异表达基因的功能和相关生物学过程，我们进行了功能分析。

我们使用了多种公共数据库和生物信息学工具，对差异表达基因进行了注释和富集分析。

通过比较基因表达谱与已知的功能数据库，我们能够了解基因在不同生物学过程中所扮演的角色，并确定潜在的生物学通路和相关的调控因子。

结论和讨论通过对qPCR数据的分析，我们得到了基因在样本中的表达量数据，并发现了一些差异表达的基因。

进一步的功能分析结果表明，这些差异表达基因可能与特定的生物学过程和通路相关联。

这些结果为我们进一步的研究提供了重要的线索和方向。

在未来的研究中，我们可以进一步验证这些差异表达基因的生物学意义，并探索它们在疾病发展和治疗中的潜在作用。

此外，结合其他的实验和数据分析技术，我们可以建立更加全面和准确的基因表达模型，以更好地理解基因的调控网络。

热带作物学报2021, 42(11): 3134 3145 Chinese Journal of Tropical Crops收稿日期 2021-07-02；修回日期 2021-08-18基金项目 海南省重大科技专项（No. ZDKJ202002）；中国热带农业科学院院级创新团队项目（No. 1630052017014）；海南省院士团队创新中心项目。

作者简介 赵国文（1994—），女，硕士研究生，研究方向：果树。

*共同贡献作者：贾瑞宗（1980—），男，博士，助理研究员，研究方向：基因工程、生物安全等。

**通信作者（Corresponding author ）：郭安平（GUO Anping ），E-mail ：**************。

红心火龙果不同发育时期果肉呈色相关基因表达模式研究赵国文1,2,3，贾瑞宗2,3*，郭静远2,3，郭安平2,3**1. 海南大学园艺学院，海南海口 570228；2. 海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室/中国热带农业科学院热带生物技术研究所 海南海口 571101；3. 中国热带农业科学院三亚研究院 海南三亚 572024摘 要：火龙果属于仙人掌科量天尺属，是具有重要经济和营养价值的热带水果之一，其果实富含花青素和甜菜红素。

在果实成熟后期甜菜红素的大量积累引起红心火龙果果实转色的现象。

果肉色泽是评价火龙果果实品质的重要指标之一，然而其果实转色背后的基因表达调控模式并不清晰。

深入研究火龙果果实发育过程中果肉颜色调控的分子机理有助于丰富火龙果品质形成的理论基础。

本研究以‘美红一号’红心火龙果为实验材料，采集果实发育过程中9个不同时期的样品，通过比较转录组学共识别了96种差异表达的基因，最后分析发现15个与色素代谢通路相关的基因在果实发育不同阶段显著差异表达。

GO 功能富集分析发现差异表达基因主要富集在与结合活性、催化活性、转运活性和结构分子活性相关的功能分类上，且与色素代谢都有重要联系；KEGG 代谢途径富集结果显示，次生代谢物合成途径、氨基酸和核酸代谢途径、酪氨酸代谢途径富集基因较多。

[19]Zhou BY ,Zhang L,Li Y ,et al.Effects of estrogen on motor functionand GAP -43expression in rats with spinal cord injury [J].Hainan Medical Journal,2023,33(7):919-923.周邦瑜,张磊,李颖,等.雌激素对脊髓损伤大鼠运动功能及GAP-43表达的影响[J].海南医学,2023,34(7):919-923.[20]Wang JY ,Yin J,Liu JC,et al.Effect of iridoid-rich fraction from Vale-riana jatamansi jones on neuron pyroptosis in rats with acute spinal cord injury [J].Chinese Journal of Rehabilitation Theory and Prac-tice,2021,27(6):653-660.王静怡,尹杰,刘建成,等.蜘蛛香环烯醚萜类成分对急性脊髓损伤大鼠神经细胞焦亡的影响[J].中国康复理论与实践,2021,27(6):653-660.[21]Mortezaee K,Khanlarkhani N,Beyer C,et al.Inflammasome:its rolein traumatic brain and spinal cord injury [J].J Cell Physiol,2018,233(7):5160-5169.[22]Wang K,Sun Z,Ru J,et al.Ablation of GSDMD improves outcomeof ischemic stroke through blocking canonical and non-canonical in-flammasomes dependent pyroptosis in microglia [J].Front Neurol,2020,11:577927.[23]Gu L,Sun M,Li R,et al.Activation of RKIP binding ASC attenuatesneuronal pyroptosis and brain injury via Caspase -1/GSDMD signal-ing pathway after intracerebral hemorrhage in mice [J].Transl Stroke Res,2022,13(6):1037-1054.(收稿日期：2023-10-02)基于生物信息学分析溃疡性结肠炎的差异表达基因和miRNA王利可1,2，陈世锔3*，梁莉4，吉木彝乌5，符晓倩6，裴华11.海南医学院第二附属医院检验科，海南海口570311；2.郏县人民医院，河南平顶山467100；3.海南医学院研究生院，海南海口571199；4.海南医学院第一临床学院，海南海口571199；5.海南医学院第二临床学院，海南海口571199；6.海南医学院全科医学与继续教育学院，海南海口571199【摘要】目的通过生物信息学分析方法寻找溃疡性结肠炎(UC)的差异表达基因(DEGs)及其相应的microRNA (miRNA)，筛选参与UC 发生发展相关的潜在致病靶点，为寻找UC 诊断标志物以及新的治疗靶点提供理论依据。

差异基因padj数值bh法
差异基因（Differentially expressed genes）是指在不同的生物样本中表达量有显著差异的基因，是表观遗传学研究的重要内容。

生物信息学在差异基因分析中发挥了重要作用，常用的统计方法有T检验、方差分析和ANOVA等，但由于其针对每个基因进行单独的检验，得到的显著性差异基因数较多，多数不具有生物学意义，为了得到真正的差异基因，需要进行多重检验校正。

多重检验校正是指在多次检验一个或多个假设时，控制假阳性率的方法。

常用的方法有Bonferroni、False Discovery Rate（FDR）和Benjamini-Hochberg（BH）等。

BH法是目前广泛使用的多重比较校正方法之一，其原理是针对所有检验的p值按大小排序，计算每个p值与该p值及之后的所有p值在排序中所占比例，与事先设定的统计学显著性水平进行比较得到一个阈值，使得所有比该阈值小的p值被判定为显著性差异。

在差异基因分析中，与BH法相关的指标是p.adjust值和padj值。

p.adjust值是原始p值经过BH校正得到的调整后的p值，用于在所有检验中识别显著性差异基因。

padj值在p.adjust值的基础上通过对比设定的阈值划分为显著性和非显著性，通常以0.05作为显著性水平，表示差异基因的可靠性和生物学意义。

BH法的优点在于它比Bonferroni方法更灵敏，能够更好地识别显著性差异基因，尤其适用于大规模高通量数据分析。

但也需要注意的是，多重检验校正方法并不能完全消除假阳性误差，只能控制其发生的概率，因此在差异基因分析中，需要结合生物学背景知识和实验证实来验证筛选出来的差异基因的可靠性和生物学意义，以尽可能减少假阳性和假阴性误判的风险。

山西农业科学 2024，52（2）：65-77Journal of Shanxi Agricultural Sciences抗感菜豆品种对菜豆普通花叶病毒侵染后的转录组分析牛静雅，唐慕宁，王新华，霍思凡，武文艳，梁兴瑞，黄欣琪，王古悦，冯雪（山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷 030801）摘要：菜豆普通花叶病毒（BCMV ）在世界范围内分布广泛并可造成菜豆严重减产。

菜豆是BCMV 的主要寄主，不同遗传背景的菜豆对BCMV 侵染的响应存在显著差异，目前菜豆抗性基因功能及BCMV 的致病机制鲜有报道。

为了为菜豆抗性基因功能的研究以及分子抗病育种提供相关依据，利用转录组测序（RNA sequencing ）技术对BCMV （C54株系）侵染感性及不同抗性的菜豆品种材料进行转录组测序，对所得数据筛选差异表达基因并进行Gene Ontology （GO ）、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG ）富集以及进行Weighted correla‑tion network analysis （WGCNA ）分析。

结果发现，不同的菜豆品种中病毒的积累量、差异表达基因的定位及一些关键通路对病毒侵染的响应存在共性和差异（如昼夜节律、光合作用、植物-病原体的相互作用和一些代谢途径相关通路等）。

在接种叶上，Dubbele witte 品种（DW ，对BCMV 侵染易感）与Redland ’s greenleaf C 品种（RGLC ，对BCMV 侵染具有抗性）差异表达的基因类型上更为相似，定位于光合体系，在光合作用、光合作用-天线蛋白以及光合生物中的碳固定等通路富集，而Sanilac （对BCMV 侵染具有抗性）的差异基因没有在光合作用等通路富集。

在系统叶上，2个抗性品种中的差异表达基因类型也有差异。

植物被病毒侵染后会干扰植物激素的合成与信号转导通路。

通过选取8个关键的植物激素合成或信号转导相关基因进行验证，转录组和qPCR 数据结果表明，不同的植物激素合成或信号转导相关基因在BCMV 侵染菜豆后的表达情况存在差异：BCMV 侵染促进了参与水杨酸、茉莉酸和赤霉素合成通路的关键基因的正向调控；乙烯、油菜素内酯以及脱落酸相关的基因在抗感品种中的表达变化趋势不相同。

食管鳞状细胞癌差异表达基因的生物信息学分析满　君１，张晓梅２，宋龙飞３Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒ ｃｉｎｏｍａＭａｎＪｕｎ１，ＺｈａｎｇＸｉａｏｍｅｉ２，ＳｏｎｇＬｏｎｇｆｅｉ３１ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２９，Ｃｈｉｎａ；２ＤｏｎｇｆａｎｇＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００７８，Ｃｈｉｎａ；３ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＷｅｉｆａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＳｈａｎｄｏｎｇＷｅｉｆａｎｇ２６１０３１，Ｃｈｉｎａ．【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔａｒｇｅｔｓｆｏｒｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＳＣＣ），ｗｅｅｘｃａｖａｔｅｄｔｈｅｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｏｆＥＳＣＣｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＷｅｄｏｗｎｌｏａｄｅｄｇｅｎｅｄａｔａｓｅｔｓＧＳＥ１００９４２ａｎｄＧＳＥ１７３５１ｆｒｏｍｔｈｅＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）ｄａｔａｂａｓｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ（ＤＥＧｓ）ｂｙＧＥＯ２Ｒａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｓ．ＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆＧＯａｎｄＫＥＧＧｐａｔｈｗａｙｓｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅＤＡＶＩＤｄａｔａｂａｓｅ．ＴｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｎｅｔｗｏｒｋａｎｄｋｅｙｇｅｎｅｍｏｄｕｌｅｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙＣｙｔｏｓｃａｐｅｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄＳＴＲＩＮＧｄａｔａｂａｓｅ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｗｅｒｅｅｘｃａｖａｔｅｄ．ＴｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓａｎｄＥＳＣＣｗａｓｆｕｒｔｈｅｒｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｃｌｉｎｉｃａｌｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍＯＮＣＯＭＩＮＥａｎｄＵＣＳＣｄａｔａｂａｓｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：８０ＤＥＧｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅＤＥＧｓｗｅｒｅｍａｉｎｌｙｅｎｒｉｃｈｅｄｉｎｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎ，ｃｏｌｌａｇｅｎｆｉｂｒｉｌｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｍｉｔｏｔｉｃｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ，ｓｐｉｎｄｌｅａｎｄｍｉｄｂｏｄｙ．Ａｔｏｔａｌｏｆ１１ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｗｅｒｅｅｘｃａｖａｔｅｄ．ＡｌｌｏｆｗｈｉｃｈｗｅｒｅｐｒｏｖｅｄｔｏｂｅｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｃｌｉｎｉｃａｌＥＳＣＣｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｍ，ｔｈｅ７ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｏｆＮＵＳＡＰ１，ＫＩＦ２０Ａ，ＤＥＰＤＣ１，ＴＴＫ，ＣＣＮＢ１，ＮＣＡＰＧａｎｄＡＵＲＫＡｈａｖｅｎｏｔｂｅｅｎｓｔｕｄｉｅｄｉｎＥＳＣＣ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＳｅｖｅｎｎｅｗｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏＥＳＣＣｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍａｙｂｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔａｒｇｅｔｓｆｏｒｆｕｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｎＥＳＣＣｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ，ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｎｅｔｗｏｒｋ，ＫＥＧＧａｎｄＧＯｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｅｓ，ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２０，２８（１２）：２０３１－２０３８【摘要】　目的：应用生物信息学方法挖掘食管鳞状细胞癌（ＥＳＣＣ）的相关基因，探讨其发病机制，为ＥＳＣＣ诊断和靶向治疗提供依据。

第 49 卷第 6 期2023年 11 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.6Nov.2023DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230612基于GEO和TCGA数据库对肺腺癌差异表达基因的生物信息学分析叶汇, 孙哲, 周丽婷, 齐雯, 叶琳（吉林大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生教研室，吉林长春130021）［摘要］目的目的：采用生物信息学方法筛选影响肺腺癌（LUAD）的关键基因，分析其生物学功能及其对LUAD预后的影响。

方法方法：于高通量基因表达（GEO）数据库下载GSE118370和GSE136043芯片数据，癌症基因组图谱（TCGA）数据库筛选LUAD相关数据。

采用R软件分析共同表达的差异表达基因（DEGs）。

采用clusterProfile R包对DEGs进行基因本体（GO）功能富集分析，DAVID数据库进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。

采用Cytoscape筛选连接度排名前10位的关键基因，GEPIA数据库和人类蛋白质图谱（HPA）数据库分析正常肺组织和LUAD组织中关键基因mRNA和蛋白表达情况及不同分期LUAD组织中关键基因表达情况。

关键基因免疫浸润分析和生存分析获取关键基因表达与患者生存期的相关关系。

结果：共筛选DEGs 428个。

GO分析，LUAD的DEGs在主要富集于上皮-间质转化（EMT）等生物过程（BP）方面、细胞基部等细胞组分（CC）方面和细胞外基质（ECM）结构形成等分子功能（MF）方面。

KEGG分析，LUAD的DEGs主要富集于细胞因子受体相互作用通路等方面。

筛选DNA拓扑异构酶Ⅱα（TOP2A）、果蝇纺锤体异常基因（ASPM）、细胞周期蛋白B1（CCNB1）、人类细胞分裂周期相关基因8（CDCA8）、含杆状病毒IAP重复序列蛋白5（BIRC5）、苏氨酸激酶（AURKA）、驱动蛋白超家族成员20A（KIF20A）、中心体相关蛋白55（CEP55）、着丝粒蛋白F（CENPF）和微管组织因子（TPX2）为关键基因。

一种颠倒进食节律的新的肥胖小鼠模型建立方法*陈嘉瑶1， 李婷1， 李欣1， 康栩倩1， 林冬莹1， 徐洁华2， 王桂香1， 臧林泉1△［1广东药科大学，广东 广州 510006；2东玄德（广州）健康管理科技有限公司，广东 广州 510030］［摘要］ 目的：建立一种成本较低、用时较短的肥胖小鼠模型。

方法：雄性昆明小鼠以丙硫氧嘧啶（14.4mg/kg ）生理盐水溶液腹腔注射，颠倒小鼠进食节律，记录摄食饮水量。

连续造模9周，以体重、Lee 指数、体脂率、皮下脂肪占总脂肪比例和口服葡萄糖耐量实验结果为检测指标；采用酶联免疫吸附测定检测血清甘油三酯（TG ）、总胆固醇（TC ）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL -C ）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL -C ）水平；对小鼠肝脏进行HE 染色和油红O 染色观察组织形态学及脂滴分布。

取小鼠肝脏进行转录组分析以找到该模型的差异表达基因及最显著表达通路。

结果：该方法成功使模型组小鼠的体重、Lee 指数和体脂率均显著增加（P <0.01），而皮下脂肪占总脂肪比例显著减少（P <0.01）。

与对照组相比，模型组小鼠的TG 含量显著增加（P <0.01），TC 和LDL -C 含量显著增加（P <0.05），HDL -C 含量显著减少（P <0.05）。

HE 染色结果显示，模型组小鼠肝脏中央静脉放射状纹理消失，出现核皱缩、细胞肿大、肝细胞内出现脂肪滴并发生气球样病变的情况。

油红O 染色结果显示，模型组小鼠肝细胞内出现密集的橘红色油滴。

KEGG 功能富集结果显示，模型组小鼠肝脏内的差异表达基因显著富集在昼夜节律调节通路，显著性排名12，排名第1的是过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR ）信号通路。

该通路下，差异基因主要富集在以PPARα为核心的脂肪细胞因子信号通路，有7个基因表达上调，11个基因表达下调。

结论：该造模方法可能通过抑制PPARα调节脂代谢的相关信号通路，在9周内快速建立肥胖小鼠模型。

第 50 卷第 2 期2024年 3 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.50 No.2Mar.2024DOI：10.13481/j.1671‐587X.20240214基于重症支气管哮喘差异表达基因及其治疗中药筛选的生物信息学分析陈丽平1,2, 韩立1, 卞华1, 庞立业1（1. 南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室，河南南阳473004；2. 河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南郑州450046）［摘要］目的目的：通过生物信息学方法探讨重症支气管哮喘［简称重症哮喘（SA）］的差异表达基因，分析其作用机制，并筛选潜在具有治疗作用的中药及活性成分。

方法：在高通量基因表达（GEO）数据库中选取GSE136587和GSE158752数据集，利用R软件对数据集进行差异分析获得差异表达基因，并进行蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析，筛选核心基因，寻找关键通路和枢纽基因。

最后将核心基因提交至Coremine数据库筛选具有潜在治疗作用的中药，并通过《中华医典》检索相关中药方剂。

结果结果：共筛选出466个差异表达基因。

通过STRING平台构建PPI网络共筛选包括25 kDa 突触关联蛋白（SNAP25）、谷氨酸离子型受体2（GRIA2）、轴突蛋白1（NRXN1）、钾电压门控通道亚家族A成员1（KCNA1）、突触囊泡蛋白 1（SYT1）和嗜铬蛋白A（CHGA）等核心靶点25个。

基因本体（GO）功能富集显示SA的生物学过程与细胞趋化性和白细胞迁移等有重要关系，京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集的通路主要涉及骨髓白细胞迁移、白细胞趋化性、细胞趋化性、白细胞迁移、对外部刺激反应的正向调节和骨髓白细胞活化等信号通路。

采用网络药理学方法基于核心靶点筛选得到具有潜在治疗SA作用的中药367种，其中人参、水牛角、全蝎和黄芪等中药涉及多个核心靶点，与SA具有高度相关性，在《中华医典》中检索具有高度相关性的中药，共得到17个潜在具有治疗效果的中药方剂。

doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2020.19.0743·临床研究·胰腺癌诊断和预后关键生物标志物的筛选鉴定和综合分析柳兴源1，李菁媛2，杨静1Identification and Integrated Analysis of Key Biomarkers for Diagnosis and Prognosis of Pancreatic AdenocarcinomaLIU Xingyuan 1, LI Jingyuan 2, YANG Jing 11. Basic Medical College, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China;2. Department of Pharmacy, The First Af filiated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, ChinaAbstract: Objective To screen and identify key genes and pathways involved in the progression of pancreatic adenocarcinoma (PAAD) and to perform an integrated analysis. Methods GEO2R was commonly used to screen and identify differentially expressed genes (DEGs) in GSE15471, GSE16515, GSE28735 and GSE62165, and the GO and KEGG pathway analyses were performed with DA VID database. Then a protein-protein interaction (PPI) network was constructed using a STRING database, and Cytoscape and GEPIA were used to identify the Hub genes. Finally, the mRNA levels of these Hub genes were quantitatively analyzed by RT-qPCR. Results We screened 181 uDEGs and 64 dDEGs, and the analysis results indicated that uDEGs and dDEGs were respectively enriched in cell component (CC), biological process (BP) and molecular functional (MF), and they were closely related to multiple signal pathways. Then, the top 25 genes with high degree score in DEGs were selected. And 8 genes could predict the poor prognosis of PAAD. RT-qPCR showed that these genes were differentially expressed in PAAD tissues. Conclusion MMP14, MMP1, MET, PLAU, ITGA2, KRT19, COL12A1 and ITGA3 are the key genes associated with the progress of pancreatic cancer.Key words: Bioinformatics analysis; Differentially expressed genes (DEGs); Pancreatic adenocarcinoma 摘 要：目的 筛选鉴定胰腺癌进展过程的关键基因和途径，并进行综合分析。

基因组学与应用生物学,2020年，第39卷，第丨0期，第4797-4802页研宄报告Research Report胃癌前病变分子标志物筛选王俐勇1朱圣韬”1首都医科大学中心实验室，北京，100069;2首都医科大学附属北京友谊医院，北京市消化疾病中心，国家消化系统疾病临床医学研究中心，消 化疾病癌前病变北京市重点实验室，北京，100050* 通信作者，z h u s h e n g t a o@c c m u.e d u.c n摘要本实验旨在研究胃癌前的发生分子机制，通过建立人胃粘膜上皮细胞癌前病变细胞模型，利用高通 量测序技术在转录水平上分析胃癌前病变细胞与正常胃上皮细胞之间差异表达基因的功能及其编码蛋白的 相互作用，筛选出癌前病变相关的关键基因,将多个基因作为分子标记物，并在转录水平上检测这些基因在 胃癌细胞系的表达情况。

同时结合大样本临床数据的生存曲线和这些基因在胃癌组织中蛋白水平分析，推测 这些基因与胃腺癌的生存率密切相关。

研究结果表明这些基因有可能作为胃癌前病变诊疗分子标记物组合，这对于实现胃癌前病变分子分型，建立胃癌前病变早期诊治体系提供理论基础有重要意义。

关键词胃癌前病变，分子标记物，高通量测序，早期诊治Screening of Molecular Markers for Precancerous Lesions of Gastric CancerW a n g Liyong1Zhu Shengtao2*1 C o r e o f F a c i l i t y,C a p i t a l M e d i c a l U n i v e r s i t y,B e i j i n g,100069;2B e i j i n g K e y L a b u r a l u r y f u r P r e c a n c e r o u s L e s i o n s o f D i g e s t i v e D i s e a s e s,N a t i o n a lC e n t e r o f C l i n i c a l M e d i c i n e f o rD i g e s t i v e D i s e a s e s,B e i j i n g F r i e n d s h i p H o s p i t a l,C a p i t a l M e d i c a l U n i v e r s i t y,B e i j i n g C e n t e r o f D i g e s t i v e D i s e a s e s,B e i­j i n g,100050*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r,z h u s h e n g t a o@c c m u.e d u.c nD O I:10.13417/j.g a b.039.004797Abstract The purpose of this study i s to investigate molecular mechanism of precancerous lesions.With the cell model established by h u m a n gastric mucosal epithelial cells,differentially expressed genes between precancerous lesion cells and normal gastric epithelial cells were analyzed at transcriptional level by high-throughput sequencing,including interaction of their coding proteins.The key genes related to precancerous lesion as molecular markers were screened out and expression of these genes in gastric cancer cell lines was detected at the transcriptional level.At the same time,based on survival curve analysis of large sample clinical data and protein levels analysis of these genes in gastric cancer tissue,i t i s speculated that these genes are closely related to the survival rate of gastric adenocarcinoma,and were analyzed.The results showed that these genes m a y be used as molecular markers for the diagnosis and treatment of precancerous lesions,which provides a theoretical basis for the study of molecular typing of precancerous lesions and the establishment of early diagnosis and treatment system of precancerous lesions.Keywords Precancerous lesions of g astric cancer,Molecular marker,High-throughput sequencing,Early diagnosis胃癌(gastric cancer,G C)是威胁人类健康的重要术水平提高，以及化疗、辅助治疗和分子靶向治疗使 癌症之一，在癌症死亡中排在第2位(McClain etal.,预后显著改善，但胃癌患者总生存率并没有显著提 2017)。

doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.10.005乳酸调控小鼠巨噬细胞M2型极化的关键靶点分子筛选①杨颖颖②黄瑾刘新宇邱炜③（贵州医科大学生物与工程学院，贵阳 550000）中图分类号R730.3 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）10-2041-08［摘要］目的：乳酸堆积是肿瘤微环境（TME）呈酸性的主要原因之一，巨噬细胞是TME中的重要免疫细胞。

本研究筛选乳酸调控小鼠腹腔巨噬细胞M2型极化的关键靶点分子，为巨噬细胞相关的肿瘤免疫治疗提供理论依据。

方法：提取小鼠源腹腔巨噬细胞，通过流式细胞术检测F4/80+及CD11b+细胞表达量；将巨噬细胞分为2组，分别用0 mmol/L（对照）、20 mmol/L 乳酸的培养基处理24 h后收集细胞，qPCR法检测巨噬细胞IL-10、Arg-1、VEGF、HIF-1等基因的相对表达量；利用转录组测序技术筛选对照组和20mmol/L乳酸组的差异表达基因（|log2（fold change）|>1），对差异表达基因进行GO及KEGG分析，并利用Cytoscape软件将筛选出的差异表达基因构建互作网络图，根据基因互作节点数筛选出Tpt1及Malat1等关键调控基因。

分别将Tpt1、Malat1两个关键基因的siRNA转染至巨噬细胞，抑制两个基因的表达，利用qPCR法检测转染后巨噬细胞CD11c、Arg-1、VEGF等基因的相对表达量。

结果：获得的小鼠腹腔细胞中F4/80+及CD11b+细胞的表达量均大于90%，表明成功获得高纯度的小鼠腹腔来源巨噬细胞。

与对照组相比，经20 mmol/L乳酸处理后，Arg-1、HIF-1、IL-10和VEGF表达量增加，表明乳酸能促进巨噬细胞的M2型极化。

转录组学研究结果发现，20 mmol/L乳酸处理24 h后使巨噬细胞的6 295个基因表达发生变化，差异表达基因主要参与细菌防御反应、胞质基因翻译、核糖体生物合成、胎盘发育等生物过程；涉及的信号通路包括MAPK、PI3K-Akt、NOD样受体等。

青鱼肠道不同部位形态结构和酶活性差异分析摘要青鱼是我国淡水养殖的四大主要鱼类之一，也是水产养殖的重要物种。

随着集约化养殖的发展，青鱼的养殖环境和健康状态越来越受到人们的关注，同时，肠道健康及功能与其生长发育紧密相关。

因此，在本研究中，我们使用组织学半定量系统对养殖青鱼的健康状况进行了评估，并使用组织学、酶活检测和RNA-seq测序技术对青鱼前肠和后肠在消化吸收和免疫机制上的差异分工进行了研究。

具体的研究结果如下：1. 组织学评估养殖青鱼的健康状况养殖状态下，鱼类的健康状态已经成为人们日益关注的问题。

在本研究中，我们使用Bernet等人提出的组织学半定量系统评估了养殖条件下青鱼的健康状况。

对青鱼的鳃、肝、脾和肠进行固定和脱水并使用标准技术制作组织切片。

根据Zimmerli等人提出的评分方案计算各组织的器官指数，并对组织变化的严重程度进行分类。

结果表明：青鱼的鳃、肝和脾的状况良好，处于Ⅰ级和Ⅱ级变化，肠道是最受影响的器官，达到Ⅲ级变化，在肠的组织学分析中发现肠粘膜上皮细胞增生和固有层易碎和坏死。

青鱼的Fulton状态指数（Fulton’s Conditional factor，CF）介于1.45~2.94之间，均值为1.52；肝体指数（Hepatic somatic index，HSI）介于0.29~0.93之间，均值为0.58，表明被检测的青鱼状态良好。

2.青鱼不同肠段组织结构的差异及消化酶与抗氧化能力的分布研究我们使用组织学和酶活检测的方法分析研究了青鱼不同肠段的组织结构差异及消化酶和抗氧化能力的分布，结果表明青鱼前肠的肠绒毛高度，黏膜厚度，肌层厚度和肠绒毛纵截面积均显著高于后肠（P<0.05），但是，青鱼前肠的隐窝深度和杯状细胞数目显著低于后肠（P<0.05）。

同时，其消化酶和抗氧化能力在青鱼的前肠和后肠中也存在显著的差异，前肠淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活性显著高于后肠（P < 0.05），与消化酶活性的分布不同，后肠中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD ）、谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase，GR）、过氧化氢酶（Catalase，CAT)）活性和总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）含量显著高于前肠（P < 0.05）。

基于生物信息学分析焦亡相关基因在结肠癌预后中的价值①童欣柯亨宁（武汉大学中南医院，武汉 430000）中图分类号R735.3 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）05-1012-06［摘要］目的：采用生物信息学探讨焦亡相关基因在结肠癌患者预后中的价值。

方法：从TCGA和GTEx数据库中提取正常结肠组织和结肠癌组织焦亡相关基因，并进行差异分析。

根据焦亡相关基因表达对TCGA队列中的患者进行聚类及分型，对分型存在差异的基因进行单因素COX分析、lasso回归分析并构建预后模型。

在GSE39582中对该预后模型进行验证。

单因素和多因素COX回归分析风险模型、临床性状与结肠癌患者预后的相关性。

对风险差异表达基因进行GO富集分析、KEGG通路分析和ssGSEA分析。

结果：47个焦亡相关基因在正常组织和结肠癌组织中差异表达（P<0.05）。

预后模型中，患者生存时间与状态、临床分级、病理分期差异显著（P<0.001）。

GO和KEGG分析发现风险差异基因在免疫相关通路显著富集。

ssGSEA分析提示高风险组和低风险组患者免疫细胞浸润和免疫功能存在差异。

结论：焦亡相关基因可评估结肠癌患者预后，且可能调节结肠癌免疫相关通路。

［关键词］结肠癌；焦亡；预后；免疫Value of pyroptosis-related genes in prognosis of colon cancer based on bioinformaticsTONG Xin， KE Hengning. Zhongnan Hospital of Wuhan University， Wuhan 430000， China ［Abstract］Objective：To explore value of pyroptosis-related genes in prognosis of colon cancer patients based on bioinformatics. Methods：Pyroptosis-related genes in normal and colon cancer tissues were clustered from TCGA and GTEx， and differences were ana⁃lyzed. Patients in TCGA cohort were clustered and classified according to expression of pyroptosis-related genes. Univariate COX analy⁃sis and lasso regression analysis were performed on genes with different classifications， and a prognostic model was constructed， which was validated in GSE39582. Univariate and multivariate COX regression analysis were used to analyze correlation between risk models，clinical characteristics and prognosis of colon cancer patients. GO enrichment analysis， KEGG pathway analysis and ssGSEA analysis were performed on risk differentially expressed genes. Results：There were differences in expression of 47 pyroptosis-related genes in normal tissues and colon cancer tissues （P<0.05）. In the risk model， there were significant differences in patient survival time and status， clinical grade， and pathological stage （P<0.001）. GO and KEGG analysis found that risk differential genes were significantly enriched in immune-related pathways. ssGSEA analysis indicated that there were differences in immune cell infiltration and immune function between high-risk group and low-risk group. Conclusion：Pyroptosis-related genes can be used to assess prognosis of colon cancer patients and may regulate immune-related pathways in colon cancer.［Key words］Colon cancer；Pyroptosis；Prognosis；Immunity结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，2021年新发结肠癌病例数在所有肿瘤中位居第三，占全球癌症死亡原因的8%［1］。

中国畜牧兽医 2022,49(8):2855-2868C h i n aA n i m a lH u sb a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i ne 大型迪庆藏猪不同生长阶段肌内脂肪沉积差异表达基因及其调控通路分析聂靖茹1,2,马 黎3,严达伟1,邓 俊4,张 浩2,张 博2,刘金桥1,董新星1(1.云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;2.中国农业大学动物科学技术学院,北京100193;3.云南农业职业技术学院畜牧兽医学院,昆明650212;4.云南省畜牧总站,昆明650224)摘 要:ʌ目的ɔ筛选大型迪庆藏猪不同生长阶段肌内脂肪含量差异的关键基因并分析其调控途径㊂ʌ方法ɔ选择胎次相同㊁出生日期及体重相近的大型迪庆藏猪36头,随机分为3组,在相同条件下进行育肥试验,分别在体重达40㊁80及120k g 左右时屠宰,每组采集3头猪的背最长肌,采用R N A -S e q 技术进行转录组测序,测序数据进行拼接㊁比对和注释,筛选与脂肪沉积相关的差异显著基因进行功能富集㊁S T E M 分析,构建基因互作网络,并进行实时荧光定量P C R 验证㊂ʌ结果ɔ40k g v s 80k g ㊁80k g v s 120k g 与40k g v s 120k g 阶段分别检测到730㊁981及735个基因差异显著表达;S T E M 分析共有4个差异显著模块,模块11㊁14的基因集先显著上调后轻微下调;模块9㊁10的基因集先显著上调后显著下调㊂差异基因互作网络显示,40k g v s 80k g 阶段,E G R 1㊁E G R 2㊁P R K A G 2㊁N O R -1和A T F 3基因位于网络核心,E G R 1和E G R 2基因表达下调,P R K A G 2㊁N O R -1和A T F 3基因表达上调;80k g v s 120k g 阶段,F O X O 1㊁P D K 4㊁P P A R D ㊁P P A RG C -1㊁L I P E ㊁A T F 3和S T A T 1基因位于网络核心,F O X O 1㊁P P A R D ㊁P P A R G C -1基因表达下调,P P A R G 基因通过级联调控引起S T A T 1基因表达下调,L I P E 和A T F 3基因表达上调;40k g v s 120k g 阶段,A T F 3㊁N O R -1㊁E G R 1㊁E G R 2和S T A T 1基因位于网络核心,E G R 1㊁E G R 2和S T A T 1基因表达下调,A T F 3和N O R -1基因表达上调㊂A T F 3㊁F O X O 1等10个基因的实时荧光定量P C R 验证结果与转录组测序结果一致㊂ʌ结论ɔE G R 1㊁F O X O 1等基因作为核心基因参与大型迪庆藏猪肌内脂肪调控,不同生长阶段参与调控的核心基因并不完全相同,结果可丰富中国地方猪肌内脂肪调控基础数据,为大型迪庆藏猪肌内脂肪含量的遗传改良提供参考㊂关键词:大型迪庆藏猪;R N A -S e q;肌内脂肪沉积;差异表达基因;调控途径中图分类号:S 828文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2022.08.002 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2022-02-09基金项目:云南省乡村振兴科技专项(202104B I 090021);云南省高校科技创新团队支持计划(云南省高校高原山地畜禽抗逆性基因发掘与利用科技创新团队)联系方式:聂靖茹,E -m a i l :136********@163.c o m ㊂通信作者马黎,E -m a i l :935936939@q q .c o m ;董新星,E -m a i l :86127447@q q.c o m A n a l y s i s o fD i f f e r e n t i a l l y E x p r e s s e dG e n e s a n dR e g u l a t i o nP a t h w a ys o f I n t r a m u s c u l a r F a tD e p o s i t i o n i nL a r g eD i q i n g T i b e t a nP ig s a tD i f f e r e n tG r o w t hS t a ge s N I EJ i n gr u 1,2,MA L i 3,Y A N D a w e i 1,D E N GJ u n 4,Z H A N G H a o 2,Z H A N GB o 2,L I UJ i n q i a o 1,D O N G X i n x i n g1(1.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,Y u n n a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,K u n m i n g650201,C h i n a ;2.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,C h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,B e i j i n g 100193,C h i n a ;3.D e p a r t m e n t o f A n i m a lH u s b a n d a r y a n dV e t e r i n a r y Me d i c i n e ,Y u n n a nV o c a t i o n a l a n dT e c h n i c a lC o l l e g e of Ag r i c u l t u r e ,K u n m i n g 650212,C h i n a ;4.Y u n n a nA n i m a lH u s b a n d r y S t a t i o n ,K u n m i n g 650224,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h i ss t u d y w a sa i m e d t o s c r e e n t h e k e y ge n e s o ft h e d if f e r e n c e o f中国畜牧兽医49卷i n t r a m u s c u l a r f a t(I M F)c o n t e n to f l a r g eD i q i n g T i b e t a n p i g s(T P s)a td i f f e r e n t g r o w t hs t a g e s a n d a n a l y z e i t s r e g u l a t i o n p a t h w a y.ʌM e t h o dɔT h e r ew e r e t h i r t y-s i xT P sw i t ht h es a m e p a r i t y, d a t e o f b i r t ha n dw e i g h tw e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o t h r e e g r o u p s.T h e f a t t e n i n g t e s tw a s c a r r i e d o u t u n d e rt h es a m ec o n d i t i o n s.T h e y w e r es l a u g h t e r e d w h e nt h e w e i g h tw a sa b o u t40,80a n d 120k g,r e s p e c t i v e l y.T h el o n g i s s i m u s d o r s i m u s c l e(L D)o ft h r e e p i g si n e a c h g r o u p w a s c o l l e c t e d,a n dt h et r a n s c r i p t o m ew a ss e q u e n c e db y R N A-S e q.T h es e q u e n c i n g d a t aw a ss p l i c e d,c o m p a r ed a n da n n o t a te d,t h es i g n if i c a n t l y d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e dg e n e s(D E G s)r e l a t e dt oI M Fd e p o s i t i o n w e r e s c r e e n e d,a n d t h e g e n ei n t e r a c t i o n n e t w o r k w a s c o n s t r u c t e d b y f u n c t i o n a le n r i c h m e n ta n d S T E M a n a l y s i s.T h e r e s u l t s w e r e v e r if i e d b y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R.ʌR e s u l tɔT h e r ew e r e730,981a n d735g e n e sw e r es i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d i n40k g v s 80k g,80k g v s120k g a n d40k g v s120k g s t a g e s,r e s p e c t i v e l y.Th e r e w e r ef o u r m o d u l e s wi t h s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i nS T E M a n a l y s i s.T h e g e n es e t so fm o d u l e s11a n d14w e r es i g n i f i c a n t l y u p-r e g u l a t e d a n d t h e n s l i g h t l y d o w n-r e g u l a t e d.T h e g e n e s e t s o f m o d u l e s9a n d10w e r e s i g n i f i c a n t l y u p-r e g u l a t e d a n dt h e n d o w n-r e g u l a t e d.T h e d i f f e r e n t i a l g e n ei n t e r a c t i o n n e t w o r k s h o w e d t h a ta t40k g v s80k g s t a g e,E G R1,E G R2,P R K A G2,N O R-1a n d A T F3g e n e s w e r e l o c a t e d i n t h e c o r e o f t h e n e t w o r k,E G R1a n d E G R2g e n e sw e r e d o w n-r e g u l a t e d,P R K A G2,N O R-1a n d A T F3g e n e sw e r e u p-r e g u l a t e d.A t80k g v s120k g s t a g e,F O X O1,P D K4,P P A R D,P P A R G C-1, L I P E,A T F3a n d S T A T1g e n e sw e r e l o c a t e d i nt h ec o r eo f t h en e t w o r k,F O X O1,P P A R D a n d P P A R G C-1g e n e sw e r ed o w n-r e g u l a t e d,a n d P P A R G g e n ec a u s e d S T A T1g e n ed o w n-r e g u l a t i o n t h r o u g hc a s c a d e r e g u l a t i o n,L I P E a n d A T F3g e n e sw e r eu p-r e g u l a t e d.A t40k g v s120k g s t a g e, A T F3,N O R-1,E G R1,E G R2a n d S T A T1g e n e sw e r e l o c a t e d i nt h e c o r eo f t h en e t w o r k,E G R1, E G R2a n d S T A T1g e n e sw e r e d o w n-r e g u l a t e d,A T F3a n d N O R-1g e n e sw e r eu p-r e g u l a t e d.R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C Rr e s u l t s o f t e n g e n e s s u c h a s A T F3a n d F O X O1w e r e c o n s i s t e n tw i t hR N A-S e q r e s u l t s.ʌC o n c l u s i o nɔT h i ss t u d y s c r e e n e ds o m e g e n e s l i k e E G R1a n d F O X O1p a r t i c i p a t e i n t h e r e g u l a t i o no f I M F i nT P s a s c o r e g e n e s,w h i c h i n v o l v e d i n r e g u l a t i o na t d i f f e r e n t s t a g e sw e r e n o t e x a c t l y t h es a m e.T h er e s u l t sc o u l de n r i c ht h eb a s i cd a t ao f I M Fr e g u l a t i o n i nl o c a l p i g s i n C h i n a,a n d p r o v i d e a r e f e r e n c e f o r t h e g e n e t i c i m p r o v e m e n t o f I M Fc o n t e n t i nT P s.K e y w o r d s:l a r g eD i q i n g T i b e t a n p i g s;R N A-S e q;i n t r a m u s c u l a r f a td e p o s i t i o n;d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e;r e g u l a t i o n p a t h w a y肌内脂肪(i n t r a m u s c u l a r f a t,I M F)含量是肉质评定的首选指标,影响猪肉的风味㊁嫩度和多汁性[1],筛选调控猪肌内脂肪沉积的功能基因并解析其调控机制,对猪肉品质的遗传改良具有重要意义㊂随着高通量测序技术的发展,一些影响猪脂肪沉积的功能基因和转录调控因子被发现㊂李明洲等[2]研究发现,太湖猪在不同月龄脂肪细胞体积㊁肌内脂肪含量均高于长白猪,且在3月龄后差距逐渐明显; W o o d等[3]研究发现,维生素D受体(v i t a m i n D r e c e p t o r,V D R)通过抑制C C A A T/增强子结合蛋白α(C C A A T/e n h a n c e r b i n d i n g p r o t e i n s a l p h a,C/ E B Pα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r s-a c t i v a t e dr e c e p t o r g a m m a,P P A Rγ)抑制脂肪生成;T a n g等[4]研究发现,转录因子S p1基因是前脂肪细胞向脂肪细胞分化所必需的关键基因;H u a n g等[5]研究发现,X L O C_046142㊁X L O C_ 004398和X L O C_015408可能分别以丝裂原激活蛋白激酶激活蛋白激酶2(MA P K-a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e2,MA P K-A P K2)㊁核受体亚家族1D组成员2(n u c l e a r r e c e p t o r s u b f a m i l y1g r o u p D m e m b e r2, N R1D2)和醛酮还原酶家族1成员C4(a l d o-k e t o r e d u c t a s e f a m i l y1m e m b e rC4,A K R1C4)为靶点,在猪肌内脂肪生成和脂质积累中起重要调节作用; X i n g等[6]研究发现了脂质运载蛋白2(l i p o c a l i n2, L C N2)㊁磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1 (p h o s p h o e n o l p y r u v a t e c a r b o x y k i n a s e1,P C K1)㊁过氧化物酶体增殖激活受体γ辅激活因子1β(p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t i v e a c t i v a t e dr e c e p t o r,g a m m a,c o a c t i v a t o r65828期聂靖茹等:大型迪庆藏猪不同生长阶段肌内脂肪沉积差异表达基因及其调控通路分析1b e t a,P P A R G C1B)㊁腺苷一磷酸脱氨酶1 (a d e n o s i n em o n o p h o s p h a t ed e a m i n a s e1,AM P D1)和线粒体肌酸激酶2(c r e a t i n ek i n a s e,m i t o c h o n d r i a l 2,C KMT2)5个影响脂肪沉积的候选基因;A n a 等[7]研究发现,R e t i n t o伊比利亚猪脂肪酸结合蛋白3(f a t t y a c i db i n d i n gp r o t e i n3,F A B P3)㊁F A B P5㊁长链脂肪酸转运蛋白1(s o l u t ec a r r i e rf a m i l y27 m e m b e r1,S L C27A1)等基因上调能够加速脂肪沉积,T o r b i s c a l伊比利亚猪脂联素(a d i p o n e c t i n,C1Q a n d c o l l a g e nd o m a i n c o n t a i n i n g,A D I P O Q)和肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(c a r n i t i n e p a l m i t o y l t r a n s f e r a s e1A, C P T1A)基因上调会抑制脂肪沉积㊂迪庆藏猪是中国特有的高原型猪种之一,具有沉脂能力强㊁肉质好等特点[8],目前关于迪庆藏猪的研究主要在起源与驯化[9]㊁遗传多样性[10-12]㊁低氧适应[13]㊁肉质[14-16]㊁杂交利用[17]等方面,迪庆藏猪肌内脂肪沉积遗传调控机制尚不明晰㊂本研究采用R N A-S e q技术筛选大型迪庆藏猪不同生长阶段肌内脂肪沉积差异的关键基因并分析其调控途径,以期为大型迪庆藏猪肉品质的遗传改良提供参考㊂1材料与方法1.1试验动物选择胎次相同㊁出生日期及体重相近的纯种大型迪庆藏猪36头,随机分为3组,每组12头,在云南省香格里拉市绿源生态种养专业合作社藏猪养殖基地进行育肥试验,分别在体重达40㊁80㊁120k g左右时屠宰,每组采集3头猪的背最长肌(S1-3L D㊁S2-3L D㊁S3-3L D),液氮速冻运回实验室,-80ħ保存备用㊂1.2主要试剂及仪器动物组织总R N A提取试剂盒㊁反转录-荧光定量试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司㊂N a n o D r o p2000核酸浓度测定仪购自T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c公司;荧光定量P C R仪(F Q D-96A)购自杭州博日科技股份有限公司㊂1.3方法1.3.1 R N A提取和质量检测参考王志秀[18]采用T R I z o l法结合动物组织总R N A提取试剂盒提取背最长肌总R N A,去除r R N A㊂利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提取总R N A的质量,以确定R N A是否存在降解及污染等情况;利用N a n o D r o p 2000测定仪对总R N A的纯度(D260n m/D280n m)进行测定,利用Q u b i t对总R N A进行精确定量,利用A g i l e n t2100核酸分析仪检测R N A的完整性,检测合格的总R N A用于转录组测序㊂1.3.2去核糖体链特异性文库构建及测序从9个检测合格的样本R N A中各取3μg建库,对测序文库进行质检,文库浓度要求不低于1n g/μL,电泳观察构建的文库条带大小在350~450b p;按照c B o t U s e r G u i d e(P a r t#15006165,R e v.F, I l l u m i n a)流程,在I l l u m i n aH i s e q2000测序仪配套的c B o t上完成C l u s t e r的生成和第一向测序引物杂交;按照H i s e q2000U s e rG u i d e(P a r t#15011190_ H,I l l u m i n a)要求备好测序试剂,将携有c l u s t e r的f l o wc e l l上机,按程序进行P a i r e dE n d2ˑ100n t M u l t i p l e x测序,并进行数据的收集和实时数据分析㊂将m R N A进行O l i g o(d T)磁珠富集,反转录合成c D N A文库㊂使用N l aⅢ内切酶产生标签5'-端,该内切酶可识别并切断c D N A上的C A T G位点,利用磁珠纯化带有c D N A3'-端片段,将其5'-端连接到I l l u m i n a接头1上;I l l u m i n a接头1与C A T G位点的结合处是Mm eⅠ内切酶的识别位点,该内切酶可将识别位点与酶切位点分离,酶切位置在C A T G位点下游17b p处,从而产生带有接头1的T a g;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化,利用A g i l e n t2100B i o a n a l y z e r和A B IS t e p O n e P l u s R e a l-t i m eP C RS y s t e m对构建好的文库进行质检,质检合格的文库用I l l u m i n aH i s e q2000上机测序㊂1.3.3测序数据处理及差异表达基因聚类分析对测序获得的原始数据(r a wr e a d s),去除污染和低质量片段后获得过滤后的有效数据(c l e a n r e a d s),采用H I S A T2软件将c l e a nr e a d s与猪的参考基因组(S u s s c r o f a11.1)进行比对,对比对到基因组各染色体上的c l e a nr e a d s进行统计,以l o g2| F o l d C h a n g e|>1且P<0.05作为筛选条件,将片段每百万碱基碎片数(f r a g m e n t s p e r k i l o b a s em i l l i o n, F P KM)值归一化进行差异表达基因分析㊂将3个生长阶段分为3个比较组(S1v s S2:40k g v s80k g; S2v s S3:80k g v s120k g;S1v s S3:40k g v s120k g),对每个比较组的阳性共表达基因聚类分析㊂1.3.4差异表达基因功能富集分析对筛选出的差异表达基因进行G O功能和K E G G通路富集分析,筛选与迪庆藏猪脂肪沉积相关的差异表达基因,按富集度c o u n tȡ2且校正P<0.05作为显著富集基因的阈值㊂1.3.5差异表达基因S T E M分析采用短时间序列表达分析(s h o r t t i m e-s e r i e s e x p r e s s i o nm i n e r, S T E M)对差异表达基因进行趋势分析,数据过滤标7582中国畜牧兽医49卷准为3个时间节点两两比较的组内表达差异倍数在2倍以上且P<0.05,对显著差异表达的模块进行G O功能和K E G G通路富集分析㊂1.3.6差异表达基因互作网络分析利用C y t o s c a p e3.9.1软件挖掘差异表达基因间的互作关系,构建差异表达基因的互作网络㊂1.3.7实时荧光定量P C R 用P r i m e rP r e m i e r 5.0软件设计实时荧光定量P C R引物(表1),利用反转录试剂盒将R N A反转录为c D N A,以G A P DH作为内参基因,采用A B I H T7900定量P C R仪对筛选到的差异表达基因进行实时荧光定量P C R检测㊂P C R扩增体系20μL:2ˑT5F a s t q P C R M i x(S Y B R G r e e nⅠ)10μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各0.8μL,c D N A模板1μL,d d H2O 7.4μL㊂P C R扩增条件:95ħ预变性1m i n;95ħ变性15s,退火15s(退火温度见表1),72ħ延伸30s,共40个循环;循环结束后开始熔解曲线分析: 95ħ5s,60ħ1m i n,温度以0.11ħ/s的速率从60ħ递增到95ħ㊂每个样本设3个重复,根据2-ΔΔC t值计算定量结果㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')退火温度A n n e a l i n gt e m p e r a t u r e/ħ产物长度P r o d u c tl e n g t h/b pG e n B a n k登录号G e n B a n ka c c e s s i o nN o.A T F3F:T G C T A A C C T G A C A C C C T T T G T60238N C_010451.4R:G C A C T C C G T C T T C T C C T T C T TE G R1F:A G T T T G C C A G G A G C G A T G A A6084N C_010444.4R:A G G C C A C A C T T T T G T C T G C TF O X O1F:A AG A G C G T G C C C T A C T T C A A60180N C_010453.5R:C C T G G G G G A T T T C C C A C T C TL I P E F:C A C A A G T C C C G A C C C A A C T T60239N C_010448.4 R:G G T G C A T C C T C A G G T C G A A AN O R-1F:A A T G C C C T T G T C C G A G C T T T60136N C_010443.5 R:T G G A G G C T G T G A G A A G G T T GP D K4F:G C T G G T G A C T G G T G T A T C C C60141N C_010451.4 R:T C A C A C G C A C A C A T T C A G G AP P A R D F:A G A A C C G C A A C A A G T G C C A G61109N C_010449.5 R:A G C T T C C T T T T C T C T G C C T C GP P A R G C-1F:A A C C C A C A G A G A C C C G A A A C60145N C_010450.4 R:C C C T T G G G G T C A T T T G G T G AP R K A G2F:C A T C G G G A C C T A C G A C A A C A6081N C_010460.4 R:C G C C T T T C C A C G A A G A C G T TS T A T1F:T C C G A C A C C T G C A A C T G A A A60151N C_010457.5 R:G G C A G A G A G G T G G T C T C A A GG A P DH F:T C G G A G T G A A C G G A T T T G60219N C_010447.5R:C C T G G A A G A T G G T G A T G G2结果2.1大型迪庆藏猪背最长肌R N A提取质量及测序数据统计用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总R N A质量,样品总R N A的28S和18S条带清晰,28S的亮度约为18S的2倍,质量达到R N A-S e q上机测序的要求㊂由表2可知,每个样品的r a wr e a d s数都在48M b 以上,c l e a n r e a d s比例均超过88%,有效Q30比例均在94%以上,比对率均在95%以上,测序数据符合生物信息学分析要求㊂85828期聂靖茹等:大型迪庆藏猪不同生长阶段肌内脂肪沉积差异表达基因及其调控通路分析表2 R N A -S e q 测序数据统计T a b l e 2 R N A -S e q d a t a s t a t i s t i c s 样品S a m p l e s 原始数据R a wr e a d s /b p 有效数据C l e a n r e a d s /b p 有效数据比例C l e a n r e a d s r a t e/%有效Q 30比例C l e a nQ 30b a s e s r a t e/%比对率M a p p i n g ra t i o /%S 1-1L D 499858864691529693.8694.5996.17S 1-2L D 508196444590462890.3394.3795.94S 1-3L D 484290644422050091.3194.5195.76S 2-1L D 493129684616038693.6194.6996.17S 2-2L D 538149884779656088.8294.8896.17S 2-3L D 512092004798930493.7194.7996.36S 3-1L D 515240764792055693.0194.5596.06S 3-2L D 512190064687473691.5294.5095.50S 3-3L D 493982364597920693.0894.4696.062.2 大型迪庆藏猪背最长肌差异表达基因聚类分析对3个比较组的阳性共表达基因进行聚类发现,每个组内部聚为一类,组间明显分开(图1),可进行后续分析㊂A ,S 1v s S 2;B ,S 2v s S 3;C ,S 1v s S 3㊂图2同A ,S 1v s S 2;B ,S 2v s S 3;C ,S 1v s S 3.T h e s a m e a s f i g .2图1 大型迪庆藏猪背最长肌差异表达基因聚类热图F i g .1 C l u s t e r i n g h e a tm a p o f d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s i n l o n g i s s i m u s d o r s im u s c l e o f l a r g eD i q i n g T i b e t a n p i gs 2.3 不同体重阶段大型迪庆藏猪背最长肌显著差异基因筛选以l o g 2|F o l d C h a n g e |>1且P <0.05为筛选显著差异基因的阈值,S 1v s S 2阶段共筛选到730个基因显著差异表达,其中,上调基因341个,下调基因389个(图2A );S 2v s S 3阶段共筛选到981个基因显著差异表达,其中,530个基因上调,451个基因下调(图2B );S 1v s S 3阶段共筛选到735个基因显著差异表达,其中,364个基因上调,371个基因下调(图2C)㊂2.4 不同体重阶段大型迪庆藏猪背最长肌显著差异表达基因功能富集分析S 1v s S 2阶段,G O 功能分析结果显示,差异表达基因主要富集在凋亡过程调控㊁胰岛素应答㊁脂肪细胞分化等过程(图3A );K E G G 通路分析结果显示,差异表达基因主要富集在F O X O 信号通路㊁脂肪细胞因子信号通路㊁胰岛素抵抗等通路(图3B )㊂S 2v s S 3阶段,G O 功能分析结果显示,差异表达基因主要富集在葡萄糖稳态㊁脂肪垫发育㊁脂肪酸氧化正调控等过程(图3C );K E G G 通路分析结果显示,差异表达基因主要富集在胰岛素信号通路㊁P P A R 信号通路㊁脂肪细胞因子信号通路等(图3D )㊂S 1v s S 3阶段,G O 功能富集分析显示,差异表达基因主要富集在葡萄糖应答㊁脂肪细胞分化㊁能量稳态等过程(图3E );K E G G 通路富集分析显示,差异表达基因主要富集在胰岛素信号通路㊁胰岛素抵抗信号通路等(图3F )㊂9582中 国 畜 牧 兽 医49卷图2 大型迪庆藏猪背最长肌差异表达基因火山图F i g .2 V o l c a n i cm a p o f d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s i n l o n g i s s i m u s d o r s im u s c l e o f l a r g eD i q i n g T i b e t a n p i gs 06828期聂靖茹等:大型迪庆藏猪不同生长阶段肌内脂肪沉积差异表达基因及其调控通路分析A ㊁C ㊁E ,S 1v s S 2㊁S 2v s S 3和S 1v s S 3G O 功能富集图;B ㊁D ㊁F ,S 1v s S 2㊁S 2v s S 3和S 1v s S 3K E G G 通路富集图A ,Ca n dE ,G Of u n c t i o ne n r i c h m e n t h i s t o g r a m so fS 1v s S 2,S 2v s S 3a n dS 1v s S 3,r e s p e c t i v e l y ;B ,Da n dF ,K E G G p a t h w a y e n r i c h m e n t h i s t o g r a m s o f S 1v s S 2,S 2v s S 3a n dS 1v s S 3,r e s p e c t i v e l y图3 大型迪庆藏猪背最长肌差异表达基因G O 功能和K E G G 通路富集分析图F i g .3G Of u n c t i o na n dK E G G p a t h w a y e n r i c h m e n th i s t o g r a m so fd i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s i nl o n g i s s i m u sd o r s im u s c l eo f l a r g eD i q i n g T i b e t a n p i gs 2.5 大型迪庆藏猪背最长肌差异表达基因S T E M 分析对筛选到的显著差异表达基因进行S T E M 分析,共有4个差异显著模块(图4),模块11和14的差异表达基因聚为一类,先表达上调后呈现轻微表达下调;模块9和10的差异表达基因聚为一类,先表达上调后表达下调;其余模块差异不显著㊂模块11和14的基因集G O 功能分析显示,差异表达基因主要富集到B M P 信号通路的负调控㊁J U N 激酶活性激活等过程(图5A ),K E G G 通路分析显示,差异表达基因主要富集到P I 3K -A k t 信号通路㊁E C M 受体相互作用等通路(图5B );模块9和10基因集G O 功能主要富集到细胞对脂多糖反应㊁T 细胞凋亡过程的正调控(图5C ),K E G G 通路主要富集到Ⅱ型糖尿病㊁T 细胞受体信号通路等通路(图5D )㊂颜色背景表示趋势显著(P <0.05),相同颜色表示模块内所包含的基因表达趋势相似;白色背景模块表示趋势不显著(P >0.05)T h e t r e n d o f c o l o r b a c k g r o u n d i s s i g n i f i c a n t (P <0.05),t h e s a m e c o l o r i n d i c a t e s t h a t t h e g e n e e x p r e s s i o n t r e n d c o n t a i n e d i n t h e m o d u l e i s s i m i l a r ;T h e t r e n do fw h i t eb a c k g r o u n dm o d u l e i sn o t s i g n i f i c a n t (P >0.05)图4 大型迪庆藏猪背最长肌S T E M 分析F i g .4 S T E Ma n a l y s i s o f l o n g i s s i m u s d o r s im u s c l e i n l a r g eD i q i n g T i b e t a n p i gs 1682中 国 畜 牧 兽 医49卷A ㊁B ,模块11㊁14的G O 功能和K E G G 通路富集图;C ㊁D ,模块9及10的G O 功能和KE G G 通路富集图Aa n dB ,G Of u n c t i o na n dK E G G p a t h w a y e n r i c h m e n t h i s t o g r a m s o fm o d u l e 11a n d14,r e s p e c t i v e l y ;Ca n dD ,G Of u n c t i o na n d K E G G p a t h w a y e n r i c h m e n t h i s t o g r a m s o fm o d u l e 9a n d10,r e s p e c t i v e l y图5 大型迪庆藏猪背最长肌差异表达基因显著富集模块G O 功能和K E G G 通路富集分析图F i g .5G Of u n c t i o na n dK E G G p a t h w a y e n r i c h m e n t h i s t o g r a m s o f d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s o f s i g n i f i c a n t e n r i c h m e n tm o d u l e s i n l o n g i s s i m u s d o r s im u s c l e o f l a r g eD i q i n g T i b e t a n p i gs 2.6 不同体重阶段大型迪庆藏猪背最长肌差异表达基因互作网络2.6.1 S 1v s S 2 选择S 1v s S 2阶段显著富集通路中的基因绘制网络图,结果见图6㊂由图6可知,转录激活因子3(a c t i v a t i n g t r a n s c r i pt i o nf a c t o r3,A T F 3)㊁核受体亚家族4A 组成员3(n u c l e a rr e c e p t o r s u b f a m i l y 4g r o u p A m e m b e r3,N R 4A 3/N O R -1)㊁AM P 激活蛋白激酶γ2调节亚单位(p r o t e i n k i n a s e A M P -a c t i v a t e d n o n -c a t a l yt i cs u b u n i t g a m m a 2,P R K A G 2)㊁早期生长应答因子1(e a r l y g r o w t hr e s po n s e1,E G R 1)㊁早期生长应答因子2(e a r l yg r o w t h r e s p o n s e2,E G R 2)基因位于网络核心,其中A T F 3㊁N O R -1㊁P R K A G 2基因表达上调,A T F 3基因与脂联素表达有关,N O R -1和P R K A G 2基因会影响胰岛素敏感性;E G R 1㊁E G R 2基因表达下调,这2个基因与脂质代谢㊁脂肪生成有关㊂26828期聂靖茹等:大型迪庆藏猪不同生长阶段肌内脂肪沉积差异表达基因及其调控通路分析图6 S 1v s S 2阶段差异表达基因互作网络F i g .6 I n t e r a c t i o n n e t w o r k d i a g r a mo f d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s a t S 1v s S 2s t a ge 2.6.2 S 2v s S 3 选择S 2v s S 3阶段显著富集通路中的基因绘制网络图,结果见图7㊂由图7可知,过氧化物酶体增殖物激活受体δ(pe r o x i s o m e p r o l if e r a t o r a c t i v a t e d r e c e p t o r d e l t a ,P P A R D )㊁丙酮酸脱氢酶激酶(p y r u v a t ed e h y d r og e n a s ek i n a s e4,P D K 4)㊁叉头盒O 1(f o r kh e a db o xO 1,F O X O 1)㊁过氧化物酶体增殖激活受体γ辅激活因子1α(pe r o x i s o m e p r o l if e r a t i v ea c t i v a t e dr e c e p t o r ,ga m m a ,c o a c t i v a t o r 1a l p h a ,P P A R G C 1A /P P A R G C -1)㊁A T F 3㊁信号转导和转录激活因子1(s i gn a l t r a n s d u c e r a n da c t i v a t o r o f t r a n s c r i p t i o n 1,S T A T1)㊁脂肪酶E (l i pa s eE ,L I P E )基因位于网络中心,其中,L I P E ㊁A T F 3基因表达上调,L I P E 基因参与抗脂分解㊁脂质稳态等过程,A T F 3基因可调控脂联素表达;P P A R D ㊁P D K 4㊁F O X O 1㊁P P A R G C -1㊁S T A T 1基因表达下调,P P A R D 基因在脂肪代谢中发挥作用,P D K 4和F O X O 1基因可相互作用影响葡萄糖摄取及游离脂肪酸含量,P P A R G C -1基因在脂肪储存中起调控作用,S T A T 1基因可在脂肪细胞分化过程中起作用㊂2.6.3 S 1v s S 3 选择S 1v s S 3阶段显著富集通路中的基因绘制基因网络图,结果见图8㊂由图8可知,A T F 3㊁N O R -1㊁E G R 1㊁E G R 2㊁S T A T 1基因位于网络中心,其中,A T F 3㊁N O R -1基因表达上调,A T F 3基因可调控脂联素表达,N O R -1基因影响胰岛素敏感性;E G R 1㊁E G R 2㊁S T A T 1基因表达下调,E G R 1㊁E G R 2基因影响脂质代谢,S T A T 1基因与脂肪细胞分化有关㊂图7 S 2v s S 3阶段差异表达基因互作网络F i g .7 I n t e r a c t i o n n e t w o r k d i a g r a mo f d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s a t S 2v s S 3s t a ge 图8 S 1v s S 3阶段差异表达基因互作网络F i g .8 I n t e r a c t i o n n e t w o r k d i a g r a mo f d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s a t S 1v s S 3s t a ge 2.7 大型迪庆藏猪背最长肌脂肪沉积差异表达基因实时荧光定量验证随机挑选了E G R 1㊁F O X O 1等10个差异表达基因进行实时荧光定量P C R 验证,E G R 1㊁F O X O 1㊁P D K 4㊁P P A R D ㊁P P A R G C -1㊁S T A T 1基因表达下调,A T F 3㊁L I P E ㊁N O R -1㊁P R K A G 2基因表达上调,与R N A -S e q 结果一致(图9)㊂3682中 国 畜 牧 兽 医49卷图9 大型迪庆藏猪背最长肌差异表达基因实时荧光定量P C R 验证结果F i g .9 R e a l -t i m e q u a n t i t a t i v eP C Rv e r i f i c a t i o n r e s u l t s o f d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s i n l o n g i s s i m u s d o r s im u s c l e o f l a r g eD i q i n g T i b e t a n p i gs 3 讨 论3.1 大型迪庆藏猪S 1v s S 2背最长肌脂肪沉积差异表达基因大型迪庆藏猪40k g v s 80k g 阶段,A T F 3㊁N O R -1㊁P R K A G 2基因表达上调,E G R 1㊁E G R 2基因表达下调㊂A T F 3㊁N O R -1和P R K A G 2基因均在胰岛素抵抗信号通路中富集,当诱发胰岛素抵抗时,脂肪细胞㊁肌肉细胞对正常浓度的胰岛素反应不足,使得胰岛素作用的敏感性降低,促进葡萄糖摄取和利用效率下降,能量摄入过多[19],脂肪分解减少[20]㊂而脂联素能够激活腺苷酸活化蛋白激酶(AM P -a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ,AM P K ),减少丙二酰辅酶A 生成,促使脂肪酸进入线粒体得到氧化[21]㊂当发生脂联素抵抗时,脂联素对AM P K 的刺激减弱,骨骼肌中脂肪酸氧化的作用减弱,从而促进胰岛素抵抗[22]㊂A T F 3基因是脂联素基因表达的负调节因子,脂联素基因低表达会导致肥胖和胰岛素抵抗[23]㊂N O R -1基因在骨骼肌和脂肪组织中大量表达,参与肌内脂肪形成[24],N O R -1基因过度表达会导致循环儿茶酚胺浓度降低,引起胰岛素敏感性降低[25],导致脂肪分解减少,脂肪沉积增加[20]㊂P R K A G 2基因编码AM P 活化蛋白激酶γ2亚单位,该基因上调导致AM P K 活性增加,糖原合成激活㊁葡萄糖摄取增加,诱发胰岛素抵抗,脂肪沉积增多[26]㊂本试验中,A T F 3基因表达上调,引起脂联素基因下调,可能导致脂肪含量增加;N O R -1基因上调引起胰岛素敏感性降低,导致脂肪分解减少;P R K A G 2基因上调导致糖原合成激活㊁葡萄糖摄取增加,脂肪沉积增多㊂E G R 1和E G R 2基因属于早期生长反应因子家族,与脂质代谢㊁脂肪生成㊁胰岛素及胆固醇生物合成有关,在脂肪细胞分化信号通路中富集㊂E G R 1基因是3T 3-L 1脂肪细胞分化的负调节因子,敲除E G R 1基因能增强脂肪细胞分化[27]㊂E G R 2基因是脂肪细胞分化负调节因子m i R -224-5p 的直接靶点,m i R -224-5p 在早期脂肪形成中调节EG R 2基因表达[28]㊂本试验中,E G R 1和E G R 2基因表达下调,可能促进脂肪细胞分化和脂肪形成㊂3.2 大型迪庆藏猪S 2v s S 3背最长肌脂肪沉积差异表达基因大型迪庆藏猪80k g v s 120k g 阶段,L I P E ㊁A T F 3基因表达上调,P P A R D ㊁P D K 4㊁F O X O 1㊁P P A R G C -1㊁S T A T 1基因表达下调㊂L I P E 和A T F 3基因均富集到葡萄糖稳态信号通路中,影响肌肉组织对葡萄糖的吸收与利用及脂肪组织对胰岛素的敏感性[29]㊂L I P E 基因参与游离脂肪酸的动员[30]㊁抗脂分解及脂质稳态,导致高肌内脂肪含量[31]㊂A T F 3基因通过负调控脂联素基因而引起肥胖和胰岛素抵抗[23]㊂本试验中,L I P E 基因表达上调可能减少脂肪分解㊁提高肌内脂肪含量,A T F 3基因表达上调可引起脂联素基因表达下调,可能导致肌内脂肪含量增加㊂P P A R D 基因在W n t 和P P A R 信号通路中富集,参与脂肪代谢㊁能量调控,进而影响脂肪细胞的分化[32]㊂研究发现,W n t 信号通路能够调节脂肪沉积[33],同时能维持前脂肪细胞向脂肪成熟细胞分化的状态,W n t 信号通路减弱时,可分化大量脂肪细胞[34]㊂P P A R D 基因是胰岛素敏感和脂肪代谢的关键调节因子,在脂肪代谢中发挥作用,主要参与脂肪酸分解[35],增强脂肪酸运输㊁氧化㊁能量解偶联㊁线粒体呼吸㊁产热等相关基因的转录[36],上调脂肪酸氧化相关基因,降低体重㊁脂滴数量和脂滴大46828期聂靖茹等:大型迪庆藏猪不同生长阶段肌内脂肪沉积差异表达基因及其调控通路分析小[35]㊂猪P P A R D基因定位在7号染色体一个脂肪沉积的数量性状基因座(q u a n t i t a t i v e t r a i t l o c u s, Q T L)附近,可促进胆固醇和血清高密度脂蛋白积累[37]㊂P D K4㊁F O X O1㊁P P A R G C-1㊁S T A T1基因均在葡萄糖稳态㊁胰岛素受体及胰岛素信号通路过程中富集,通过影响脂联素及胰岛素作用的敏感性,进而影响葡萄糖摄取和利用效率及能量代谢,从而影响肌内脂肪含量㊂F O X O1基因会对脂联素受体的表达及脂联素敏感性的调节产生影响[38],同时F O X O1基因在调节胰岛素信号转导的糖异生和糖原分解中发挥重要作用,通过抑制细胞周期蛋白依赖激酶而阻止脂肪生成转录因子表达[39],在终末分化开始时,F O X O1基因被激活并转移到前脂肪细胞的细胞核,与P P A R G基因的启动子结合,导致有丝分裂后细胞生长停滞,负调控脂肪生成[40]㊂此外,F O X O1与P D K4基因的启动子区结合,增加肌肉中P D K4基因m R N A的表达[41],减少丙酮酸脱氢酶复合物(p y r u v a t e d e h y d r o g e n a s e c o m p l e x, P D C)通量,减弱碳水化合物氧化和葡萄糖摄取,并减少游离脂肪酸[42]㊂P P A R G C-1是一种转录共激活因子,可调控能量代谢,在米色和棕色脂肪组织中对脂肪代谢㊁脂肪细胞增殖㊁脂肪储存起重要调控作用[43],脂肪组织中缺乏P P A R G C-1基因的小鼠会产生胰岛素抵抗[44]㊂S T A T1基因位于P P A R G基因下游,在脂肪细胞分化中通过级联调节负调控脂肪形成[45]㊂本试验中,P P A R D㊁F O X O1㊁P P A R G C-1㊁S T A T1㊁P D K4基因表达下调, P P A R D基因表达下调可能使脂肪酸运输㊁氧化等相关基因的转录下调,脂肪酸分解减少㊁脂肪酸积累增多㊁脂滴变大㊂F O X O1基因表达下调导致与P P A R G基因的启动子结合减少,脂肪生成增多;另外,F O X O1与P D K4基因的启动子结合减少,葡萄糖摄取增加,游离脂肪酸增多㊂P P A R G C-1基因表达下调可能使骨骼肌对胰岛素的敏感性降低,肌内脂肪含量增加㊂S T A T1基因位于P P A R G基因下游,P P A R G基因通过级联调控引起S T A T1基因表达下调,促进脂肪生成㊂3.3大型迪庆藏猪S1v s S3背最长肌脂肪沉积差异表达基因大型迪庆藏猪40k g v s120k g阶段,A T F3㊁N O R-1基因表达上调,S T A T1㊁E G R1㊁E G R2基因表达下调㊂A T F3和N O R-1基因富集到胰岛素信号通路中,通过影响肌肉组织和脂肪组织中胰岛素敏感性来影响葡萄糖摄取及能量代谢效率,增加肌内脂肪含量[19-20]㊂S T A T1基因在能量稳态㊁胰岛素抵抗信号通路中富集,通过级联调节负调控脂肪形成[45]㊂E G R1㊁E G R2基因属于立早基因(i m m e d i a t e e a r l yg e n e s,I E G s),参与细胞生长㊁分化,富集到脂肪细胞分化信号通路㊂E G R1和E G R2为脂肪细胞分化的负调节因子[27-28],其表达下调促进脂肪形成㊂4结论A T F3㊁N O R-1㊁P R K A G2㊁E G R1㊁E G R2㊁L I P E㊁P P A R D㊁P D K4㊁F O X O1㊁P P A R G C-1㊁S T A T1作为核心基因调控大型迪庆藏猪肌内脂肪沉积;不同生长阶段参与调控的核心基因并不完全相同,40k g v s80k g阶段,A T F3㊁N O R-1㊁P R K A G2基因表达上调,E G R1㊁E G R2基因表达下调;80k g v s 120k g阶段,L I P E㊁A T F3表达上调,P P A R D㊁P D K4㊁F O X O1㊁P P A R G C-1㊁S T A T1基因表达下调;40k g v s120k g阶段,A T F3㊁N O R-1基因表达上调,E G R1㊁E G R2㊁S T A T1基因表达下调㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] WO O DJ D,E N S E R M,F I S H E R A V,e ta l.F a td e p o s i t i o n,f a t t y a c i dc o m p o s i t i o na n dm e a t q u a l i t y:Ar e v i e w[J].M e a t S c i e n c e,2008,78:343-358. 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中国水产科学 2020年3月, 27(3): 346-354 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2019-07-25; 修订日期: 2019-08-05.基金项目: 山东省自然科学基金项目(ZR2018PC028); 山东省现代农业产业技术体系鱼类创新团队项目(SDAIT-12-01); 山东省农业良种工程项目(2014lz042); 山东省重点研发计划项目(2018GNC110034).作者简介: 王超(1985–), 男, 博士, 助理研究员, 主要从事细菌免疫和抗生素耐药研究. E-mail: wangchao850303@ 通信作者: 孟庆磊, 副研究员. E-mail: qingleimeng@ DOI: 10.3724/SP.J.1118.2020.19210吞噬作用在尼罗罗非鱼抵抗嗜水气单胞菌感染过程中的重要作用王超1, 2, 张龙岗1, 2, 吴蒙蒙1, 3, 王锡荣1, 2, 朱树人1, 2, 安丽1, 2, 付佩胜1, 2, 孟庆磊1, 21. 山东省淡水渔业研究院, 山东 济南 250000;2. 山东省淡水水产遗传育种重点实验室, 山东 济南 250000;3. 山东省淡水渔业研究院水产品质量检测中心, 山东 济南 250000摘要: 罗非鱼是重要的经济鱼类, 而嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila )是其主要病原菌之一, 只有充分的掌握该病原菌的感染机制才能提供更好的预防和治疗手段。

本研究首先通过转录组筛查尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus )脾脏中与细菌感染相关的基因, 然后通过荧光定量PCR 证实上述基因的表达变化, 最后使用秋水仙素试验和交叉免疫试验进行验证。

研究结果显示, 尼罗罗非鱼在感染嗜水气单胞菌之后, 吞噬作用发生显著增强。

秋水仙素试验发现, 微管蛋白的功能受到抑制可以显著降低罗非鱼对嗜水气单胞菌的防御能力。

抑郁症小鼠海马组织差异表达炎症因子基因筛选及生物信息学分析邵青1，2，袁东亮3，王娜1，阎得胜1，张晓红1，张辉1，权伟1，21西安市精神卫生中心，西安710199；2空军军医大学；3空军军医大学唐都医院摘要：目的筛选抑郁症小鼠海马组织中差异表达的炎症因子基因，并进行生物信息学分析。

方法将12只C57小鼠分为对照组和抑郁症组，每组6只。

抑郁症组通过慢性不可预知温和应激模型制备小鼠抑郁症模型，对照组不造模。

取两组海马组织，采用实时定量PCR 检测84个炎症因子基因。

采用GeneSpring GX11.5.1软件分析基因芯片数据，获取两样本信号强度比值（Ratio ），将Ratio>2或<0.5作为有表达差异，Volcano Plot 筛选差异表达基因。

对差异表达基因进行GO 生物过程（GO -BP ）富集分析和KEGG 通路分析。

通过对GO -BP 分析及KEGG 通路分析结果进行交集，筛选目标差异表达基因。

结果与对照组相比，抑郁症组中差异表达的细胞因子基因有6个，表达上调的3个基因分别为CXCL5、BMP2、IL10RA ，表达下调的3个基因分别为CCL12、IL5、IL1A 。

差异表达基因主要参与白细胞迁移、白细胞趋化性及免疫系统过程等生物过程的调控，参与细胞因子与细胞因子受体相互作用通路、趋化因子信号转导通路及IL -17信号转导通路等。

共筛选出4个目标差异基因，为CXCL5、BMP2、IL1A 、CCL12基因。

结论抑郁症小鼠海马组织中差异表达的炎症因子基因主要为CXCL5、BMP2、IL1A 、CCL12等，这些炎症因子基因可能通过调控多种生物过程和多条信号通路参与抑郁症的发病。

关键词：抑郁症；海马组织；炎症因子；基因芯片；生物信息学doi ：10.3969/j.issn.1002-266X.2021.08.010中图分类号：R749.4文献标志码：A文章编号：1002-266X （2021）08-0042-04Screening and bioinformatics analysis of differentially expressed inflammatory cytokine genes in hippo⁃campi of mice with depressionSHAO Qing 1，YUAN Dongliang ，WANG Na ，YAN Desheng ，ZHANG Xiaohong ，ZHANG Hui ，QUAN Wei 1Xi ’an Mental Health Center ，Xi ’an 710199，ChinaAbstract ：ObjectiveTo screen out the differentially expressed inflammatory cytokine genes in hippocampi of micewith depression and to analyze their relevant bioinformatics.MethodsTwelve C57mice were randomly divided into thecontrol group and the depression group ，with 6in each.The depression models were built in mice by using chronic unpre⁃dictable mild stress models ，and the mice in the control group were not treated.The hippocampi of the two groups were col⁃lected ，and 84inflammatory cytokine genes were detected by real -time quantitative PCR.GeneSpring GX11.5.1software was employed to analyze the microarray data ，and the ratio of signal intensity （Ratio ）of the two samples was determined ；the differentially expressed genes were screened out through Volcano Plot by taking the Ratio >2or <0.5as the genes with differential expression.The differentially expressed genes were analyzed by GO biological process （GO -BP ）enrichmentanalysis and KEGG pathway analysis.Target differentially expressed genes were screened out by intersecting the results achieved by GO -BP analysis and KEGG pathway analysis.ResultsThere were 6cytokine genes differentially expressedin the depression group as compared with those of the control group ，including three up -regulated genes CXCL5，BMP2and IL10RA ，and three down -regulated genes CCL12，IL5and IL1A.Differentially expressed genes were largely involved in the process of regulating leukocyte migration ，leukocyte chemotaxis and immune system processes.Moreover ，the genesparticipated in the cytokine -cytokine receptor interaction pathway ，chemokine signal transduction pathway ，as well as IL -17signal transduction pathway.Four target differential genes CXCL5，BMP2，IL1A and CCL12were screened out.Con⁃clusionThe inflammatory cytokine genes differentially expressed in the hippocampi of depressed mice primarily include基金项目：陕西省自然科学基础研究计划项目（2020JM -701）；西安市科技局医学项目（2019115113YX006SF039-11）；西安市“科技+”行动计划－医学研究项目（J201803045，J201902026）。

中南大学学报（医学版）J Cent South Univ (Med Sci)2021,46(10)基于生物信息学分析并验证一组与结直肠癌预后相关的基因覃异1，陈璐2，陈立章1（1.中南大学湘雅公共卫生学院，长沙410078；2.中南大学湘雅医院胃肠外科，长沙410008）[摘要]目的：针对结直肠癌(colorectal cancer ，CRC)预后的肿瘤标志物尚缺乏可靠的准确度和灵敏度。

本研究旨在采用生物信息学方法，筛选并验证一组与CRC 诊断与预后相关的基因。

方法：从NCBI-GEO 数据库中选取关于CRC 和正常结直肠黏膜(colorectal mucosa ，CRM)组织标本全RNA 组测序数据集GSE31905、GSE35279和GSE41657，并分析其中的差异表达基因(differentially expressed genes ，DEGs)，先通过Venn 图获取这3个数据集的共同DEGs ，然后用STRING 网络系统和Cytoscape 软件进一步富集上述基因，最后在Kaplan-Meier plotter 网站上验证富集后的基因与CRC 预后的相关性。

结果：通过NCBI-GEO 数据库中自带的GEO2R 工具分别筛选出3个数据集中CRC 与CRM 的DEGs(|log 2FC|>2和P <0.05)。

用Venn 图分析软件，将3个数据集中的上调/下调基因分别取交集，得出3个样本共105个共有的上调基因和140个共有的下调基因。

将上述上调/下调基因导入STRING 网络系统，得出相互作用的基因。

将相互作用的基因集导入Cytoscape 软件，用MCODE(Molecular Complex Detection)插件查找到61个上调基因。

最后通过Kaplan-Meier plotter 网站，得到EPHB2、KLK8、DIAPH3、STC2、OXTR 、MMP7、MET 、KRT85、KRT6B 、KRT23、KLK10等11个在CRC 中高表达的基因，且与预后相关。

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2020, 46(9): 1303 1311 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.03004玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病抗性基因的挖掘闻竞1沈彦岐1韩四平1邢跃先2张叶1王梓钰1李世界1杨小红3郝东云1张艳1,*1 吉林省农业科学院农业生物技术研究所，吉林长春 130033；2 吉林省农业科学院玉米研究所，吉林公主岭 136100；3 中国农业大学农学院，北京 100193摘要: 玉米穗腐病是一种严重危害玉米生产的真菌性病害, 而目前在世界范围内玉米育种上应用的大多数自交系缺少对穗腐病的抗性。

玉米穗腐病抗性位点的挖掘和抗病基因的克隆, 对玉米穗腐病的遗传改良至关重要。

本研究旨在通过转录组测序和全基因组关联分析的方法进行玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病抗性位点的挖掘并初步确定候选基因。

抗病自交系法A和感病自交系掖81162的转录组测序结果表明, 人工接种拟轮枝镰孢菌后7 d两个自交系的差异表达基因有10,761个。

通过全基因组关联分析共检测到5个与穗腐病抗性显著相关的SNP, 这些SNP分布在1号和9号染色体上。

通过比对B73 RefGen_v3并注释, 发现SNP位点附近涉及的基因包括酰基激活酶1过氧化物酶体、蛋白磷酸酶2C 48、镁转运蛋白、受体蛋白激酶CRINKLY4和锌指CCCH域蛋白19。

将在转录组测序中获得差异表达基因和全基因组选择中关联到的基因进行比对, 发现全基因组关联分析中关联到的锌指CCCH域蛋白19同时也是转录组测序中获得的差异表达基因, 表明锌指CCCH域蛋白19可能与玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病的抗性相关。

本研究结果不仅能为抗病基因的克隆和玉米的抗病分子育种提供一定的理论依据和重要的遗传资源, 而且能为玉米和病原菌的相互作用机理的解析奠定基础。