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荧光定量PCR常见问题解析（一）1、普通PCR与荧光定量PCR技术区别？①荧光定量PCR能够实时监测PCR反应的全过程，对每一个循环进行定量或定性分析；而普通PCR只能对反应的终产物进行半定量或定性分析。
②荧光定量PCR的结果分析可以直接通过电脑读出，而普通PCR的结果必须通过下一步的电泳进行条带分析。
2、荧光定量PCR技术的特点①灵敏度高、特异性强。
② PCR实验过程全封闭，仪器自动分析和获取实验结果，无后续实验操作。
③实时监测反应过程，定量更准确。
④定量范围宽，可达到10个数量级。
⑤可以实现一次反应检测多个样本。
3、实时荧光定量PCR实验操作注意事项①应该带一次性乳胶手套并经常更换，在试剂准备室和样本处理室应该配备负压式生物安全柜，以防止对环境或对样品的污染。
②要严格防止气溶胶交叉污染。
采取的措施有：使用一次性带滤芯移液枪吸头；不使用吸头吹打液体进行混匀；在生物安全柜中进行离心操作；尽量减少在生物安全柜以外开启试剂或PCR管；禁止在荧光定量PCR结束后打开PCR管盖。
③实验中牵涉的有毒有害及有污染的样本及试剂应该严格按照生物安全相关规定操作和处理。
④荧光探针应该避光保存，加入反应液后应尽快上机，以防探针粹灭。
⑤在进行RNA相关操作时，必须使用无RNase的实验器具及耗材，并加样后立即上机操作，以防RNA的降解。
⑥所有试剂在开启之前都要瞬时离心；试剂配制完成后要瞬时离心以去除气泡。
⑦不要在荧光定量PCR管上做任何标记，不能用手接触PCR管盖上采光部位。
4、实时荧光定量PCR实验无CT值出现或无扩增信号的问题及解决方案①实验的循环数不够，设计的循环数应该在35以上，可增加至45个循环，但不可高于45个循环。
②通道选择不对，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求选择采光通道。
③荧光采集位置设计有误，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求设置荧光信号采集位置。
④引物或探针降解，要求厂家重新发货验证。
荧光定量系列常见问题及解决方法1)、扩增曲线形状异常a)、扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。
提高模板浓度重复实验。
b)、扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。
减小基线终点(Ct值- 4)，重新分析数据。
c)、个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。
进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
2)、反应结束无扩增曲线出现a)、反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
b)、确认程序中是否设置了信号采集步骤：两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
c)、确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除引物降解的可能性。
d)、模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
e)、模板降解：重新制备模板，重复实验。
3)、Ct值出现太晚a)、扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。
b)、模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
c)、模板降解：重新制备模板，重复实验。
d)、PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为100 bp-150 bp之内。
e)、反应体系中存在PCR反应抑制剂：一般为加入模板时带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
4)、阴性对照也出现明显扩增a)、反应体系或者水被污染：更换新的Mix或者水重复实验。
反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
b)、引物二聚体的出现：一般在35循环以后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合融解曲线进行分析。
5)、绝对定量时标准曲线线性关系不佳a)、加样误差：加大模板稀释倍数，提高加样体积。
b)、标准品降解：重新制备标准品，重复实验。
c)、模板浓度太高：增加模板稀释倍数。
荧光定量PCR检测miRNA中遇到的常见问题
一、反转录引物(RT引物)设计
实时荧光定量PCR检测miRNA的难点在于如何识别只有22nt左右的miRNA并合成第一链，目前常用的方法主要有茎环法和加尾法。
茎环法：引物由可以自身呈茎环状的特异序列+6~8个miRNA3’端反向互补碱基组成。
该RT引物可以与成熟miRNA结合，形成反转录引物/成熟miRNA复合物，并在miRNA的5’末端延伸，这样就得到一个较长的反转录扩增子，为后续的荧光定量PCR提供了符合要求的模板。
原理示意图如下：
加尾法(Oligod(T)特异RT引物法)：RNA在反转录前需要进行末端Poly(A)加尾，所有miRNA可以公用一个Oligod(T)的引物(由特异序列+(T)20左右+兼并碱基V或VN组成)。
加尾法特异性稍低，但设计及操作简单。
原理示意图如下：
二、荧光定量PCR引物探针设计
反转录后得到的cDNA为复合片段(miRNA+引物)，上游引物为特异性引物，在miRNA上设计，若GC含量太低，可以在上游引物5’端加入GCGC等保护碱基，下游引物为通用引物，与RT引物的某一段相匹配。
荧光定量PCR检测方法主要有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。
前者需调整引物浓度，提高引物扩增效率，尽量减少引物二聚体与非特异性扩增;探针法需设计荧光探针，探针设计位置可以有3种：完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉位置、完全在RT引物上。
至于探针要设计在哪个位置，可根据自己的实验情况来定。
荧光定量PCR常见问题分析荧光定量PCR常见问题分析Q1．CT值出现过晚1.扩增效率低，反应条件不够优化。
设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3.PCR产物太长。
一般采用80-150bp的产物长度。
Q2．无CT值（信号）出现1.反应循环数不够。
一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2.检测荧光信号的步骤有误。
一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3.引物或探针降解。
可通过PAGE电泳检测其完整性。
4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5.模板量不足。
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6.模板降解。
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
Q3．标准曲线的线性关系不佳1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。
应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3.引物或探针不佳。
重新设计更好的引物和探针4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高Q4．阴性对照也出现明显的起飞1.应mix或水被污染。
2.引物二聚体的出现。
用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3.反应过程中探针的降解。
用PAGE电泳对探针进行检测。
4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。
Q5．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。
Q6．熔解曲线不止一个主峰1．引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。
适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。
适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
荧光定量PCR问题疑难解答荧光定量PCR问题疑难解答（一）Q：1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。
但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。
2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。
A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。
1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。
可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。
2. PCR中混入影响反应的物质：模板提取方法需要改进3. 样品稀释不准确：这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。
Q：荧光定量PCR的灵敏度A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。
Q：标准曲线要重复两三次吗?A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。
Q：关于荧光定量标准曲线的制作A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。
Q：溶解曲线高矮A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。
融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。
Q：定量PCR没有扩增A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。
荧光定量pcr实验常见问题梳理一、无Ct值或Ct值延迟出现:扩增曲线信号不佳，曲线不平滑:标准曲线线性差。
1.扩增产物大小不合适：实时荧光定量PCR扩增片段的长度通常在80-150 bp之间，如果调整反应的时间有可能扩增500bp的片段。
2.PCR反应过程中退火及延伸的时间过短或过长：应根据扩增片段的大小予与调整。
3.MgCl,浓度不合适：按0. 5mm的间距调整MgCI2的浓度。
4.循环数设置不足：最少设置35个循环，可以增加到45个循环。
超过45个循环以上背景信号会增加，对实验结果的分析造成干扰。
5.在错误的PCR反应步骤采集信号：应检查程序设置确保信号的采集是在退火的步骤进行的。
6.加样的误差及错误：注意每次加样的一致性及移液器的校正。
7.DNA模板的起始浓度过低，不能被检测出来：如果模板的浓度未知，最初的实验可以采用较高浓度的模板并进行梯度稀释。
最高的模板浓度不超过500ng基因组DNA。
8.模板DNA的降解：使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解，检查DNA模板的储存条件是否合适，如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。
9.梯度稀释标准样品的方法不规范:应注意梯度稀释样品的操作规范，准确。
10.引物或探针设计有误，存在二级结构：通过琼脂糖凝胶电泳检测荧光定量PCR反应结果，是否有PCR产物存在。
如果没有PCR扩增产品，应使用引物设计软件检查引物的各种指标是否合适: Tm. 与模板的批配度、二级结构、扩增片段的长度、非特异型扩增的情况。
具体的数据请翻阅前面的相关原理说明11.引物之间的Tm值相差过多：上下游引物的Tm值差不应超过4C。
12.引物或探针的使用浓度不合适：应将浓度控制在50- 900 nM之间，探针的浓度低于引物的浓度。
13.引物或探针降解：使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解，检查DNA模板的储存条件是否合适，如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。
14.探针设计的位置在扩增片段的5’端：应将探针设计的位置靠近扩增片段的3”端15.探针被氧化：避免用酸性溶液溶解探针，否则会产生高背景荧光信号及低的扩增信号。
实时荧光定量PCR技术110问-黄超杰版实时荧光定量PCR技术110问 1、实时荧光定量PCR的英文全称是什么,2、实时荧光定量PCR技术包括那些类型,3、探针法-实时荧光定量PCR技术主要包括哪些类型探针,4、不同类型的实时荧光定量PCR方法分别是由哪些人或公司发明,5、实时荧光定量PCR的基本原理,6、自身淬灭探针定量(Self-quenched Probe)PCR的原理,7、什么是基线、荧光阀值、循环阀值,8、染料法-实时荧光定量PCR都包括那些染料,9、 SYBR Green I等染料的定量原理,10、 SYBR Green I染料法溶解曲线步骤中，平行样本出现细微的Tm值上的差异是否正常,为什么,11、列举探针法-实时荧光定量PCR技术常用到的荧光基团和淬灭基团组合,12、什么是荧光共振能量转移(FRET),13、 TaqMan探针、分子信标等探针法定量原理,14、探针法的探针上荧光基团与淬灭基团标记位置,能否进行位置调换, 15、TaqMan探针上的淬灭基团能否标记在探针中间位置或更靠近荧光集团的位置,如果可以的话，注意事项是什么,16、为什么探针设计是要求碱基G(鸟嘌呤)的数量少于碱基C(胞嘧啶)的数量,17、为什么荧光基团不能标记到碱基G(鸟嘌呤)上,18、在做标准曲线试验中，影响扩增效率的因素包括哪些, 19、怎么解决染料法实时荧光定量PCR的引物二聚体现象, 20、染料法-实时荧光定量PCR有哪些优缺点,21、探针法-实时荧光定量PCR有哪些优缺点,22、市场上常见的实时荧光定量PCR仪品牌和型号,23、哪些实时荧光定量PCR仪可以进行HRM分析,24、影响实时荧光定量PCR仪检测灵敏度(设备检测限)的主要因素有哪些,25、一般实时荧光定量PCR仪定检周期是多少,26、常见的实时荧光定量PCR仪设备检测灵敏度分别为多少, 27、常见的实时荧光定量PCR仪常见检测反应体积范围, 28、 ABI stepone plus设备说明书中建议的扩增体积为10-30ul，软件设置选项提供范围为5-50ul，那么该设备适应的扩增体积为多少, 29、分子信标为什么不被Taq DNA聚合酶水解,30、染料法实时荧光定量PCR能否做多重PCR实验,怎么做, 31、探针法实时荧光定量PCR能否做多重PCR实验,怎么做, 32、 ROX染料是什么，有什么作用,33、 ROX I与ROX II有什么区别,34、 TaqMan探针在反应体系中能否与下游引物组合引发扩增影响检测结果,35、引物二聚体现象是否影响探针法实时荧光定量PCR的反应,如果没有影响，说出理由，如果有影响，给出分析。
荧光定量PCR常见问题1.定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。
开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。
关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
2.哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml 光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。
ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3.为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。
当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。
碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。
碎片整理的方法如下：∙在Windows桌面上，选择开始(start),我的电脑(My computer)。
∙在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。
∙在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。
∙单击碎片整理(Defragment)。
∙当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。
∙在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。
为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。
4.何时执行windows service pack更新？不要执行该操作。
除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。
荧光定量PCR技术的使用中常见问题引言：荧光定量PCR技术作为一种高效、灵敏和准确的基因定量方法，广泛应用于分子生物学、医学诊断、环境监测等领域。
然而，在使用荧光定量PCR技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。
本文将就荧光定量PCR技术的使用中常见问题进行探讨和解答，旨在帮助读者更好地应对和解决实验中的困惑。
一、引物设计问题1. 引物设计原则荧光定量PCR实验的关键是引物的设计。
引物应具备特异性、高度选择性以及适当的配对特性，以确保PCR反应的准确性和灵敏度。
引物设计建议遵循以下原则：- 引物长度：一般选择长度在18-30个碱基对之间。
- 碱基组成：应尽量避免引物末端含有连续的鸟嘌呤（G）或鸟嘧啶（C）。
- 碱基序列：引物两端应该尽量避免含有重复的碱基序列，以防止不特异扩增。
- 温度计算：引物的Tm（解离温度）应该在50-60摄氏度之间，同时引物间的Tm差异应不大于5摄氏度。
2. 引物设计工具引物设计可以利用一些在线引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST 等。
这些工具能够根据用户提供的序列信息，自动生成符合上述引物设计原则的引物。
二、荧光探针选择和优化1. 探针选择荧光定量PCR常用的探针有TaqMan探针、Molecular beacon探针等。
选择合适的探针取决于实验需要和目标基因的特点。
TaqMan探针适用于高度特异性检测，而Molecular beacon探针则适用于检测低浓度的目标序列。
2. 探针的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，有时需要对探针进行优化。
以下是一些优化探针的建议：- 探针浓度优化：需根据实验条件和目标基因的特性进行探针浓度的优化。
- 探针长度：一般探针的长度限制在15-30个碱基对之间。
三、荧光定量PCR反应体系问题1. 反应体系的组成荧光定量PCR反应体系基本组成包括：模板DNA、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸等。
其中，重要的是要根据实验需要和试剂盒的要求确定各组分的浓度。
荧光定量PCR问题疑难解答（一）Q：1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。
但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。
2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。
A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。
1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。
可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。
2. PCR中混入影响反应的物质：模板提取方法需要改进3. 样品稀释不准确：这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。
Q：荧光定量PCR的灵敏度A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。
Q：标准曲线要重复两三次吗?A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。
Q：关于荧光定量标准曲线的制作A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。
Q：溶解曲线高矮A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。
融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。
Q：定量PCR没有扩增A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。
虽然你在普通PCR仪上优化过条件，但换了定量PCR仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差异，同样的条件做不出PCR也是可能的。
由于很多因素的影响，扩增子的溶解温度会有一定变异。
溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG 和MgCl2浓度和其他因素的影响。
要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。
Q：SG的稳定性如何？A：只要不进行稀释，SG是非常稳定的。
一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。
为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2、dNTP和Taq酶浓度等）。
结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。
SG分析的优化主要包括以下4个因素：a) SG 浓度b) 引物浓度c) MgCl2浓度d) 温度和反应次数推荐的SG终浓度变动范围是1：5000到1：100000。
经常用到的浓度范围是1：10000到1：70000。
引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。
引物浓度的范围应该是50nM到300nM，然而，也有例外的情况。
Q：荧光定量污染解决办法A：几个月前我也有跟你一样的遭遇，当时跳楼的心都有。
后来美国来人给培训，按照他们的要求，污染果真就给控制了，两个月来一直还很好。
以下的经验希望对你有用。
1. 配反应体系和加模板要在不同的屋子进行；2. 配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉；3. 分装好体系以后把反应板/条放在一个有盖的干净的托盘中端到加样的房间；4. 配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可；5. PCR完毕后，反应产物拿到别的屋子扔掉；6. 最重要的就是不要把DNA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。
Q：荧光定量real-timePCR重复性问题A：建议不要只加1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul，这样有助于改善重复性。
如果你测的是拷贝数，重复性不好是很难避免的。
我感觉用SYBR green作realtime的误差还是比较大的，它的优势在于灵敏度高，但如果想精确定量，还是比较困难的，只好重复很多次，或者多花钱买标记的引物，那个特异性最好。
Q：各位高手，今天第一次做完8个基因的相对荧光定量（ddct法），扩增时忘了做融解曲线了，现在是不是没法再做融解曲线了？（ABI7500）对于每个基因都作了NTC对照，结果显示NTC无扩增，这样能否说明引物设计得还可以，没有引物二聚体的产生？至于是否有非特异性产物，就必须得做融解曲线了？请帮忙指教一下啊A：把你的定量PCR产物重新作融解曲线，只是新建立一个反应，反应条件按照融解曲线的条件设定就可以了，没必要重新作定量。
Ct值25-29，融解曲线单峰；ntc无CT值，融解曲线无峰，就不用电泳了，可以肯定。
模板量增加10倍，Ct 值减小3.32Cycles。
Q：荧光阈值高，怎么改进？A：阈值取决于基线，基线是3~13cycles左右的荧光信号值标准偏差10倍，可能是背景高，把模板纯化一下看看。
要调整一下你的基线的起止循环数。
一般开始的循环为2或3，中止循环为一次试验最早起峰的Ct-3，即如果一条曲线在第13个循环就已经起峰了，那么基线的中止循环可以设置为13-3=10。
如果你的体系不存在问题，就可能是你的那次试验模板浓度较高，起峰早，导致的阈值线过高。
Q：荧光定量PCR检测灵敏度和线性范围的关系A：一般大家认为的检测灵敏度即检测下限，可以理解为能检测到和准确定量的最低浓度(拷贝数)，而线性范围为能够检测的区间，即可以检测及分辨的最低浓度到最高浓度的数量级。
但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系相关。
Q：real time PCR CT值一般在多少后认为模板没扩增？A：当进入对数期的循环数大于35个时，RealTime RT-PCR检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表达。
Q：正常情况NTC是不应该出现CT值的吗？A：如果是探针法，应该没有Ct值，所谓的没有，也是针对不同算法而言的。
NTC一般没有明显的指数扩增，所以一般软件不计算Ct。
如果是染料法，可能在30个循环后有微弱起峰，并且软件计算出Ct值，这时还要观察溶解曲线，看扩增产物是否是引物二聚体。
大多情况是二聚体，这时也可以优化条件，比如提高退火温度等。
如果是探针法，阴性对照起峰肯定是污染，如果是染料法，还要看溶解曲线：如果溶解曲线的Tm值在80度以下，那么很可能是引物二聚体；如果溶解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的Tm值相同的峰，那么就意味着存在污染。
Q：real time PCR无结果，而用产物跑电泳条带很清楚，什么问题？A：我也出现过此情况，后来发现是因为加样的时间太长了，荧光染料暴露时间太长了，荧光基团淬灭了，出现上述问题还有一种情况，那就是荧光PCR仪的荧光采取信号值太低，有时也不稳定。
如果你使用探针法，有荧光信号而没有求出Ct值，那么可能你的探针浓度有问题，可能太高或者太低了，可能改变探针浓度看看。
Q：最佳荧光采集温度A：采集荧光的时机不是决定于温度，而是决定于采用的方法。
如果采用染料法，一般要在延伸阶段的末点进行检测，而72度延伸的效率最高，所以采用染料法时大多在72度检测。
如果扩增产物中存在引物二聚体，也有采用更高的读板温度，比如76度、80度等，这时的读板温度与引物二聚体的Tm值相关。
如果采用TaqMan探针法，由于TaqMan探针是累积荧光，理论上说在任何步骤检测都可以，但目前TaqMan大多采用两步法，所以在退火的末点进行检测即可。
如果采用分子信标的方法，就要在退火的末点进行检测。
如果采用FRET探针法，要在退火时进行荧光检测。
Q：标准曲线的讨论A：有一点可以告诉你：样品浓度太高，beta-actin都是很高的，要漂亮就稀释1000倍后再做。
浓度高，很容易导致污染。
而且第一二个梯度没有分开啊。
标准曲线的落点局限在15个循环以前，那样你得到的反应有效线性范围太窄，就是说要很高浓度的样品才适用你这标准曲线。
Q：定量PCR中，质粒作为标准分子为何要线性化A：因为你要检测的目的基因如果不出意外的话，应该是线性的吧，而你用来定标准曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。
我想单从变性和复性的难易上就会有很大的区别，当然会对引物的结合等各方面造成影响，何况环状的空间构象和线性的空间构象上的差异了。
做标准曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件，所以说，如果做标准曲线时你可以有条件做到用和你要检测的基因一样的标准品做标准曲线的话，就不要选择把一段基因克隆到质粒上。
但是一般情况下是很难做到的。
楼上说的没有酶切效果还行，那只是还行。
荧光定量本来就是很容易受到很多因素影响的实验，当然是要求严点好了，当然如果你检测的基因本身就是环状的，那当然不用线性化了，那样反而不好了！线性化比较麻烦：首先要酶切，保证完全酶切，才能全部线性化。
然后要回收，质粒酶切后再回收容易被破坏，而且回收率也不是很高。
第三，线性化的质粒不容易保存，相对于环状质粒来说。
所以，如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用，那就可以省去很多事情了。
Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA.线形化与环状质粒比较文章评论：这篇文章用这个质粒对线性化和非线性化做了比较，从实验结果看线性化并没有对标准曲线产生任何改变。
但是这篇文章只是摆出了试验结果，并没有从原理上分析这个实验结果的原因，因此线性化对于标准曲线的作用并不能以这篇文章的结果来外推。
就是说可能需要更多的实验结果，或者从原理上分析了这篇文章的结果，才能得出结论来说明，线性化确实对于所有,或大部分的质粒标准分子是不必要的。
荧光定量PCR问题疑难解答（二）Q：realtime pcr不同基因之间的阈值(threshold)是不是要一样啊?A：如果做标准曲线或者相对定量，建议阈值还是一样比较好。
而且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。
如果扩增曲线的效率接近，阈值线的位置对于定量结果的影响是微乎其微的。
Q：扩增曲线本底不断升高是什么原因?A：我近期也遇到过这种现象，现在基本解决了，原因可能如下：1、试剂质量差是主要原因，我用ABI的SYBR试剂做了一年从来没有遇到过类似问题，而近期换成东洋纺的试剂就出现了这个问题，所以最好不要贪便宜用小鬼子的试剂！2、模板不纯是一个重要原因，我用东洋纺的试剂出现问题后，用ddH2O稀释10倍以上（一定不要用TE稀释，要不然可能会更差），问题基本解决；3、如果模板稀释后基线还有一定的上升，结果分析时可以将基线从6以上设，避开初始的几个上升厉害的循环；建议：要根本解决此问题请用质量可靠的试剂，便宜没好货！Q：分子信标做的阴性对照，曲线为一条斜线，什么原因？A：和我以前做得没消除背景的曲线挺相像。
