电化学生物传感器

基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
探针 DNA 的固定及表征
[Fe(CN)6]3-/4-在 SWNTs－DA/GCE(a)和 S1/SWNTs－DA/GCE(b)上的循环伏安图
Fe(CN)6]3-/4- 在 S1/SWNTs － DA/GCE的电化学响应增强，当 电极表面的-CHO与DNA探针末 端的-NH2发生 胺 醛 缩 合，并 被 还 原 成-CH2-NH-单 键 基 团 后，电 极 表 面 空 隙 增 大，有 利 于Fe(CN)6]3-/4-通过空隙与电 极表面接触，从而导致电化学信 号增强。该结果也说明，通过复 合物上DA末端醛基与DNA末端 的修饰氨基之间的胺醛缩合反应 已 成 功 将 探 针 DNA 固 定 在 电 极 表面。
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
结果与讨论
• SWNTs－DA 的分散性及形貌表征 • 不同修饰电极的电化学表征 • 探针 DNA 的固定及表征 • 传感分析：（1）MB 的电化学行为
（2）富集时间的影响 （3）不同序列 DNA 的电化学检测 （4）目标序列的定量检测
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
DNA 电化 学传 感器 特点
纳 米 材 料 特 点
成本低 设计简单 设备小巧
能耗低 灵敏度高 比表面积大 表面反应活性高 活性位点丰富 催化效率高 吸附能力强
易于微 型化
灵敏度 更高
特异性 更强
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
单壁碳纳米管( SWNTs)
单壁碳纳米管( SWNTs) 作为一种新型的碳纳 米材料，其高的长径比、大的比表面积有利 于负载大量的探针分子，且其超高的导电性 能，能在电化学传感检测中起到催化作用， 从而提高分析灵敏度。但由于 SWNTs 本身 是非水溶性碳材料，且缺乏功能基团，其应 用受到了限制。以有机小分子通过共价或非 共价模式对 SWNTs 进行修饰，是提高其溶 解性和功能性的重要途径。
基于单壁碳纳米管--十二醛复合Leabharlann Baidu料的DNA 电化学传感器
十二醛(DA)
月桂醛Lauraldehyde CH3(CH2)10CHO学名十二醛。 无色液体。冷时凝成白色蜡烛固体。有不愉快的气 味，在高度稀释时有像紫罗兰的香气。密度 0.828~0.836. 熔 点 44 ℃ 。 沸 点 227~235 ℃ 。 折 射 率 1.433~1.440。溶于乙醇，不溶于水。暴露空气中聚 合成二聚体，有微量无机酸存在时更快。氧化时生 成月桂酸。用于配置多种花香型香精。由月桂醇经 氧化，或十二（烷）酸和甲酸的钡盐经蒸馏，或十 二（烷）酸和甲酸的蒸汽通过催化剂而制的。 DA 分子的长脂肪链通过疏水性作用缠绕在 SWNTs 外围，减弱了碳管外壁之间的 π－π 堆积和范德华 力，从而起到稳定剂的作用。
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传感分析
富集时间的影响
不同富集时间下 5.0×10-5mol/L MB 溶液 在S1/SWNTs－DA/GCE 上的 DPV 图
随着富集时间的增加，氧化峰电流值逐渐增 大，但在富集一定时间后，氧化峰电流基本 稳定，说明 MB 在 S1/SWNTs －DA / GCE 上 已经富集饱和。
SWNTs－DA 的分散性及形貌表征
结果表明DA能作为一种很好的分散剂用于SWNTs 的分散， 且能保持很好的稳定性。这是由于DA 分子的长脂肪链通过疏 水性作用缠绕在SWNTs外围，减弱了碳管外壁之间的π－π堆 积和范德华力，从而起到稳定剂的作用。
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
3、DNA 探针的固定及杂交
将 修 饰 好 的 SWNTs － DA/GCE 电 极 浸 泡 在 100 μL1.0×10-7mol/L 探针 DNA(S1) 中 12 h，使修饰 电极表面的醛基和 S1 末端的氨基发生胺醛缩合 反 应 ， 随 后 将 该 电 极 浸 入 1.0×10-7mol/L 的 NaBH4中1h，除去未固定的S1，得到S1/SWNTs －DA/GCE 探针 DNA 修饰电极。将 S1/SWNTs －DA/GCE 浸入不同浓度的互补链 DNA(S2) 杂 交液中于42℃下反应40 min，取出后用 TE 洗去 未 杂 交 的 S2 ， 得 到 杂 交 电 极 (S2 － S1/SWNTs － DA/GCE) 。
指导老师：顾婷婷 制 作 人： 李 霞
DNA电化学传感器原理及结构
DNA生物传感器基本的原理是DNA碱基的互补配对， 通过电极表面固定的已知捕获DNA序列与检测样本中 DNA的互补配对作用形成可传递电子的双链DNA ， 从电极上电信号的变化来对样本中的DNA进行定性检 测，当加入样本中的DNA序列与捕获探针上的序列存 在非配对现象，则电子传递链断开，产生的电信号就 很微弱，因此通过电信号变化就可以检测出样本中是 否存在突变。 DNA电化学传感器一般是由敏感元件即 生物敏感膜、转换元件即转换器、信号输出三个部分 组成。其中敏感元件和转换元件是生物传感器最主要 的两个部分。
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
传感分析
不同序列 DNA 的电化学检测
S1/SWNTs － DA/GCE 与 互 补 序 列 S2(b) 、 非 互 补 序 列 S3(c) 和 三 碱 基 错 配 序 列 S4(d)杂交的差示脉冲伏安图
b所得的电化学信号与探针DNA修饰电极(a)几乎一致，表明无杂 交反应发生。而当传感器与三碱基错配序列(c) 和完全互补序列(d) 杂交后，随着目标DNA与探针DNA发生杂交程度的增大，DNA 双链骨架逐渐形成，其嵌插 MB 的作用越大，峰电流值也依次增 大。表明制备的 DNA 电化学探针能有效识别完全互补和非互补 DNA 序列，显示了很好的选择性。
实验步骤： 1、SWNTs-DA 复合材料的制备 2、修饰电极的制备 3、DNA 探针的固定及杂交 4、MB 的富集及检测
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
1、SWNTs-DA 复合材料的制备
取 0. 5 mg SWNTs 加入至1 mL 无水乙醇中超 声分散得到 0. 5 g/L SWNTs 分散液; 另取100 μL( 4. 6mol /L) 十二醛( DA) 与 100 μL 无水 乙醇混合得 2. 3 mol / L DA 溶液。取 50 μL 0. 5 g / L SWNTs 分散液与50 μL 2. 3 mol / L DA 溶液混合，摇匀后，超声分散 3 h，得到黑色 均匀的 SWNTs － DA 复合材料分散液，备 用。
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
实验原理
将单壁碳纳米管(SWNTs)和十二醛(DA)混合超声分散， 得到均匀、稳定的无机－有机纳米复合材料(SWNTs－ DA)。将其滴涂在玻碳电极表面晾干得到复合材料修饰
电极(SWNTs－DA/GCE)，再通过胺醛缩合反应将末端
修饰氨基的单链DNA探针共价固定在SWNTs－DA/GCE 表面，构建了一种新型的DNA电化学传感器。以六氰合 铁络合离子[Fe(CN)6]3-/4-为电活性探针，采用循环伏安法 和电化学阻抗法对传感器的层层组装过程进行表征。以 亚甲基蓝(MB)作为杂交指示剂，考察了传感器分析性能
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
六氰合铁络合离子[Fe(CN)6]3-/4-
[Fe(CN)6]3-六氰合铁络合离子，Fe是+3价 [Fe(CN)6]4-六氰合亚铁络合离子，Fe是+2价
由于DNA杂交产生的电流信号比较微弱，因而需要 加入一些具有电活性的物质来提高仪器的敏感性。指 示 剂 是 一 类 可 以 与 ssDNA 或 者 dsDNA 以 不 同 方 式 相 互作用的电活性物质，其电活性可以使检测物质的电 信号增大，提高检测灵敏度。
SWNTs－DA 复合物的制备( A) 及 DNA 电化学传感器的 检测示意图( B)如下：
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
实验部分
三电极系统： 玻碳电极或各修饰电极为工作电 极， Ag / AgCl 电极为参比电极， 铂丝电极为辅助电极。
六氰合铁络合离子 [Fe(CN)6]3-/4- 可作电活性探针。
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
亚甲基蓝(MB)
亚甲蓝（Methylene blue），又称亚甲基蓝、 次甲基蓝、次甲蓝、美蓝、品蓝、甲烯蓝、 瑞士蓝（Swiss blue），国际非专利药品名称 (INN)为methylthioninium chloride。是一种 芳香杂环化合物。MB是一种水溶性多核芳烃 染料(典型的服用吩噻嗪染料),它在不同电极 表面上电催化活性都很高。常被用作化学指 示剂、染料、生物染色剂和药物使用。MB作 为蛋白质的稳定剂应用于电化学作为杂交指 示剂。
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
传感分析
目标序列的定量检测
为MB在不同浓度互补序 列(S2)杂交电极上的差示 脉冲伏安图 氧 化 峰 电 流 Ip 与 浓 度 对 数 lgcS2作图（插图）
随着S2浓度的升高，氧化峰电流值逐渐增大，说明MB在电极表 面的吸附量越来越大。这是因为随着S2杂交浓度的提高，电极表 面形成的双螺旋DNA量增大，通过嵌插作用和静电作用结合了 更多MB分子。氧化峰电流Ip与浓度对数lgcS2作图，表明该传感 器能在宽浓度范围内对互补序列进行定量分析，且具有较高的灵 敏度。
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传感分析
MB 的电化学行为
不同扫速下 5.0 ×10-5mol/L MB 溶液在S1/SWNTs－ DA/GCE 上的循环伏安图
由图可知，MB 在探针 DNA 修饰电极上具有 1 对明 显的氧化还原信号，表明 MB 在传感器表面具有良好 的电化学响应。 随着扫速增大，氧化还原峰电流值逐渐增大。这是因 为扫速越大，达到相同电位所需的时间越短，扩散层 越薄，扩散流量越大，所获得的电流也越大。
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
2、修饰电极的制备
将玻碳电极依次用粒径为1.0、0.3 和 0.05 μm 的 α-Al2O3 抛 光 粉 打 磨 成 镜 面 ， 每 次 抛 光 后 先 用 DDW（二次蒸馏水）洗去表面污物，再依次用 HNO3溶液、乙醇溶液、DDW 超声清洗，得到 活化干净的裸 GCE。在预处理好的裸GCE上滴 加 10 μL SWNTs－DA 分散液，自然晾干，用水 淋洗表面未固定的复合材料，自然晾干后即制得 修饰玻碳电极(SWNTs－DA/GCE) 。采用相似方 法制备了 SWNTs 和 DA 单成分修饰电极，分别 记为 SWNTs/GCE 和 DA/GCE。
不同修饰电极的电化学表征
采用循环伏安法(CV) 对电极的修饰过程进行表征 a.GCE；b.SWNTs/GCE；c.DA/GCE；d.SWNTs－DA/GCE
[Fe(CN)6]3-/4-在SWNTs/GCE上的氧化还原峰电流值明显增大，产生这种 现 象 的 原 因 是 由 于 SWNTs 的 电 化 学 催 化 活 性 高 ， 有 效 地 提 高 了 [Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的电子传导速率。而当裸 GCE 电极表面修饰上 DA后(曲线c)，未观察到[Fe(CN)6]3-/4-在DA/GCE电极上产生任何氧化还 原信号，表明由于DA的非导电性完 全 抑 制 了 [Fe(CN)6]3-/4- 在 电 极 表 面 的电子传递过程。相反地，在 SWNTs－DA 复合材料修饰电极上， 背景信号较DA/GCE有了很大提高 (曲线d)，同时氧化还原电流明显增 大，说明由于SWNTs的高导电性， 使得复合物修饰电极的表面电子传 导能力显著增强。
基于单壁碳纳米管--十二醛复合材料的DNA 电化学传感器
4、MB 的富集及检测
将 S1/SWNTs－DA/GCE 放5.0×10-5mol/L MB 溶液中，富集 45 min，取出用 pH 6.86 的 PBS（ 磷酸盐缓冲溶液）空白溶液淋洗，再将电极置于 空白 PBS 缓冲溶液中进行循环伏安 (CV) 和电化 学阻抗法 (DPV) 测定。