去内毒步骤

自己注意前后衔接

无内毒质粒提取按照Omega E.Z.N.A. TM Endo-free Plasmid Mini Kit I操作方法进行。

1. 将带有目的质粒的E.coli 接种于裝有5 ml LB/氨苄青霉素的10-20ml的培养管，37℃搖床培养12~16 h，以扩增质粒。用一个10-20ml培养管或培养瓶，其体积至少有培养基的4倍。

2. 取1.5~5.0 ml的菌液，于室温下10,000 x g离心1min以沉淀菌种。

3. 倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250 μlSolutionⅠ/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。

4. 往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10次。室温静置裂解2min，避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。

5. 往上述混和液中加入125 ul 冰浴Buffer N3，并温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。

6. 室温下，≥12000 x g离心10min。

7. 小心将上清倒入干净的1.5ml离心管中，加入0.1倍体积的ETR溶液（蓝色）至上清液中，颠倒试管7-10次，然后于冰浴中静置10 min观察溶液的变化，即在加入ETR溶液后，裂解液可能出现浑浊，但冰浴后将逐渐转为澄清。

8. 将上述裂解液于42℃水浴静置5 min。裂解液又将再次出现浑浊。此时，立即于25℃，12000 x g离心3min， ETR溶液将在试管底部形成蓝色分层。

9. 将上清液移至另一新的1.5 ml离心管中，加入1/2倍体积室温的无水乙醇，轻轻颠倒试管6-7次，室温放置1-2 min。

10. 取一干净的HiBind Mini Columns(I)裝在一个2 ml收集试管上(已备)。小心吸出上清，取700 ul样品溶液将其转至于柱子內，于室温下10,000 x g离心1min，使裂解液完全流过柱子。

11. 弃去收集管种的滤液，将剩余的样品溶液转移至柱子中，于室温下10,000xg离心1min，使裂解液完全流过柱子，弃滤液。

12. 把柱子重新装在收集管中，加入500μlHBBuffer柱子上，室温下10,000xg 离心1min洗涤柱子，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所需的高质量DNA。

13. 弃去收集液，加入700μl DNA Wash Buffer (用无水乙醇稀释的)洗涤柱子，室温10,000xg离心1min，弃去洗涤液。

14. 重复步骤13，再用700μl的 DNA洗涤缓冲液洗涤柱子一次。

15. 室温下最高速（≥13,000xg）离心空柱2min以彻底除去乙醇。

16. 把柱子置于一干净的1.5ml小离心管上，敞开管口，待酒精完全挥发后，加入30~50μl Elution Buffer到柱子基质上，室温下静置2min。≥13,000xg离心1min以洗脱出DNA。