3-Crystal Structure of Human Enterovirus 71
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人类肠病毒71的晶体结构
人类肠道病毒71型是一种引起手足口病的小RNA病毒，会在儿童中引起可能致命的脑肿胀和瘫痪。
据报道，EV71在亚太地区大规模爆发，对公众健康是一种很大的威胁。
我们已经从3.8埃分辨率研究EV71的结构。
有准T = 3的对称性的病毒结构蛋白VP1，VP2，VP3 60份，β夹心“果冻卷”褶皱。
此外，一个小蛋白VP4的60份附于外壳的内表面（图1A）EV71型病毒基因组编码多肽VP1，VP2，VP3，VP4，构成原聚体。
原聚体拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位连接最终形成病毒的外壳。
VP1，VP2，VP3暴露在病毒外壳的表面，VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接。
EV的一个普遍特征是在二十面体的五重轴周围有一个洼地叫“canyou”受体，其有一个免疫球样折叠连接到canyou 上。
这导致可稳定病毒粒子的疏水性的“口袋因子”从canyou下面的VP1的口袋里迅速去除。
这种不稳定可能是基因组释放的前奏。
以高亲和力连接在口袋上的抗病毒复合物是潜在的小RNA病毒抑制剂。
EV71电子密度表明口袋因子的存在。
口袋因子被建模成月桂酸。
口袋因子电子密度的高度和周围蛋白残基相当。
小RNA病毒粒子最易变的区域是暴露在病毒粒子表面的环，这也是最重要的中和产生免疫性的位点。
VP1表面的环定位在二十面体五重轴的周围，形成canyou的北边缘（fig1A）。
EV71的canyou比其他EV中的都浅，因为它的VP1环更小（fig1B）。
EV71canyou的开放结构显示它不能为定位在canyou底部的残基提供免疫隔离，因而也不太可能担当受体的结合位点。
因而，已经被认为是EV71受体的分子没有免疫球蛋白样的折叠是很重要的。
在VP2中，最突出的表面环是“puff”，形成canyou的南边缘。
病毒表面最大的突出物是来自VP3的“knob”（fig1A）。
puff和knob区域连接到非免疫球蛋白样受体在一些其他的小RNA病毒中。
Puff中149位Lys被表明和P选择素糖蛋白配基1相互作用。
通过和其他的小RNA病毒类比，（fig1c）EV71中口袋因子的存在显示它调控病毒脱壳过程。
EV71口袋因子有大约40平方埃表面可接近溶剂，而其他EV中的口袋因子完全被埋在溶剂中。
因为EV71口袋因子头部和canyou上面的极性残基相互作用，抗EV71复合物可能需要一个疏水的头部组合，相反，其他小RNA病毒的抑制子完全疏水，并且不和形成canyou floor的残基相互作用。
这个信息使得EV71疗法的药物设计成为可能。
EV71病毒衣壳的结构。
（一）EV71的VP1二十面体的不对称单位显示卡通图（蓝色），VP2，VP3（绿色）（红色），VP4（黄色）钙离子（红色）和口袋因子（橙色）。
其突出的特点是衣壳表面的位置用虚线表示。
（b）EV71和五单位视下二十面体对称五倍轴脊髓灰质炎病毒分子表面。
（C）肠道病毒71口袋因子电子密度（绿色）是由无模型的相位扩展计算（3）。
主要表现为连接链Cα原子线。
侧链显示为“模型。
（d）在肠病毒71型口袋位置的因素（橙色），hrv1a（黄色），牛肠道病毒（绿色），脊髓灰质炎病毒1（红色）。
（C，D）箭头显示的口袋入口
Materials and Methods
材料和方法
病毒生产，结晶和结构测定
my104-9-sar-97 EV71毒株（10）（GenBank登录号：dq341368.1）在横纹肌肉瘤细胞产生。
细胞和病毒上清感染后4天收获。
细胞通过离心分离沉淀在10分钟时贝克曼ja-10转子和溶解的冻结和解冻好几次其次是杜恩斯匀浆。
病毒是通过离心分离沉淀，在45000rpm
在ti50.2转子在4C 2小时。
颗粒病毒悬浮在缓冲液（0.25m HEPES，0.25M NaCl，pH 7.5），
经DNA酶（0.01毫克/毫升）和核糖核酸酶（7.5毫克/毫升）进一步纯化在10-40%酒石酸钾梯度在4C 90min在sw41转子36000rpm。
纯化的病毒颗粒是悬浮在缓冲和病毒的浓度用分光光度计使用7.7毫克吸收系数测量/（毫升×厘米）260nm波长。
使用一个好的溶液含有2.5%悬滴法得到的晶体的EV71（w/w）PEG 800，2.5%（w/w）甘油，600mm 150mm NaCl，CaCl2，100mM Tris pH 8。
通过混合1.5升的井液μ数据收集在缓冲区的10mg／ml病毒液等体积法制备滴，晶体浸泡在含有30%的母亲白酒类1-2分钟（w/w）PEG 400并立即在液氮中冷冻。
数据收集从一个单一的晶体在100K（借用marccd-225探测器通用/ CA猫）在beamline-14-id在先进光子源
EV71病毒结晶的空间群I212121（补充表1）。
马太的系数表明，不对称单位中有2个粒子。
（11）粒子的取向和位置是（ψºφ= 68.8 = 42.8，= 45.9º，κº，x = 0.2501，y = 0.2530，Z = 0.2479）的粒子1和（ψºφ= 87.4 = 24.8，ºκ= 77.4，X = 0.5020，Yº，= 0.4967，Z = 0.5001）的粒子2。
埃可病毒7结构（12）（蛋白质数据银行加入代码2x5i）是用来计算的分辨率低于10Å用CNS程序初始阶段的思考（13）。
通过迭代分辨率3.8Å步骤得到的相位信息（1／C）1遵循Å每次通过三个周期的平均密度（14）。
地图计算的结构振幅的125 2 B因子应用改良Å。
结构使用程序建立（15）进行坐标和温度因子细化用CNS程序。
如果计算，rfree已工作很相似，因为120倍的非晶体学对称性（16）。
基本结构质量指标表 S1上市。
虽然观察到的数据是有效的采样每个倒格点的平均14倍120倍而不完全非晶的冗余结果。
Table S1.
Scaling and refinement statistics
Space group I212121
Unit cell dimensions (Å)
A600.2
B610.6
C851.8 Resolution limits (high resolution bin) (Å)50-3.8 (3.97-3.80) Completeness (%)30.4 (11.5)
R merge*0.24 (0.79) Average redundancy 1.7 (1.1)
<I>/<σI> 2.41 (0.88) Reciprocal space correlation coefficient of F obs and F calc after
convergence of map0.82 (0.47)
R-factor0.279 (0.386) Average B-factor79.2 Ramachandran plot outliers (%) #0.97 Ramachandran plot - most favored regions (%) #87.0
Rotamer outliers (%) #0.85
RMSD - bonds (Å)0.003
RMSD - angles (°)0.93
No. of unique reflections459113
* R merge= ∑h∑j |I hj - <I h>| / ∑∑|I hj|
# according to the criterion of Molprobity。
