可溶性丝素蛋白溶液脱盐技术

丝素蛋白提取工艺
丝素蛋白是一种从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有优异的功能和生物相容性。

工艺如下：
准备原料：将蚕茧或下脚茧丝在沸水中脱胶，得到丝素纤维。

将丝素纤维溶入乙醇溶液中，两者固液比为1：20，调节pH值为8.2-8.7，静置60-150min，然后过滤得到滤液。

将滤液调节pH值为5.8-6.4，静置70-120min后，以转速3500-5000r/min离心15-25min，得到丝素蛋白粗提取物。

取蛋白粗提取物加入去离子水，调节pH为8.2-8.7，加入24份碱性蛋白酶，在温度45-55℃酶解24h。

随后在温度85-95℃下灭酶10-20min得到酶解液。

将酶解液继续减压浓缩至原溶液的8-15%，在温度25℃冷冻干燥，粉碎后即可得到所述丝素蛋白粉。

这种提取工艺简单、安全、有效，所得丝素蛋白具有较高的纯度和生物活性，可用于制备人工器官、生物材料、药物载体等。

需要注意的是，该工艺仅为其中一种方法，具体实施时可能需要根据实际情况进行调整和优化。

蛋白质脱盐——凝胶过滤法【实验目的】了解凝胶过滤层析技术的工作原理，掌握凝胶过滤层析技术，获得脱盐后的目的蛋白质溶液【实验原理】目的蛋白质用盐析法从细胞裂解中沉淀分离后，其中尚有大量的硫酸铵，需要脱盐才能获得较纯的样品。

常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。

透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。

凝胶过滤层析脱盐过程中盐分子和蛋白质分子大小差异巨大，蛋白质溶液中小分子的盐分子随着层析流动相进入孔径较小的固定相致辞使其在层析中的迁移速率小，而蛋白质因分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相中，因此在层析柱中的迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。

用凝胶过滤法脱盐时，为了使盐同蛋白质充分地分离，除了应选用足够长的层析柱之外，还应对样品的体积加以限制。

样品的体积如果过大就导致蛋白质带同盐带不能分开。

一般来就，样品体积不超过床体积的30%。

这一数据的确定是根据盐和蛋白质的分离体积（Vsep）决定的。

两种物质分离体积的定义为，当两种物质的混合物在凝胶过滤层析柱上能够完全分离时的最小体积（参看图一）。

它在数值上等于：Vsep=V eB-V eAC1/2 V由于种种原因（例如样品在柱中的微小振动、固定相和流动相之间的不平衡，样品在柱中发生的纵向扩散等），产生的洗脱峰总是比理论值要宽得多。

如果上柱用的样品体积等于Vsep时，由于上述原因，两种物质的洗脱曲线会重叠造成分离失败（如图二所示），因此，上样体积应Vsep，但是上样体积过小会造成样品过度稀释。

为了提高脱盐样品的得率，上样体积一般15-20%床体积。

一般脱盐层析柱，应为粗短型柱，以提高脱的工作效率。

用凝胶过滤层析技术对白质溶液进行脱盐处理时，样品的浓度对分离效果，没有影响，但是，如果样品浓度过大，就会造成样品粘度增大，引起层析带和洗脱速率不稳定，造成洗脱曲线变宽和扭曲。

在选用洗脱液时，应考虑蛋白质的稳定性和蛋白质同层析介质之间的非特异性吸附作用，所以一般选用离子强度大于0.02的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，如果脱盐后的蛋白质溶液要进行冷冻干燥处理时，应选用可以挥发的缓冲物质制备洗脱液，例如，乙酸铵、碳酸氢铵、乙酸乙烯二胺盐等。

28精细石油化工进展ADVANCES IN FINE PETROCHEMICALS第21卷第6期图1膜分离的基本原理与分类收稿日期:2020 - 09 - 07。

作者简介：曹媛，硕士，研发和设计工程师，主要从事精制分 离提纯领域的研究工作。

碱对离子交换树脂再生处理，会产生大量废酸废 碱污水。

在处理高盐溶液时，这点尤为突出；需要 对设备做防腐处理，运行费用高;且离子交换法阀 门繁多，对操作人员的要求较高，一旦操作不当, 会加大废酸废碱排放量。

以木糖生产中水解液的离子交换脱盐为例，每生产1 t 固体木糖需要使 用约2 ~3 t 酸和碱;通常情况下，一个10 000 t/a 的木糖生产线，高浓度的废水量约8 000 ~ 10 000 m3/d [3]。

随着环保力度的加大，废水处理成本的 增高，离交法脱盐技术的发展和应用面临挑战。

1.2膜分离法膜分离是指混合物在通过有孔的半透膜时，因 各组分粒径大小不同，部分较小粒径分子透过，较 大粒径分子被截留，从而实现选择性分离技术。

显 而易见，膜分离法更适用于分子量差距较大的物质 分离。

膜的功能和种类繁多，难用一种方法来明确 分类[121。

根据膜孔径大小一般可以分为:微滤膜 (1^)、超滤膜（1^)、纳滤膜（邮）、正/反渗透膜 (F0/R 0),膜分离的基本原理与分类见图1。

在工业生产中，为降低或消除溶液所含各种 盐类、游离酸和碱的处理方法一般都统称为脱 盐[1]。

在精细化工、食品与制药[2]、糖与糖醇生 产[3]、生物发酵与植物提取[4_5]、净化水制备[1’6] 等行业中，脱盐都是必不可少的生产过程。

脱盐 不仅要对产品精制提纯，以符合其产品标准和品质 要求;还可减少工业废水的排放，降低环境污染。

现有常用的脱盐方法包括:离子交换树脂法，膜分 离法（主要包括反渗透法和纳滤膜分离法）、电渗 析法、热分离法[7](如蒸馏法、蒸发脱盐[8]和冷却 冷冻法等）、沉淀离心法[8]、色谱脱盐[9]、微生物脱 盐法[W ]等。

蛋白质脱盐方法的介绍
蛋白大分子脱盐要求在样品制备中经常遇到，选择合适的脱盐方法显得非常重要。

在蛋白回收率、脱盐效率、蛋白生物活性、操作难易程度、耗时等方面需要综合考虑，找到合适的脱盐方式。

蛋白质用盐析法从细胞裂解中沉淀分离后，其中尚有大量的硫酸铵，需要脱盐才能获得较纯的样品。

常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。

透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。

凝胶过滤层析脱盐过程中盐分子和蛋白质分子大小差异巨大，蛋白质溶液中小分子的盐分子随着层析流动相进入孔径较小的固定相致辞使其在层析中的迁移速率小，而蛋白质因分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相中，因此在层析柱中的迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。

一般脱盐层析柱，应为粗短型柱，以提高脱的工作效率。

用凝胶过滤层析技术对白质溶液进行脱盐处理时，样品的浓度对分离效果，没有影响，但是，如果样品浓度过大，就会造成样品粘度增大，引起层析带和洗脱速率不稳定，造成洗脱曲线变宽和扭曲。

丝素蛋白的水解方法可以使用多种方法，以下是其中两种常见的方法：
1.酸性水解法：
a. 将丝素蛋白加入酸性溶液中，常用的酸包括盐酸（HCl）或硫酸（H2SO4）。

b. 在适当的温度下搅拌反应混合物，通常在酸性条件下进行几小时到一天。

c. 将反应混合物中的无溶解物通过过滤或离心分离。

d. 获得的水解产物可以进一步纯化、干燥和使用。

2.酶解法：
a. 将丝素蛋白与适当的水解酶（如胰蛋白酶、粗木质素酶等）反应。

b. 在适宜的温度和pH条件下进行酶解反应，时间根据需要可长达数小时到数天。

c. 停止酶解反应，通常通过加入酶抑制剂或改变反应条件。

d. 滤除未水解的残渣，并进一步处理和提取所需的水解产物。

这些方法都可根据具体的实验目的和要求进行优化和调整，以获得所需的丝素蛋白水解产物。

再生丝素蛋白溶液脱盐新工艺及其应用李鹏飞;邓桦;马军;刘红斌;刘珍珠【摘要】为提高丝素蛋白溶液的脱盐效率,降低脱盐能耗,采用扩散渗析电渗析集成膜分离技术对丝素蛋白溶液进行脱盐,并初步探索所得溶液的应用.研究了丝素蛋白溶液质量分数和扩散渗析预脱盐率对脱盐效率和能耗的影响,同时将所得丝素蛋白溶液加入无水乙醇制备不溶性丝素蛋白粉,测定了产品氨基酸的组成并利用扫描电子显微镜对丝素蛋白粉进行表征.结果表明:最佳的脱盐技术参数为丝素蛋白溶液质量分数为5%、扩散渗析预脱盐率为40%,在此工艺条件下脱盐时间缩短至9 h,能耗(动力能耗除外)为3.81×10 -2kW·h/L;产品中丝氨酸和甘氨酸含量接近50%,丝素蛋白粉末粒径较小且分布均匀.%In order to improve the efficiency and reduce the energy consumption in the desalination of fibroin solution,the diffusion dialysis and electrodialysis membrane separation technique were applied to the desalination process, and the application properties of the silk fibroin solution were preliminarily explored. Factors affecting the desalting efficiency and energy, such as the concentration of silk fibroin and the pre-desalination rate were investigated. Moreover the insoluble silk fibroin powder was prepared by adding anhydrous ethanol to the silk fibroin solution, the amino acid composition of the product was determined and the silk fibroin powder was characterized by scanning electron microscopy. The results show that the optimal parameters for desalting is 5% of the concentration of silk fibroin and 40% of the pre-desalination rate. Under this condition, the desalination time is shortened to 9 h and the energy consumption(except dynamic power consumption)is3.81×10 -2kW·h/L; the total content of serine and gl ycine in the product is close to 50%, and scanning electron microscopic results show that the particle size of the powder is smaller and the distribution is uniform.【期刊名称】《纺织学报》【年(卷),期】2018(039)005【总页数】5页(P20-24)【关键词】丝素蛋白;脱盐工艺;扩散渗析;电渗析;丝素蛋白粉【作者】李鹏飞;邓桦;马军;刘红斌;刘珍珠【作者单位】天津工业大学纺织学院,天津 300387;天津工业大学纺织学院,天津300387;军事医学科学院卫生装备研究所,天津 300161;军事医学科学院卫生装备研究所,天津 300161;天津工业大学纺织学院,天津 300387【正文语种】中文【中图分类】TQ028.8蚕丝主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，其中丝素蛋白作为核心纤维占总质量的75%左右，是提供蚕丝力学性能并且使蚕丝表现出多种优点的主要成分[1]，正逐步应用于化妆品、医学[2]和生物等多个领域。

一种丝素蛋白的制备方法引言丝素蛋白是一种具有广泛应用前景的生物材料，它具有出色的力学性能、生物相容性和生物可降解性。

丝素蛋白的制备方法对于其在医学、纺织品、食品等领域的应用具有重要意义。

本文将介绍一种基于生物法提取和纯化的丝素蛋白制备方法。

实验步骤1. 丝素蛋白原料的准备：选择新鲜的蚕茧作为丝素蛋白的原料。

将蚕茧洗净并晾干。

2. 蚕茧脱胶：将蚕茧浸泡在去离子水中，用微波加热或酶法处理蚕茧，将蚕丝蛋白分离出来。

采用酶法时，可以选择较为常用的硫酸盐酶法。

3. 过滤和沉淀：将分离得到的丝素蛋白溶液进行过滤，以去除杂质。

然后使用浓度适宜的醋酸沉淀蛋白质。

4. 洗涤和干燥：将沉淀物用去离子水进行洗涤，以去除残留的醋酸。

洗涤完成后，在通风干燥的条件下将丝素蛋白沉淀干燥。

5. 纯化：采用凝胶过滤、离子交换、透析等技术进行丝素蛋白的纯化。

通过这些步骤可以去除掉蛋白溶液中的杂质，提高丝素蛋白的纯度。

6. 蛋白定量：采用Lowry法、Bradford法或Biuret法等蛋白定量方法，确定丝素蛋白的浓度。

7. 可选择性修饰：根据需要，可以对丝素蛋白进行一定的化学修饰，如酯化、甲酰化等，以增强其特定性质。

8. 储存条件：将制备好的丝素蛋白储存在干燥、低温的环境中，以保持其稳定性和活性。

结果与讨论本制备方法采用了生物法提取丝素蛋白，相较于传统的化学提取方法，具有无毒性、低成本、环境友好等优点。

制备出的丝素蛋白纯度较高，且力学性能良好，能够满足不同领域的需求。

结论本实验成功地展示了一种基于生物法提取和纯化的丝素蛋白制备方法。

通过合理的实验操作步骤，蚕茧中的丝素蛋白可以被高效地提取和纯化，为丝素蛋白的应用研究提供了可行的方法。

参考文献1. Kundu, B. et al. Silk proteins for biomedical applications: Bioengineering perspectives. Progress in Polymer Science, 59, 153-193 (2016).2. Nurkeeva, Z. S. et al. Technology of silk fibroin powder production as obtained from silkworm cocoons. International Journal of Biological Macromolecules, 113, 50-56 (2018).3. Vijayavenkataraman, S. et al. Versatile applications of silk fibroin-based biomaterials for biomedical engineering. Biosensors and Bioelectronics, 141, 111478 (2019).。

蛋白质质谱如何脱盐？蛋白质质谱是一种常用的生物分析技术，可以帮助科学家研究蛋白质的结构和功能。

然而，在进行蛋白质质谱分析之前，通常需要将样品中的盐类去除，以避免干扰质谱信号。

本文将介绍蛋白质质谱脱盐的方法步骤，帮助读者更好地理解这一过程。

1. 胶束吸附法胶束吸附法是一种常见的蛋白质脱盐方法。

该方法利用胶束的特性，将盐类吸附在胶束表面，从而实现蛋白质的脱盐。

具体步骤如下：准备一种适当的胶束溶液，如十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。

将待脱盐的蛋白质样品与胶束溶液混合，并充分搅拌。

离心样品，使胶束与蛋白质沉淀。

将上清液转移至新的离心管中，即可得到脱盐后的蛋白质样品。

胶束吸附法的优点是操作简单，适用于大多数蛋白质样品。

然而，该方法可能会引入胶束残留物，对后续实验产生干扰。

2. 水合剂沉淀法水合剂沉淀法是另一种常用的蛋白质脱盐方法。

该方法利用水合剂与盐类形成复合物，从而使蛋白质与盐类分离。

具体步骤如下：准备一种适当的水合剂，如聚乙二醇（PEG）溶液。

将待脱盐的蛋白质样品与水合剂溶液混合，并充分搅拌。

将混合物置于低温环境中，使水合剂与盐类结合形成沉淀。

离心样品，将上清液转移至新的离心管中，即可得到脱盐后的蛋白质样品。

水合剂沉淀法的优点是能够有效去除大部分盐类，适用于对盐敏感的蛋白质样品。

然而，该方法可能会引入水合剂残留物，需要进一步的处理步骤。

3. 水质谱法水质谱法是一种高效的蛋白质脱盐方法，利用质谱仪的特性将盐类与蛋白质分离。

具体步骤如下：将待脱盐的蛋白质样品溶解于适当的溶剂中，如水或有机溶剂。

将样品注入质谱仪中，利用质谱仪的分离功能将盐类与蛋白质分离。

收集质谱仪输出的蛋白质信号，即可得到脱盐后的蛋白质样品。

水质谱法的优点是操作简单、高效，并且不引入任何残留物。

然而，该方法需要使用质谱仪设备，成本较高，不适用于所有实验室。

4. 离子交换法离子交换法是一种常用的蛋白质脱盐方法，利用离子交换树脂将盐类与蛋白质分离。

【请教】丝素的溶解问题溶解丝素的盐一般采取中性盐，常用CaCl2，也可用LiBr、LiSCN、MgNO3、ZnCl2等高浓度盐溶液，与水、乙醇按比例配置溶液。

不同盐溶解的丝素质量、分子量、性能等都有差异。

脱盐方法主要有透析袋透析、中空纤维膜超滤、电渗析或凝胶过滤层析等方法。

用中空纤维超滤脱盐法脱盐，时间短、批量大、脱盐效率高，同时浓缩了丝素溶液，使之可以直接进行冷冻干燥或喷雾干燥制成丝素粉末；而用透析袋脱盐，则耗时长，批量少，费用高。

方法一：用1000g/L CaCl2水溶液溶解丝素纤维,溶解温度98℃,浴比1∶25,时间10min。

将溶解后得到的溶液灌入纤维素透析膜(截留分子量12 000~14 000)中,在流水中透析3d。

将透析后的溶液风干浓缩,得到丝素水溶液。

方法二：脱胶后的丝素在浓度为9.3M的LiBr溶液中于60℃溶解4h，得到20%的溶液。

将该溶液用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析2d。

丝素水溶液的最终浓度约为8%。

用x一射线光电子能谱检测此8%的丝素溶液制得的丝素膜内Li+离子的残留量，结果未发现残留Li+。

方法三：将丝素纤维用50%(质量与体积比)的CaCl2溶解丝素纤维,100℃煮沸10 min使丝素纤维全部溶解,冷却后透析72 h,得到无色透明丝素溶液。

浓缩至浓度为20%~30%。

方法四：将纯净的丝素放在50%(重量)氯化钙溶液中，98℃溶解10分钟(浴比1:25)。

最后，将该溶液注人纤维素透析管中，用蒸馏水透析3天。

将所得的丝素溶液浓度调节到1一10%(重量)。

方法五：用质量分数为50%的CaCl2水溶液溶解丝素纤维,溶解温度98℃,浴比1∶25,时间10 min。

将溶解后得到的溶液灌入纤维素透析膜(截留分子量12 000~14 000),在流水中透析3 d,然后将溶液风干浓缩,即得丝素蛋白(silk fibroin,简称SF)水溶液。

方法六：（兰州大学硕士学位论文中的方法）按摩尔比1：8：2配制CaCl2/H2O/EtOH三元混合溶剂，并用滤纸过滤，得到所需的澄清三元溶剂。

丝素蛋白溶液的制备流程如下：
1. 准备原料：购买丝素蛋白粉末，并准备所需的溶剂（一般为水或缓冲液）。

2. 称量：根据需要制备的溶液体积，按照一定比例称取适量的丝素蛋白粉末。

3. 溶解：将称取的丝素蛋白粉末加入溶剂中，用搅拌器或振荡器搅拌溶解，直至完全溶解。

4. 调整pH值：根据需要，使用酸或碱调整溶液的pH值，一般在中性或弱酸性条件下制备。

5. 过滤：使用0.22微米的滤膜过滤溶液，以去除杂质和微生物。

6. 灭菌：将过滤后的溶液进行灭菌处理，常用的方法有高温灭菌或紫外线照射。

7. 储存：将灭菌后的丝素蛋白溶液分装到无菌容器中，密封保存在4℃或低温冷冻保存。

注意事项：
- 在制备丝素蛋白溶液时，要注意避免溶液受到污染，使用无菌操作器材和环境。

- 在调整pH值时，要小心添加酸碱溶液，避免过量导致溶液pH值偏离目标范围。

- 在灭菌处理时，要确保灭菌方法能够有效杀灭溶液中的微生物，避免溶液受到污染。

- 在储存过程中，要注意避免溶液受到温度变化和光照，以保持溶液的稳定性和活性。

蛋白质脱盐方法蛋白质是生物体中重要的分子，对于研究其结构和功能具有重要意义。

然而，在进行蛋白质研究时，常常需要将蛋白质从混合物中分离出来，并去除其中的盐类。

这就需要采用蛋白质脱盐方法。

蛋白质脱盐是指通过一系列的操作步骤将蛋白质样品中的盐类去除，以便于后续的实验操作。

下面将介绍几种常用的蛋白质脱盐方法。

一、盐析法盐析法是一种常用的蛋白质脱盐方法。

它利用蛋白质在高盐浓度下溶解度降低的特点，通过控制溶液中的盐浓度，使蛋白质从溶液中沉淀出来。

盐析法操作简单，适用于大多数蛋白质。

盐析法的步骤如下：1. 将蛋白质溶液加入适量的高盐缓冲液中，使蛋白质溶解。

2. 缓慢加入低盐缓冲液，使盐浓度逐渐降低。

3. 盐浓度降低到一定程度后，蛋白质会出现沉淀，可以通过离心将沉淀物和上清液分离。

4. 将沉淀物溶解在适量的低盐缓冲液中，即可得到脱盐后的蛋白质溶液。

二、透析法透析法是一种利用半透膜将蛋白质与溶液中的盐类分离的方法。

透析法操作简单，适用于大分子量的蛋白质。

透析法的步骤如下：1. 将蛋白质溶液装入透析袋中，封闭袋口。

2. 将封闭的透析袋放入含有低盐缓冲液的容器中。

3. 通过半透膜的作用，蛋白质会逐渐从高盐浓度的溶液中透析到低盐浓度的溶液中。

4. 定期更换低盐缓冲液，直到蛋白质完全脱盐。

三、离子交换层析法离子交换层析法是一种利用离子交换树脂将蛋白质与溶液中的盐类分离的方法。

离子交换层析法操作相对复杂，但可以实现高效的蛋白质脱盐。

离子交换层析法的步骤如下：1. 将蛋白质溶液加载到预先平衡的离子交换树脂柱上。

2. 通过适当的缓冲液进行洗脱，将蛋白质与盐类分离。

3. 收集洗脱液中的蛋白质溶液，即可得到脱盐后的蛋白质。

四、超滤法超滤法是一种利用超滤膜将蛋白质与溶液中的盐类分离的方法。

超滤法操作相对简单，适用于小分子量的蛋白质。

超滤法的步骤如下：1. 将蛋白质溶液加入超滤装置中。

2. 施加适当的压力，使溶液通过超滤膜。

3. 盐类和其他小分子量物质会通过超滤膜排除，蛋白质则被滞留在超滤膜上。

可溶性丝素蛋白的功能性质
周凤娟;许时婴;杨瑞金;王璋
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】2007(028)011
【摘要】研究了可溶性丝素蛋白的功能性质.结果表明,丝素蛋白具有表面活性,能
降低溶液的表面张力;经高速剪切作用后,丝素蛋白的表面疏水性显著增强;随着丝素蛋白质量浓度的增加,丝素蛋白溶液的乳化性、起泡性均增强,当丝素蛋白质量浓度
大于5g/L时乳化能力增幅不明显,当丝素蛋白质量浓度为15g/L时,它的起泡能力
最高,质量浓度继续增加至20g/L时其起泡能力下降,当丝素蛋白质量浓度高于
15g/L时,泡沫稳定性的增幅变缓;丝素蛋白在pH3～10范围内具有较好的乳化性、起泡性,在pH4时最强.
【总页数】5页(P71-75)
【作者】周凤娟;许时婴;杨瑞金;王璋
【作者单位】天津大学农业与生物工程学院,天津,300072;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无
锡,214122
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.21
【相关文献】
1.纤维素酶法制备马铃薯渣可溶性膳食纤维的理化及功能性质 [J], 程力;张献梅;顾正彪;洪雁;李兆丰;李才明
2.可溶性丝素蛋白溶液脱盐技术 [J], 苏锋;杨瑞金;许时婴
3.可溶性丝素蛋白的流变性质和胶凝性质 [J], 周凤娟;许时婴;杨瑞金;王璋
4.黑小麦麸皮可溶性膳食纤维的提取及其功能性质研究 [J], 罗磊;张宽;王雅琪;马丽苹;朱文学
5.超声处理对黑豆蛋白与可溶性多糖复合物功能性质及结构的影响 [J], 朱颖;吴隆坤;贾有青;李哲;肖志刚
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第22卷第5期2003年9月 无锡轻工大学学报Journal of Wuxi U niversity of Light Industry Vol.22　No.5Sep.　2003　文章编号:1009-038X (2003)05-0057-04 收稿日期:2003-04-07;　修回日期:2003-05-19.作者简介:周凤娟(1974-),女,辽宁辽阳人,食品科学与工程博士研究生.脱盐过程中丝素蛋白缔合机理周凤娟,　许时婴,　王璋,　杨瑞金(江南大学食品学院,江苏无锡214036)摘　要:采用透射电子显微镜(TEM )、X 2射线衍射(X 2ray )、红外光谱(IR )、圆二色谱(CD )等测定了在脱盐过程中丝素蛋白分子构象的变化.随着丝素蛋白盐溶液脱盐率的增加,丝素蛋白分子从无规线团结构慢慢向β2折叠结构转变,导致丝素蛋白分子间发生缔合.关键词:丝素;缔合;机理中图分类号:S 886.9文献标识码:AStudy on the Mechanism of Aggregation of Silk Fibroin in Desalting ProcessZHOU Feng 2juan ,　XU Shi 2ying ,　WAN G Zhang ,　YAN G Rui 2jin(School of Food Science and Technology ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214036,China )Abstract :In this paper ,the conformational transition of silk fibroin in desalting process was studied by transmission electron microscopy (TEM ),X 2ray diffraction ,Infrared (IR )spectroscopy ,circular dichroism (CD ).With the increase in the desalted rate ,the conformation of silk fibroin changed from random coil to β2sheet ,leading to aggregation of silk fibroin.K ey w ords :silk fibroin ;aggregate ;mechanism 蚕丝的主要组分是丝素蛋白,研究表明,丝素蛋白具有很多生理功能,如促进胰岛素分泌、降低血液中胆固醇的含量、促进乙醇代谢、降压、防止衰老等[1].因此,丝素蛋白可以作为保健食品和药物的新资源.此外,丝素蛋白还是一种优良的化妆品添加剂[2].我国有充足的下脚茧和废丝等原料,其开发应用具有广阔的前景.天然丝素蛋白不溶于水,必须先制备成丝素蛋白溶液.一般采用高浓度的CaCl 2溶液溶解丝素蛋白,对制得的溶丝液进行脱盐处理即得到丝素蛋白溶液.当丝素蛋白盐溶液脱盐率达到一定程度时,丝素蛋白开始缔合,从溶液中析出丝素蛋白纤维.蚕的吐丝过程与丝素蛋白纤维化有相似之处,一般认为,蚕在吐丝过程中,液状丝素蛋白构象会发生转变,在稀水溶液中丝素蛋白呈无规线团构象,随浓度增加,构象逐渐转变成α2螺旋形式,蚕在吐丝时由于受到应力和脱水作用,最终形成不溶于水的β2折叠构象,形成丝素蛋白纤维.Yamaura 讨论了在不同搅拌速率下,再生丝水溶液生成的结晶丝素蛋白纤维的结构和产率,发现搅拌后的丝素蛋白构象由无规线团转变为β2折叠构象,证实了丝素蛋白纤维化过程是由于蛋白质在应力作用下产生变性引起的[3].作者主要研究丝素蛋白盐溶液在脱盐过程中丝素蛋白分子产生缔合,即丝素蛋白在脱盐过程中纤维化的机理.1　材料与方法1.1　材料与仪器废蚕丝(落绵):江苏海安茧丝绸集团股份有限公司提供;超滤器:北京中科膜技术开发中心产品,超滤膜的截留相对分子质量为5000.透射电子显微镜H 27000型:日本日立公司产品;圆二色谱仪J 715型:日本JASCO 公司产品;红外光分光光度计5D XB F TIR 型:美国Nicolet 公司产品;X 2射线衍射仪D/Mar 2IIIB 型:日本理学(Rigoku )株式会社产品;氨基酸自动分析仪Agilent 1100型:美国安捷伦公司产品.1.2　方法1.2.1　丝素蛋白盐溶液的制备1废蚕丝(落绵)除杂后,用质量浓度为5g/L 的Na 2CO 3溶液精练,除去蚕丝纤维上的丝胶蛋白.将精练后的蚕丝14g 加入到沸腾的100mL 质量分数为40%的CaCl 2溶液中进行溶解,控制溶解时间在2～5min ,制得的丝素蛋白盐溶液迅速冷却备用.1.2.2　丝素蛋白盐溶液的脱盐　由以上制得的丝素蛋白盐溶液进行离心和过滤后,采用超滤器脱盐,对脱盐过程中产生的丝素蛋白纤维进行真空干燥,制成粉末备用.1.2.3　Ca 2+浓度测定　ED TA 滴定法[4]1.2.4　脱盐率测定1脱盐率=[1-浓缩液中Ca 2+质量(g )/原料液中Ca 2+质量(g )]×100%.1.2.5　丝素蛋白分子超微结构测定　在丝素蛋白盐溶液脱盐过程中取不同脱盐率的丝素蛋白溶液1滴,置于铜网上,以锇酸蒸汽固定并干燥,将样品置于透射电镜下在加速电压为75kV 时进行观察、拍照.1.2.6　圆二色谱测定1丝素蛋白溶液质量浓度300μg/mL ,比色皿光径0.1cm ,分辨率0.2nm ,扫描速率为200nm/min ,扫描3次,测定远紫外区190～250nm 范围溶液的圆二色谱.1.2.7　红外光谱测定　丝素蛋白纤维粉末样品用K Br 压片,测定在波数4000～400cm -1的吸收光谱.1.2.8　X 2射线衍射测定　丝素蛋白纤维粉末在管电流20mA 、管电压35kV 、扫描速度10°/min 的条件下,用Cu K α射线在2θ=10°～40°范围内测定X 2射线衍射强度.1.2.9　丝素蛋白溶液的氨基酸组成分析1将脱盐率为98%的丝素蛋白溶液置于水解管中,加入6mol/L 的HCl 溶液,真空封口,在110℃下水解24h ,冷却后定容、过滤、蒸干;再加入0.02mol/L 的HCl 溶液,在空气中放置30min ,测定氨基酸的质量分数.2　结果与讨论2.1　脱盐过程中丝素蛋白的线性缔合图1是丝素蛋白盐溶液在脱盐过程中不同脱盐率的丝素蛋白的透射电子显微镜图.由图1可见,丝素蛋白分子在溶液中以纤维状存在,随着脱盐率增加,丝素蛋白分子聚集体的长度和宽度都逐步增加,说明在脱盐过程中丝素蛋白分子逐步产生线性缔合即分子间横向缔合和纵向缔合.随着脱盐率增加,丝素蛋白分子聚集体变得越来越长和越来越宽,脱盐率为91.5%的丝素蛋白溶液中丝素蛋白分子聚集体的长度和宽度是脱盐率为47.9%的丝素蛋白溶液的2倍左右,而脱盐率为97.1%的丝素蛋白溶液中丝素蛋白聚集体的长度和宽度是脱盐率为91.5%的丝素蛋白溶液的2倍左右(见表1).这说明脱盐率超过90%以后丝素蛋白分子间缔合程度加剧.a bca.脱盐率为47.9%(18000倍);b.脱盐率为91.5%(9000倍);c.脱盐率为97.1%(9000倍)图1　不同脱盐率的丝素蛋白溶液的透射电子显微镜图Fig.1　TEM micrographys of silk f ibroin solution with different desalted rate85 无　锡　轻　工　大　学　学　报 第22卷表1　不同脱盐率的丝素蛋白溶液中丝素蛋白分子聚集体的长度和宽度T ab.1　The length and width of silk f ibroin aggregation ofsilk f ibroin solution with different desalted rate脱盐率/%长度/μm宽度/μm47.9 5.22～7.670.056～0.2291.512.67～13.780.11～0.5697.124.55～26.670.11～1.112.2　脱盐过程中丝素蛋白分子构象变化蛋白质分子缔合是一个复杂的过程.当丝素蛋白分子线性缔合至具一定长度和宽度的丝素蛋白聚集体时,它不再溶解,从水溶液中析出,成为肉眼可见的丝素蛋白纤维.随着脱盐率增加,丝素蛋白溶液中丝素蛋白分子逐步缔合,当脱盐率达97.4%时,虽然肉眼尚未能观察到丝素蛋白分子的聚集体,但是从图1c 观察到丝素蛋白分子聚集体无论从长度或宽度都已大大增加,与此同时,丝素蛋白分子构象也发生了变化.图2是脱盐率为97.4%的丝素蛋白溶液的圆二色谱,由图可见,在195nm 附近有明显的无规线团构象的特征负峰出现,此外在214nm 附近也出现了β2折叠构象的特征负峰,但峰值较低,说明脱盐率达97.4%时,丝素蛋白分子构象以无规线团结构为主,但已有少量的β2折叠结构出现,这意味着部分无规线团结构松开,分子排列开始向有序方向转化.图2　脱盐率为97.4%的丝素蛋白溶液的圆二色谱Fig.2　CD spectrum of silk f ibroin solution of the desalt 2ed rate at 97.4% 脱盐率超过98.7%时,肉眼已明显见到丝素蛋白纤维形成.图3是丝素蛋白纤维的红外吸收光谱,1700,1640cm -1为酰胺I 的特征谱带,1525cm -1为酰胺II 的特征谱带,1237cm -1为酰胺III 的特征谱带,700cm -1为酰胺Ⅴ的特征谱带,是典型的β2折叠结构.这说明丝素蛋白分子构象已由无规线团向β2折叠结构转化,丝素蛋白分子间有序定向排列相互作用加强,分子间缔合形成不溶的丝素蛋白纤维.图3　丝素蛋白纤维粉末的红外吸收光谱Fig.3　IR spectrum of silk f iber powder 图4是脱盐率超过98.7%时,产生的肉眼可见的丝素蛋白聚集体即丝素蛋白纤维的X 2射线衍射图谱.从图4可以看出,丝素蛋白纤维粉末在2θ=20.04°附近出现较大的峰值,为丝素II 型的特征吸收[5],说明产生的丝素蛋白纤维的结晶状态为丝素II 型,分子结构以β2折叠结构为主,与红外吸收光谱的结果一致.图4　丝素蛋白纤维粉末的X 2射线衍射图谱Fig.4　X 2ray spectrum of silk f iber powder2.3　丝素蛋白发生缔合的机理探讨盐与蛋白质相互作用存在两种机制:一种是离子与蛋白质分子内部的极性基团的作用;另一种是离子改变溶剂的结构,以影响水分子与蛋白质极性侧链基团的相互作用,从而间接地影响蛋白质构象的稳定性[6].CaCl 2能降低丝素蛋白质的稳定性,促进蛋白质溶解,但CaCl 2溶解丝素蛋白质的确切机理尚未完全弄清.一般认为在室温时蚕丝蛋白质纤维的肽链处于冻结状态,当加入高浓度的CaCl 2溶液时,一方面数量众多的强极性离子产生较强的水化作用,使丝素蛋白质分子表面吸附大量的水,水是增塑剂,显著加强多肽链的运动,削弱了分子链间的范德华引力,伴随着氨基酸残基侧链间的氢键被破坏,溶剂化作用还使丝素蛋白质分子的多肽链部分发生断裂;另一方面,Ca 2+离子与丝素蛋白质中95第5期周凤娟等:脱盐过程中丝素蛋白缔合机理的极性氨基酸残基如酪氨酸、丝氨酸残基形成络合物,从而破坏了酪氨酸与肽链或其它残基之间的相互作用;由于丝素蛋白质的结晶区中也存在部分酪氨酸,因此这一破坏不仅影响了丝素蛋白质的非结晶区,同时也影响了丝素蛋白质的结晶区[7～8].然而,随着丝素蛋白溶液脱盐率的增加,丝素蛋白质分子逐渐发生了聚集,脱盐率超过98.7%时,蛋白质分子线性缔合形成具有一定长度和宽度的聚集体,并从溶液中析出,形成丝素蛋白纤维.这说明脱盐率较高即盐含量较少时丝素蛋白溶液处于不稳定状态,在外力作用下(如搅拌时产生的剪切力)很容易形成丝素蛋白纤维.表2为丝素蛋白质的氨基酸组成,丝素蛋白的非极性氨基酸残基的质量分数为36.2%,甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸占氨基酸质量的84%左右,甘氨酸、丙氨酸这些分子较小的氨基酸很容易通过疏水相互作用靠拢,使丝素蛋白分子发生聚集,形成结晶纤维.因此,推测在丝素蛋白纤维形成过程中,疏水相互作用是主要因素之一.表2　丝素蛋白的氨基酸组成T ab.2　Amino acid composition of silk f ibroin 氨基酸质量分数/%氨基酸质量分数/%天门冬氨酸 2.63异亮氨酸0.99苏氨酸 1.10亮氨酸0.76丝氨酸12.29酪氨酸9.19谷氨酸 2.03苯丙氨酸 1.17甘氨酸33.26赖氨酸0.32丙氨酸28.77组氨酸0.029半胱氨酸0.055精氨酸0.99缬氨酸 2.69脯氨酸 1.36蛋氨酸0.26色氨酸- 从产生的丝素蛋白纤维的红外光谱、X2射线衍射图谱可以判断其是典型的β2折叠结构.脱盐率为97.4%的丝素蛋白溶液的圆二色谱在214nm附近负峰的出现,说明丝素蛋白溶液在形成肉眼可见的纤维前已出现了β2折叠结构,表明丝素蛋白质分子形成纤维时,丝素蛋白分子以及丝素蛋白质和水之间存在氢键作用.除了氢键和疏水相互作用,静电相互作用对丝素蛋白纤维的形成也起一定作用.因为丝素蛋白质分子带同种电荷,分子间存在静电排斥,这对于维持蛋白质2水相互作用也是必需的.综上所述,丝素蛋白纤维的形成主要涉及疏水相互作用、氢键和静电相互作用,并通过聚集作用形成了结晶蛋白质纤维.3　结　论1)丝素蛋白分子在盐溶液中以纤维状存在,当脱盐率增加时,丝素蛋白分子聚集体的长度和宽度都增加,说明在脱盐过程中丝素蛋白分子间的缔合包括横向缔合和纵向缔合,当脱盐率超过98.7%时,肉眼已明显见到丝素蛋白纤维形成,并从溶液中析出.2)在脱盐率为97.4%的丝素蛋白溶液中,丝素蛋白质分子构象以无规线团为主,但有少量的β2折叠结构,随着缔合度增加,丝素蛋白分子构象发生了根本性的变化,由以无规线团结构为主转变为以β2折叠结构为主.3)脱盐率超过98.7%时,丝素蛋白溶液处于不稳定状态,在外力作用下(如剪切力)很容易析出丝素蛋白纤维.丝素蛋白纤维的形成主要是蛋白质分子间疏水相互作用,另外还有氢键和静电的相互作用.参考文献:[1]倪莉,王璋,许时婴.可溶性丝素粉末的制备[J].无锡轻工大学学报,2000,19(2):146-149.[2]张许昌,曹丽华.丝蛋白在化妆品中的应用[J].日用化学工业,1990,273:44-46.[3]Y amaur K.Mechanical denaturation of high polymers in solutions[J].J Macromolecules Sci phys,1982,B21(1):49-69.[4]浙江大学分析化学教研组.分析化学实验[M].北京:高等教育出版社,1992.[5]刘永成,邵正中,孙玉宇.蚕丝蛋白的结构和功能[J].高分子通报,1998,(3):17-23.[6]陶慰孙.蛋白质分子基础[M].北京:高等教育出版社,1981.[7]韩仓哲郎,中山信彦.家蚕 ∂ の盐化 水溶液中の溶解机构に关する13C,1Hぉょび43Ca NMRにょる研究[J].SEN2I G AKKASHI,1989,45(6):52-57.[8]Murase R.Part of tyrosine by salt shrink[J].SEN2I G AKKASHI,1950,(6):334-337.(责任编辑:朱明) 06 无　锡　轻　工　大　学　学　报 第22卷。

丝素蛋白溶液制备流程
丝素蛋白是一种天然的蛋白质，可以用于制备丝素蛋白溶液。

下面是制备丝素蛋白溶液的详细步骤：
1.材料准备：准备丝素蛋白、溶剂（如水或缓冲液）、不锈钢容器、电动搅拌器和pH计等材料和设备。

2.缓冲液配制：根据实验的需要，配制相应pH值的缓冲液。

常用的缓冲液有PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液等。

3.丝素蛋白溶液制备：将准备好的丝素蛋白粉末加入缓冲液中，搅拌均匀，并逐渐调整pH值至目标值。

同时，可以根据需要加入其他辅助溶剂或添加剂，如甘油、二甲亚砜等。

4.溶液搅拌：将混合好的丝素蛋白溶液倒入不锈钢容器中，开启电动搅拌器将溶液搅拌均匀。

搅拌速度和时间可以根据实验需求进行调整。

一般情况下，搅拌速度不宜过快，以免产生过多的气泡。

5.溶液调整：根据实验需求，可根据需要调整丝素蛋白溶液的浓度和pH值。

浓度的调整可以通过加入适量的溶剂或丝素蛋白粉末来实现，pH 值的调整可以通过适量的酸碱溶液来实现。

6.溶液保存：将制备好的丝素蛋白溶液转移到适当的容器中，并密封保存。

一般情况下，溶液应保存在低温环境中，以防止蛋白质的降解或污染。

特别需要提醒的是，丝素蛋白具有一定的致敏性，制备过程中需要避免直接接触皮肤或吸入。

同时，在操作过程中需要遵循相应的实验室安全操作规范，如佩戴手套、口罩等。

总结：丝素蛋白溶液的制备流程主要包括材料准备、缓冲液配制、丝
素蛋白溶液制备、溶液搅拌、溶液调整和溶液保存等步骤。

通过以上步骤，可以获得适用于各种实验需求的丝素蛋白溶液。

蛋白质脱盐方法蛋白质脱盐是蛋白质分离和纯化过程中十分重要的一步。

在蛋白质样品中存在的高浓度盐离子会对后续的实验操作及蛋白质的性质产生不利影响，因此必须对蛋白质样品进行脱盐处理。

以下将介绍10种常见的蛋白质脱盐方法，并详细描述各种方法的优缺点及适用范围。

1. 氯化铵盐析法氯化铵盐析法是一种常用的蛋白质脱盐方法。

该方法利用不同盐离子的溶解度差异，在不同的盐浓度下将蛋白质从溶液中沉淀。

具体操作是向蛋白质溶液中加入逐渐增加浓度的氯化铵溶液，当溶液的盐浓度高到一定程度时蛋白质会发生沉淀并被分离出来。

优点：操作简单，速度快，对大多数蛋白质适用。

缺点：不适用于对盐浓度敏感的蛋白质，如酶类。

2. 茂丽青G染色法该方法是利用茂丽青G与蛋白质之间的静电相互作用，在酸性环境（pH4.0～5.0）下将蛋白质从溶液中分离出来。

具体操作是将蛋白质溶液与茂丽青G混合，调节pH值后离心分离蛋白质。

优点：适用于对盐浓度敏感的蛋白质，对分离出的蛋白质纯度高。

缺点：对分子量较小的蛋白质不适用，染色对蛋白质有损害。

3. 薄膜蒸馏法该方法是将含蛋白质的溶液在薄膜上蒸发，通过水蒸气的扩散和薄膜上的流动形成薄膜深度梯度，从而将蛋白质与低浓度的盐离子共同蒸发。

具体操作是将含蛋白质的溶液滴入薄膜蒸发器中，在不同的蒸发条件下蒸发，蒸发后的薄膜进行层析分离即可。

优点：适用于对盐浓度敏感的蛋白质，对分离出的蛋白质纯度高。

缺点：操作复杂，需要较长时间和专业知识。

4. 葡萄糖-酸洗法该方法利用葡萄糖可与盐离子竞争结合到蛋白质表面，从而使蛋白质脱盐。

具体操作是将蛋白质溶液与适量葡萄糖混合，加入酸性溶液，离心分离蛋白质。

优点：适用于对盐浓度敏感的蛋白质，操作简单。

缺点：需注意酸性条件对蛋白质的影响。

5. 透析法透析法是一种常用的蛋白质脱盐方法，该方法利用半透膜实现盐离子与蛋白质之间的分离。

具体操作是将含蛋白质的溶液放入透析袋中，置于含有较低浓度盐离子的缓冲溶液中，通过透析袋中半透膜的作用将盐离子与蛋白质分离。

丝素蛋白溶液制备流程
一、简介
棉绒素蛋白（Cottonseed Protein，CSP）是一种谷蛋白的混合物，主要是棉籽蛋白。

它具有优良的功能性，在食品工业、农业、医药和其他营养工业中有广泛的应用。

本文介绍了棉籽蛋白溶液制备的流程。

1.调料：将棉籽蛋白粉加入饱和盐水中，搅拌完全溶解后，即可得到棉籽蛋白溶液。

2.调节PH值：使用掩蔽剂（NaOH或KOH）调节溶液的PH值，直至达到最适宜的PH值（7.0-7.2）。

3.离心：将溶液置于离心机中，离心速度为10，000-12,000rpm，离心时间为10-20min，根据悬浮液的不同，时间也会有所不同，以此来分离悬浮液。

4.冷却：再将离心后的溶液置于冰浴中，使溶液冷却至室温（25℃）即可。

5.过滤：将溶液置于0.2μm的过滤器上，过滤6-7小时，以除去未溶解的固体，最终得到棉籽蛋白溶液。

三、结论
以上是棉籽蛋白溶液的制备流程，该流程具有调节pH值、离心、冷却、过滤等操作，可以有效的制备出优质的棉籽蛋白溶液。

另外，在溶液操作中也要注意操作的温度，浓度，PH值，以保证制备出的溶液质量。