质粒DNA的小量制备

For personal use only in study and
research; not for commercial use
质粒提取原理及步骤
一、导论
已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：
1. 细菌培养物的生长。

2. 细菌的收获和裂解
3. 质粒DNA的纯化。

（一）细菌培养物的生长
从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。

现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。

此时，不必造反性地扩增质粒DNA。

然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续
培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。

氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。

这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不
同，前者大为增高。

多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的
操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。

1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。

在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。

2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。

2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。

使用前临时配置。

3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。

5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O 至500ml。

4℃保存备用。

4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。

1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA （pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。

15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。

15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。

11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。

质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。

2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。

（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。

现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。

此时，不必造反性地扩增质粒DNA。

然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。

氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。

这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。

多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。

选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。

尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。

将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。

这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。

质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。

大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。

然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。

天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。

质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。

质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。

有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。

有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。

一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。

它是基因工程最常见的运载体。

质粒在细胞的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。

前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞只含有一个或几个质粒分子，如F因子。

后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。

在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。

细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。

质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。

质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。

内蒙古大学基因工程大实验思考题本科生基因工程实验(记录及课后思考题)姓名:学号:专业:完成日期:2012年9月9日指导老师:一、质粒DNA的小量制备1.影响最终质粒产量的主要因素有哪些？①与菌的生长状况有关②和提取时的温度有关，需要低温③加溶液Ⅱ、Ⅲ时操作要温和④要用酚和氯仿的混合液多次抽提去除蛋白质⑤要用冰乙醇沉淀2.提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能的避免蛋白质的污染？加入酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。

二、质粒DNA电泳鉴定1.泳道的质粒DNA有几条带？为什么？质粒可能会有超螺旋构型，环状构型和线性构型。

这三种构型中，迁移率最快的应该是超螺旋的，其次是线性和环状。

通常观察到的是超螺旋和环状质粒。

2.溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA？在0.7%、1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1000bp、600bp、200bp、150bp的双链线性DNA片段大致相同3.影响本实验结果的因素有哪些？DNA的长度，结构，胶的浓度，电压等会对实验结果造成影响。

三、质粒DNA的酶切1.酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？有影响加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。

2.如何估计DNA用量和酶的用量？DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/10001U酶切割1ug的质粒，酶的量不要超过酶切体系的1/10。

3.在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？将枪头不要插入液体很深部位，刚过液面且可以吸取所需的体积的液体。

四、PCR扩增制备目的基因1.复性温度是根据什么确定的？可以根据公式：2（A + T）+ 4（C + G），再减5-10度,一般为55℃-60℃当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR 退火温度是必需的。

质粒小提（AxyPrep质粒DNA小量试剂盒）本试剂盒采用改进的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。

适合从1-4ml细菌培养物中提取多至20ug高纯度的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

一、试剂盒组成、贮存、稳定性Rnase A:50mg/ml,室温可贮存6个月，长期贮存于-20℃。

Buffer S1：细菌悬浮液。

加入Rnase A后，混合均匀，4℃贮存。

Buffer S2：细菌裂解液（含SDS/NaOH），室温密闭贮存。

Buffer S3：中和液，室温密闭贮存。

Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。

Buffer W2 concentrate：去盐液。

使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇（可用100%乙醇或95%乙醇）。

混合均匀，室温密闭贮存。

Eluent：洗涤液，室温密闭贮存。

二、注意事项Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。

若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。

三、实验准备1、第一次使用前，Rnase A全部加入Buffer S1中，4℃贮存。

2、准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。

3、第一次使用前，Buffer W2 concentrate 中加入指定体积的无水乙醇。

4、使用前，检查Buffer S2是否出现沉淀，应于37℃温浴加热溶解并冷却至室温后再使用。

四、操作步骤1、取1-4ml在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12000*g离心1min，弃尽上清。

2、加250ul Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

*确认Buffer S1中已加入Rnase A3、加250ul Buffer S2，温和并充分的上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。

质粒dna的提取方法质粒DNA提取是分子生物学实验中非常常见的操作，用于从细菌中提取质粒DNA进行后续的实验分析。

下面我将介绍一种常用的质粒DNA提取方法——碱裂解法（alkaline lysis method），该方法简单、快速、成本低且适用于大规模提取。

实验原理：碱裂解法是利用碱性溶液来破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放出其中的质粒DNA。

在碱性条件下，细菌细胞壁和细胞膜会被溶解，质粒DNA则在此过程中被保护在碱性溶液中。

接着，通过中和和沉淀步骤，可从碱性溶液中纯化出质粒DNA。

实验步骤：1. 首先，从含有目标质粒的细菌培养物中制备菌液。

将培养物转移到离心管中，以12000 rpm离心10分钟。

2. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬于缓冲液中。

缓冲液的配制：用10 mM Tris-HCl缓冲溶液溶解10 mM EDTA（pH 8.0），并加入0.1 mg/mL的蛋白酶K。

3. 加入缓冲液至菌体重悬菌液中，混匀。

4. 加入等量的0.2 M NaOH-1% SDS（含SDS版本）或0.2 M NaOH-0.5% SDS （不含SDS版本），轻轻翻转混匀。

5. 在室温下孵育5-10分钟，将混合物中的碱裂解酶活化。

6. 加入等体积的3 M醋酸钠（pH 5.5）以中和混合物。

7. 在室温下孵育5-10分钟，使沉淀物凝结。

8. 离心上述混合物，12000 rpm，10分钟。

9. 弃去上清液，加入适量的75%乙醇洗涤沉淀。

10. 再次离心，弃去上清液。

11. 干燥质粒DNA沉淀，通常可以在室温下自然干燥，不要使用高温或吹风机等加热工具。

12. 使用适量的Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）溶解质粒DNA沉淀，以得到浓度适宜的质粒DNA溶液。

实验注意事项：1. 在实验操作过程中，尽量避免使用手部直接接触NaOH和SDS，以免引起刺激。

2. 防止质粒DNA受到外源DNA（例如基因组DNA）的污染，可在处理前使用DNase酶或RNase酶处理样品。

质粒DNA小量制备1、实验准备：1）、仪器：台式微量高速离心机、水浴锅2）、试剂：天根离心柱型质粒小提试剂盒、菌液（过夜）3）、器材：1000ul、200ul移液枪及枪头（枪头高压处理）、1.5mlEP 管、双面板、计时器、记号笔2、试验流程1）、含质粒菌液制备第一天菌种复苏A、准备：甘油菌、LB（kana+）平板、酒精灯、打火机、接种环、标记笔B、操作：取-800C 保存的甘油菌种，用灭菌的接种环刮拭冻结的培养物表面，立即将粘附在接种环上的细菌划在LB 平板平面，将冻结的培养物放回-800C 保存，平板于370C 培养过夜（12~16h）第二天增菌A、准备：含有单克隆菌落的LB 平板、5ml LB 菌液、酒精灯、打火机、接种环、标记笔B、操作：a）、5ml LB 菌液+ 5ul kana(50mg/ml)；b）、挑取单克隆接种于LB 液中；c）、180rpm, 370C, 12~16h 振荡培养注意：细菌复苏非常重要，如果细菌生长不好，可再次将5ul 菌液接种于3-5ml 培养基中，震荡培养过夜。

第三天质粒提取（参考试剂盒说明书）1、柱平衡操作：向吸附柱CP3中（吸附柱置于收集管中），加入500ul 平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

2、取1~5ml过夜菌液，加入离心管中，12000rpm离心1min，到掉上清液。

（菌液较多时，可通过多次离心将菌体沉淀全部收集到一个离心管中）3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul的溶液P1，（请检查是否已加入RNaseA），使用漩涡振荡器或移液枪彻底混匀细菌沉淀。

4、向离心管中加入250ul的溶液P2，温和地上下翻转6~8次，使菌体裂解。

5、向离心管中加入350ul的溶液P3，立即温和的上下翻转6~8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

6、将上一步收集的上清液用移液枪转移至吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意不要吸出沉淀，12000rpm离心30~60S（一般取45S），倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放入收集管中。

质粒DNA的小量制备[摘要] 从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，因而被各实验室广泛采用。

[关键词] 质粒dna 碱裂解法快速提取（一）实验目的及原理从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的dna可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。

（二）试剂与器材1.器材：微量移液器、1.5ml离心管、各种移液器头、台式高速离心机、高压灭菌锅、冰块2.试剂：（1）溶液ⅰ：50mmol/l葡萄糖、10mmol/l edta，20mmol/l 25mmtris-hcl ph8.0。

（2）溶液ⅱ：0.4mol/l naoh（临用前用10mol/l naoh贮存液现用现稀解），2%sds sds（十二烷基硫酸纳）10％母液的配制。

（3）溶液ⅲ：60ml 5mol/l 醋酸钾，5ml冰醋酸，28.5ml h2o。

（4）te缓冲液：10mmol/l tris-hcl, 1mmol/l edta（ph8.0）。

（5）100%乙醇，70％乙醇。

（6）上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚兰，40％(w/v)蔗糖水溶液或30％的甘油。

（7）5×tris-硼酸（tbe）缓冲液。

（8）5×tris-乙酸（tae）缓冲液。

3.材料：（1）含puc系列质粒的大肠杆菌；（2）琼脂糖。

（三）实验步骤1.质粒dna的小量提取。

(1)取四支1.5ml离心管，编号为1、2、3、4。

用加样枪加各个溶液。

(2)分别吸取200μl培养液加入这四个离心管中，在离心机（12 000r/min）离心10min，弃上清液，收集菌体。

(3)在1、2、3号分别加入200μl溶液ⅰ，4号加入用等量蒸馏水代替，在快速混匀器上使菌体均匀悬浮。

(4)在1、2、4号加入200μl溶液ii，在3号加入（未加naoh，只加了sds）的溶液ii轻柔颠倒混匀。

质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的或核区原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。

大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为）中，乃至于植物的等胞器中。

然而，1984年，在Streptomyces coelicoler()等以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。

天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。

质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。

质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。

有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗基因的质粒)。

有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。

一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。

它是基因工程最常见的运载体。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。

前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。

后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。

在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而继续复制，可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。

细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。

质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。

质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。

其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。

质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。

2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。

（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。

现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。

此时，不必造反性地扩增质粒DNA。

然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。

氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。

这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。

多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。

选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。

尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。

将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。

这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各类质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情形下可持续稳固地处于染色体外的游离状态，但在必然条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞割裂传递到后代。

质粒已成为目前最经常使用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可取得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方式可用于质粒DNA的提取，本实验采纳碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为普遍的制备质粒DNA的方式，其大体原理为：当菌体在NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方式一般是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平稳离心、离子互换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方式，但这些方式相对昂贵或费时。

关于小量制备的质粒DNA，通过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可知足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中经常使用。

一、试剂预备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。

1M Tris-HCl<!--[if !supportAnnotations]--><!--[endif]--> (pH ）， EDTA（pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。

在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。

任何生物化学反映，第一要操纵好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。