实验报告-菌种复壮

实验报告-菌种复壮

醋酸杆菌复壮实验

一、实验目的

实验室保藏醋酸杆菌出现退化，进行复壮实验，以恢复原菌株的固有特性。

二、实验原理

由于微生物群体会发生自发突变而使该物种原有一系列微生物形状发生衰退，微生物的衰退是一个量变到质变的过程，侠义的复壮是一种消极的措施，指的是在菌种已经发生退化的情况下，通过菌种分离和测定关键性能，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以恢复原有菌株的固有特性；广义复壮是一项积极措施，即在菌种尚未退化前，就经常有意识进行纯种分离，获得正突变株。菌种发酵产物山梨糖可以和斐林试剂反应生成砖红色沉淀，故利用斐林显色法快速筛选菌株。

三、材料

菌种：实验室保藏的菌种醋酸杆菌记作T-1

斐林试剂：可以和山梨糖反应生成砖红色沉淀

96孔板

四、实验方法（纯种分离法）

保藏斜面制备：从-80℃冰箱中取出一支甘油管全部倒入50ml液体培养基中，装在500ml的摇瓶中，28℃，151rpm下培养20-24h；在无菌条件下划斜面10-30支 28℃下培养1-2d，储存在4℃冰箱能保存一个月。月末用保存的斜面一支转接10-30支斜面，28℃下培养好，4℃冰箱保存(上次保存的斜面全部丢弃)，可连续转接2-3次。

斜面活化：取保存在4℃冰箱中的斜面在无菌条件下划斜面数支，28℃下培养1-2d活化

液体种子：用活化的斜面在无菌条件下挑一环到液体种子培养基中，28℃，151rpm 下培养24h（用过的斜面丢弃）

菌种的保藏：500ml摇瓶装50ml培养基接种培养24h，在无菌条件下，加入灭菌的50ml纯甘油，摇匀，到入甘油管中10-20个，-80℃冰箱保存。

4.1液体培养：在无菌条件下，从活化的斜面挑取一环菌到50ml液体培养基中，28℃，151rpm，培养14-18h，待用

4.2 在无菌条件下，梯度稀释10-3，10-4，10-5，10-6，在平板上均匀涂布，在28℃下培养2-3d

4.3 从划线的平板上挑取大量的单菌落至斜面上，并标记1.2.3……，在28℃下培养2d，4℃冰箱保藏

4.4 在无菌的条件下，从每支斜面上挑取一环菌到50ml液体培养基中，并和斜面对应标记1.2.3……，28℃，151rpm下孵化20-24h，

4.5 取培养好的液体发酵液，每瓶分别稀释2倍，4倍，8倍，并和斜面对应标记；取50ul稀释样品和50ul斐林试剂加到96孔板中，25℃下反应15min，观察颜色变化，筛选出颜色最明显菌株，30%甘油保藏。

4.6采用补料分批发酵筛选，将活化后的阳性菌株，接种到装有

50 mL 液体培养基的500 mL 三角瓶中，30℃，150 rpm 条件下发酵

24h，然后补加甘油 1.25mL，继续发酵，测定发酵过程中二羟基丙酮产量与甘油含量，筛选最优菌株

4.7菌种稳定性检测（液体传代）

将数支最优菌种从斜面接种到50ml液体培养基中进行液体活化，转接于50ml 液体培养基中28℃下培养20-24h，每次接种5%进行传代培养，通过补料分批检验，传代3-4次检测其稳定性；将最优菌种甘油管保藏。