1 使用Oligo 6和Primer Premier 5.0等软件设计PCR引物
张新宇
（中国医科院肿瘤研究所，北京100021）
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在当今分子生物学研究中，PCR技术已成为使用最多，最广泛的技术之一。而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。在PCR扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。要想扩增出理想的目的片断，一般都得通过正确设计PCR引物。也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片段作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下），引物二聚体带（引物与引物之间形成稳定二聚体）等等。
现在PCR引物设计都通过计算机软件进行。生物信息学发展至今日，具有引物设计功能的软件有很多，其中大部分是免费软件，可直接从网上下载，安装并运行。这类软件大都简单易用，但其引物设计功能一般不很强，通过它们设计的引物常常不尽如人意，而专门进行引物设计的商业版软件功能强大，但使用起来不太容易。本文就这一问题进行探讨。
引物设计的原则
引物设计有几条基本原则：
首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。
围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，ΔG值(internal stability)，引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin），错误引发位点（false priming site），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：
大口黑鲈肌球蛋白重链基因SNPs的筛选及与生长性状的关联
李胜杰;姜鹏;樊佳佳;白俊杰;李锐;朱新平
【摘 要】肌球蛋白是肌肉细胞的重要组成成分,影响肌纤维的组成和肌肉生长.为了研究肌球蛋白重链(MYH)基因多态性与大口黑鲈生长性状的相关性,本研究采用PCR技术扩增得到编码区序列全长为9759 bp的大口黑鲈MYH基因,该基因包含37个外显子和36个内含子,编码1940个氨基酸.采用直接测序法在MYH基因上筛选到8个单核苷酸多态性标记(SNP)位点(A-305G、G-558C、A-2784C、A-2816G、T-4765A、C-6206T、C-6811T和G-6935T),有4个位于外显子上,其中2个属于同义突变.用SNaPshot方法对从同批繁殖、同塘养殖的大口黑鲈"优鲈1号"群体中随机选取的430尾个体中各位点的基因型进行检测.结果显示,内含子上的A-2784C和A-2816G位点完全连锁,所有位点在大口黑鲈"优鲈1号"群体中的平均有效等位基因数、平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为1.635、0.406和0.373,仅C-6206T、C-6811T和T-4765A位点的基因型频率分布符合Hardy-Wein-berg定律.采用一般线性模型分析各位点与大口黑鲈生长性状之间的相关性,研究发现, C-6811T位点CC基因型个体的体质量和全长显著大于TT基因型,CC基因型个体的体高和尾柄长显著大于CT和TT基因型,其余位点不同基因型个体间的生长性状均不存在显著差异.C-6811T位点与生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种的候选标记.%Largemouth bass(Micropterus salmoides)is
one of the primary cultured species in China,with annual production of 350
000 tons. Growth is one of the most crucial economic traits of all
环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究
孙晶莹;杨江华;张效伟
【摘 要】环境DNA(eDNA)宏条形码(Metabarcoding)技术越来越多地被应用于环境中物种定性识别,但如何定量监测物种在环境中的丰度尚未得到解决.本研究以太湖流域常见的5种浮游动物拟同形溞、大型溞、蚤状溞、多刺裸腹溞、老年低额溞为研究对象,建立了一种基于eDNA宏条形码技术的物种定量方法,并与实时荧光定量PCR(qPCR)相比较,研究了eDNA宏条形码技术多物种定量的准确性.结果表明,PCR引物对eDNA宏条形码的物种检测和定量影响显著.313 bp COI313引物对浮游动物物种覆盖度高,但是物种间DNA扩增的偏好性大,不适用于eDNA宏条形码定量检测.基于COI序列重新设计的短COI116引物能够同时检测出所有5个物种.荧光定量PCR(qPCR)物种拷贝数与物种相对占比呈正相关.eDNA宏条形码所检出每个物种的序列数与qPCR定量拷贝数高度一致.综上,eDNA宏条形码技术可实现对浮游动物物种的半定量检测,在生物多样性监测和生物完整性评价有显著的应用价值.
【期刊名称】《生态毒理学报》
【年(卷),期】2018(013)005
【总页数】11页(P76-86)
【关键词】eDNA宏条形码;生物多样性;qPCR;引物偏好;生物完整性;物种丰度;相对丰度
【作 者】孙晶莹;杨江华;张效伟 【作者单位】污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京210023;污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京210023;污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京210023
【正文语种】中 文
【中图分类】X171.5
随着高通量测序技术的发展，基于环境DNA(eDNA)序列解析混合样本或环境介质物种组成的eDNA宏条形码(eDNA Metabarcoding)技术[1]被逐渐应用于生物学的各个领域，如微生物多样性分析、罕见种和入侵物种监测、浮游植物[2]、水生动植物生物多样性分析、食物网结构重建等[3-5]研究。目前，eDNA宏条形码研究多集中在物种识别和物种多样性分析，关于其对物种定量关系的研究相对较少，这也为该技术在实际环境监测中的应用带来困难。
过量表达黄烷酮3-羟化酶基因(AaF3H)提高青蒿中青蒿素的含量
张婷婷;马嘉伟;王路尧;唐克轩;李杉;赵静雅
【摘 要】黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是参与黄酮类化合物合成过程的一个关键酶.为了研究青蒿中F3H对青蒿素的影响,从青蒿中克隆到黄烷酮3-羟化酶基因(AaF3H),全长为1 095 bp,编码364个氨基酸.SouthernBlot证实AaF3H基因在青蒿基因组中只有1个拷贝.通过构建AaF3H过表达载体并稳定转化青蒿来获得转基因株系,再采用HPLC测定过量表达AaF3H的转基因青蒿植株中的青蒿素含量.结果表明,过表达AaF3H转基因青蒿植株中青蒿素的含量显著升高.通过实时荧光定量PCR分析,在转基因青蒿中,作为青蒿素合成的关键酶,紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因(AaADS)、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因(AaCYP71AV1)和青蒿醛△11(13)双键还原酶基因(AaDBR2)的表达量显著提高.研究结果表明过量表达AaF3H基因是提高青蒿中青蒿素含量的有效方法.
【期刊名称】《生物技术进展》
【年(卷),期】2018(008)001
【总页数】8页(P55-62)
【关键词】青蒿;黄烷酮3-羟化酶;过量表达;青蒿素
【作 者】张婷婷;马嘉伟;王路尧;唐克轩;李杉;赵静雅
【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;华南理工大学生物科学与工程学院,广州510006;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240
