１第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选 第一节 概述 基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。 目的基因用途很广，主要有以下几个方面： ①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。 ②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。 ③研究生物种系进化与相关同源性。 ④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。 ⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。 ⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。 根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因。要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。 目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终止子等部件的DNA片段。并且如上所述，不同基因组类型的基因级大小、基因组成和基因排列也各不相同，因此，分离目的基因应采用不同的途径和方法。 随着生物化学、分子遗传学和分子生物学技术的发展，包括基因工程技术本身的进步，如今已有很多基因被分离出来。目前主要应用化学合成法、目的基因的直接分离法和逆转录法来分离、获得目的基因。虽然随着DNA合成仪的间世和发展及DNA序列分析更加快速、准确，人工合成寡核苷酸用作分子杂交的探针、序列分析的引物及各种用途的接头等在基因工程中显示出巨大的优势，但人工合成目的基因仍有很大局限性，目的基因的制备主要还是通过构建基因组DNA文库和cDNA文库。PCR技术的问世及其在基因工程中广泛应用，已经大大地简化了构建和筛选cDNA文库的工作，不仅如此，利用PCR扩增反应还可以从少量已获得的目的基因制备其大量的拷贝，避免培养和DNA纯化等操作中可能产生的失误。此外，新发展 ２起来的转座子标签法(transposon tagging)、mRNA差异显示法(mRNA differential display)及限制性片段长度多态性(RFLP)探针等技术也已在分子克隆工作中展现出广阔的前景。可以相信，随着时间的推移，将有更多行之有效的方法不断涌现，目的基因的制备将更加快速、准确。下面介绍这些方法及近年来新发展的一些技术。 第二节 直接分离法 2.1 限制性核酸内切酶酶切分离法 限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒DNA分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较小，获得目的基因的方法也比较简单。 ①对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需DNA片段，与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。 ②对已知目定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性核酸内切酶识别位点，用适当的限制性核酸内切酶切割，一次就可获得目的基因。 ③即使含目的基因的DNA分子未定序或无定位，也只须先通过酶切分析，随后再通过部分酶切，克隆构建一个非常简单的基因组文库，从中钓出目的基因。 2.2 基因分离的物理化学法 这是基因工程在发展初期所用的方法，某些生物的rDNA基因最早都是利用该法分离获得的，但目前已很少采用。其基本原理是DNA分子的两条链存在着G≡C、A=T碱基配对，其中GC间存在3个氢键，AT间存在2个氢键。如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也有明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组分离目的基因的目的。物理化学法分离目的基因的方法主要有密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等。 2.3 双抗体免疫法分离编码蛋白的基因 双抗体免疫分离法分离基因适用于某一真核细胞的蛋白质已被分离纯化，且足以产生特定抗体，其基本原理如下：核糖体沿mRNA进行多肽链的合成时形成多聚核糖核蛋白体。从细胞匀浆液中制备这种多聚核糖核蛋白体，并同由待分离基因表达的蛋白产物制备的特定抗体一起保温，形成多聚核糖核糖体同抗体的复合体。由于这种复合体数量甚微，难以从细胞总多聚核糖核蛋白体中沉淀出来。但如加入由此特定蛋白的抗产生的第二抗体时就可以通过不连续蔗糖梯度离心，将所要的含有特定mRNA的多聚核糖体从总多聚核糖体分离出来，再通过 ３酚、氯仿抽提去除蛋白、oligo-dT柱层析，就可以得到为特定蛋白编码的mRNA。 第三节 基因组文库的构建 对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大，基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因组文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。 3.1 基因组文库的概念 从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法（超声波、搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切酶的不完全酶解）将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬菌体、粘粒或YAC载体）连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库（genomic DNA library）。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。从基因组含有生物生存、活动和繁殖的全部遗传信息的概念出发，基因组文库是具有生物种属特异性的。 构建基因组文库，再用分子杂交等技术去钓取基因克隆的方法，称为鸟枪法或散弹射击法，意味着从含有众多的基因序列克隆群中去获取目的基因或序列。当生物基因组比较小时，此法较易成功；当生物基因组很大时，构建其完整的基因组文库就非易事，从庞大的文库中去克隆目的基因工程量也很大。 某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。若这个群体中只贮存某种生物基因组的部分遗传信息，则称为部分基因组文库。 3.2 基因组文库构建的基本步骤 这是一种直接从基因组中分离目的基因的方法。首先，用适当的方法将某一种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将这些片段与适当的载体进行体外重组；再引入到相应的宿主细胞中繁殖和扩增，从而形成含有重组DNA分子的群体。从理论上讲，这些 ４重组子应包含有整个基因组DNA序列，即包含了某种生物细胞的全部基因，因此，称之为基因组文库(genomic library)或基因文库(gene library)。但从概率原则来看，只有当此文库中重组子总数达到某一值时，才能包含基因组中所有基因，才可称之为完整基因组文库。构成完整基因组文库所需要重组子的数目，主要取决于基因组的大小和目的基因片段的大小两个参数。 1975年，Clarke和Carbon提出了一个计算这一重组子数目的公式，即: N=ln(1-P)/ln(1-f) 式中N为所需的重组子的数目；f为单个重组体中插入片段平均大小与基因组DNA总量之 比；P为选出某一基因的概率(通常期望为99%)。对于某一特定的基因组，构成其DNA文库所需的重组子的数目，在很大程度上与构建文库所用的载体的容量紧密相关。构建高等植物基因组DNA文库时，通常采用λ噬菌体载体和粘粒载体，因为它们具有更大的克隆容量(约为 24kb和4Okb左右)，可使构成完整基因组DNA文库所需的重组子数目大大减少，从而减轻了克隆和筛选大量重组子所需的工作。 基因组文库的构建一般包括下列基本步骤:①细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备；②载体DNA的制备；③载体与外源大片段的连接；④体外包装及基因组DNA文库的扩增；⑤重组DNA的筛选和鉴定。 (1)染色体DNA 2Okb片段的制备 细胞经过组织破碎和裂解后用苯酚抽提、透析、用RNase(无DNase)除去RNA，再用苯酚-氯仿抽提，透析后得到相对分子质量较大的DNA。测定DNA浓度和分子的大小，DNA应在2Okb之上。接着制备2Okb的随机片段，一般都用识别序列为4bp并产生粘性末端的限制性内切酶作部分水解，如MboI和Sau3A等。摸索酶的水解条件，以获得大量约2Okb的DNA片段。用低熔点琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心分离该大小的片段。 (2)λ载体双臂DNA的制备 构建基因组文库要求使用取代型的λ载体，为了能容纳约2Okb的外源DNA，要除去λ基因组中央的非必需的区段，这一过程称为“双臂的制备”。根据λ载体切点的要求，用过量的限制性内切酶完全水解λDNA，然后用蔗糖梯度离心或0.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳分离双臂DNA。 (3)载体DNA与外源DNA片段的连接 λ载体两臂DNA与外源DNA之间的连接一般采用两种方式:①粘性末端连接，λ载体与外源DNA两端具有相同的粘性末端。例如：λ载体 DNA以BamHI酶水解除去非必需区段，而基因组DNA用4bp识别序列饱MboI或Sau3A进行部分的酶解，得到2Okb左右的片段。两者以相同的粘性末端进行连接。②人工接头法，例如用EcoRI接头进行连接。外源2Okb DNA片段经过Klenow片段补平，用EcoRI甲基化酶修饰保护，两端与EcoRI人工接头进行齐头连接，再用EcoRI完全水解，使两端人工接头完全暴露出EcoRI ５粘性末端。这样可以与λ载体两臂之间的EcoRI位点进行置换连接。 外源片段与λ载体双臂的连接需要考虑两个因素:一是两者的分子数量比，按理论上计算，最适反应的分子数量比应为2:1:2(左臂:外源片段:右臂)，但实际情况中有的片段会缺少一个粘性末端，使连接的有效浓度比计算得少，所以进行预先测试是需要的，二是连接反应混合物中DNA绝对浓度很重要，其浓度需达到足够的高度，以保证形成串连体和串连体分子间的连接，减少DNA分子自身成环连接。 (4)用于基因文库构建的载体 目前，构建基因组DNA文库最常采用的λ噬菌体是大容量(约24kb)的新型载体。如λEMBL系列、λ2001、λDASH和ChaRON38～40等。由于这些载体可以克隆相对较大的外源DNA片段，使分离某一特定的真核基因组区段时，所需构建和筛选的重组克隆相对减少。而且更重要的是，在分离相应于基因组DNA特定区域的一组重叠克隆所需要的多轮筛选中，累计可以节省大量的时间和精力。此外，这些载体还有许多优点: ①载体双臂的DNA全序列均已确定，或可由已阐明的野生型λ噬菌体DNA序列推出。②携带有易于筛选的遗传标记。③像λEMBL系列和λ2001等载体因携带Spi-遗传标记，在构建基因文库时无需纯化双臂。④易于从重组噬菌体中回收插入的外源片段。 但是，在大肠杆菌克隆系统中，λ载体的容量上限为24kb，cosmid的上限为5Okb，这样的容量对构建哺乳动物、高等植物染色体基因的要求还是过小。近年来发展了酵母菌人工染色体(YAC)，它可以容纳1Mbp甚至更大的DNA片段，能以克隆形式保存染色体基因组复杂 DNA的大部分或全部。 (5)体外包装与基因组DNA文库的扩增 所谓的体外包装，就是在试管中完成噬菌体在寄主体内组装的全部过程，这是因为重组DNA转染受体菌的效率低，而经体外包装形成完整的噬菌体粒子后，其感染受体菌的转导效率增加，约提高100～1000倍。重组DNA在受体菌中大量增殖的结果是在平板上形成大量的噬菌斑，每个噬菌斑就是一个克隆，这些克隆就构成了某种生物的基因组DNA文库。一旦基因文库构建完毕，就可利用噬菌斑原位杂交技术从大量的噬菌斑中筛选出带有目的基因的重组克隆。
基因组文库构建的基本过程
构建基因组文库，听起来是不是有点高大上？其实啊，这个过程就像是做一碗丰富的杂烩，里面有各种各样的成分，味道可好了。今天就让我们轻松愉快地聊聊这个过程，从头到尾都不复杂，保证让你听完后恍若领悟了宇宙的奥秘！
1. 基因组的准备
首先，咱们得有“食材”，也就是目标基因组。想象一下，像个侦探一样，你得先找到你要研究的生物，这可能是一只可爱的青蛙，或者一株神秘的植物。然后，从这些生物体中提取DNA，这一步就像是把青蛙放在水里，慢慢观察它的变化。提取DNA的过程其实也没那么神秘，简单来说，就是用一些化学试剂把细胞里的DNA分离出来。就像剥蒜一样，简单又有效。
接下来，得把提取的DNA切割成小片段。这就好比在厨房里把食材切成小块，方便后面的烹饪。这个切割的过程，通常用一些特殊的酶，听上去高端，但实际上就是让DNA变得易于处理。你可能会想，这么多小块到底怎么存起来呢？别急，接下来就要介绍基因组文库的“容器”了。
2. 构建文库
2.1 载体的选择
在我们的基因组文库中，载体就像是一个个小小的运输箱，专门用来存放那些切割好的DNA片段。这里面有各种各样的选择，最常见的就是质粒，这种小圆圈状的DNA能在细胞中独立复制，真是个省心的好伙伴！当然，也有其他的载体选择，比如病毒载体，听起来就有点神秘，实际上它们也只是利用病毒的特性来运送我们的DNA而已。
2.2 转化过程
有了载体后，咱们就可以把这些小DNA片段装进去，进行转化了。转化就像是给每个小箱子上锁，把它们装上货车，准备运输到指定地点。通常我们会把这些装有DNA的载体放入细胞中，等待它们“安家落户”。这一步可有讲究了，要控制好温度和环境，让细胞在“舒适”的状态下接纳这些新朋友。
3. 筛选与鉴定
3.1 筛选
一旦我们的载体和DNA片段都进了细胞，接下来就是筛选这些“小箱子”了。这一步可以想象成是在参加一个聚会，大家都是陌生人，但你只想和那些有趣的、能引起你兴趣的人交朋友。我们通过一些特定的标记，找出那些成功“入驻”的细胞，确保我们的实验不会“空欢喜”。
第三章 从核酸到基因组
一、选择
单选：
1、核酸分子中最不可能有的碱基对是
A. A-G B. A-T C. A-U D. C-G E. G-U
2、染色体所含的碱性成分是
A. DNA B.RNA C.组蛋白 D.非组蛋白 E.DNA和RNA
3、在生理条件下带正电荷的成分是
A. DNA B.RNA C.组蛋白 D.非组蛋白 E.DNA和组蛋白
4、细胞质内不存在
A. 转移RNA B.信使RNA C.核糖体RNA D.核酶 E.核小RNA
5、关于mRNA的描述，哪项是错误的？
A. 原核生物mRNA多为单顺反子mRNA
B. 原核生物mRNA的5'端有非翻译区
C. 真核生物mRNA的3'端有非翻译区
D. 真核生物mRNA的5'端核苷酸含稀有碱基
E. 真核生物mRNA的3'端poly(A)尾长度与其寿命有关
6、细胞内含量最多的RNA是
A. 核酶 B.mRNA C.rRNA D.snRNA E.tRNA
7、通常所说的基因表达产物不包括
A. mRNA B.rRNA C.蛋白质 D.tRNA E.核酶
8、所有基因都不含有的元件是
A. 非编码序列 B.复制起点 C.加尾信号 D.内含子 E.增强子
9、真核生物基因组是指
A. 一个细胞内的全部基因
B. 一个细胞内的全部DNA
C. 一个细胞内的全部染色体
D. 一个细胞内的全部染色体DNA
E. 一个细胞内的全部染色体组DNA
10、与 pCAGCT互补的 DNA序列是
A. pAGCTG B. pGTCGA C. pGUCGA D. pAGCUG E.pAGCUG
11、tRNA 的结构特点不包括
1 基因组文库的构建
基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基
因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的
载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称
为基因文库。
1. 1构建基因文库的载体选用
载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文
库所需要的重组子的数目。第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越
少，所需的重组子越少。
1.1.2目前常用的载体：载体系列（容量为24 kp ）、
cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC
（容量为300 kb）
1.2 基因文库构建的一般步骤
1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适
于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割
法或不完全酶切法。
1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或
同聚物加尾。第四章基因文库构建及酵母双杂交技术
噬菌体载体构建基因组文库2 cDNA文库的构建
cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使
poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体
分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序
列的cDNA基因文库。
2.1高质量mRNA的制备
应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System
分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总
RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸
附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。第四章基因文库构建及酵母双杂交技术
PolyAT tract mRNA的分离纯化过程
2.2反转录成cDNA
可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引
