分子克隆——主要步骤

第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。

二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。

三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。

2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。

四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。

（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。

（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。

2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。

（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。

（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。

3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。

（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。

（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。

五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。

2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。

3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。

六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。

DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。

其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。

载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。

主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。

载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。

质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。

最常用的质粒是pBR322。

基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。

其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。

cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。

cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。

特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。

核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。

同源重组法分子克隆 -回复同源重组法是分子克隆技术中的一种重要方法，其基本原理是利用DNA的同源性重组来插入外源DNA序列到宿主DNA中。

同源重组法在基因克隆、遗传工程等领域得到了广泛应用。

本文将详细介绍同源重组法的原理、步骤及应用。

一、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA分子的自身结构和功能，DNA分子在某些条件下能够进行重组、修复和重复。

同源重组是指两个DNA分子之间具有相似序列（同源）的区域进行交换而形成的DNA分子重组。

同源重组法基于此原理，通过在宿主DNA中引入重组的同源片段，将外源DNA序列插入到宿主DNA中。

同源重组法的原理可以分为两个步骤：相互间接断裂和互补配对。

两个DNA分子的同源片段同时发生间接断裂，获得可供基因重组的末端。

接下来，由于互补配对的作用，从两个DNA分子中间的同源片段在一定条件下进行配对，形成插入、缺失、互换等不同类型的重组产物。

1. 构建载体DNA：载体DNA是将外源DNA插入到宿主DNA中的重要工具，构建载体DNA 需要选择有适当限制酶切位点的载体和外源DNA。

一般来说，常用的载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样颗粒等。

2. 制备DNA片段：外源DNA片段可以通过PCR扩增、酶切和DNA合成等技术制备。

需要注意的是，PCR扩增要确保扩增的DNA片段与宿主DNA具有一定的同源性。

3. 利用限制酶切割载体和外源DNA：根据预定的酶切位点设计限制酶切位点并进行酶切。

4. 进行杂交和拼接：将外源DNA片段与载体DNA杂交，并通过互补配对将DNA片段与载体DNA进行拼接。

5. 转化大肠杆菌：利用化学方法或电击法将构建好的载体DNA转化到大肠杆菌中，转化后得到含外源DNA的菌落。

6. 筛选阳性菌落：利用选择性培养基和荧光素酯分析方法等技术筛选阳性菌落。

7. 测序鉴定：对筛选出的阳性菌落进行测序，并鉴定插入的外源DNA序列是否正确。

同源重组法是分子克隆领域中一种非常实用的技术。

分子克隆操作方法
分子克隆是一项常用的生物技术，用于将特定DNA 片段定向克隆到载体DNA 上，生成包含目的基因的重组DNA 分子。

以下是分子克隆的常用方法：
1. 限制酶切剪接：利用限制酶切剪配对的方式，将目的DNA 片段和载体DNA 上的相应区域进行切割，得到两个切口，然后将两个断裂的DNA 片段连接起来，形成含有目标DNA 片段的重组DNA 分子。

2. PCR 扩增：利用PCR 技术对目的DNA 片段进行扩增，并将其与载体DNA 进行连接，形成重组DNA 分子。

3. TA 克隆：TA 克隆是一种优化的克隆方法，使用缺十二碳酸二酯酶的Taq DNA 聚合酶进行PCR 扩增，将目的DNA 片段amplified 插入含有单一胞嘧啶（T）的TA 克隆载体上，然后将TA 克隆载体转化到大肠杆菌中进行筛选。

4. 原位杂交：将互补的DNA 探针标记并与目的细胞DNA 结合，发现目的DNA 片段的位置，然后将其在载体上克隆。

5. 基因文库筛选：将目的DNA 片段插入到原核或真核生物基因文库中，然后筛选出含有目的DNA 片段的重组DNA 分子。

6. 自主克隆：将目的DNA 片段插入到自主复制的质粒上，使其复制并表达出
目的蛋白质。

需要根据具体实验目的，选择适合的方法进行分子克隆，为后续的分子生物学研究提供可靠的材料基础。

做了快一年的分子克隆，犯了很多错误，经历了很多坎坷，也学到了很多东西。

分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。

经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，在这里跟大家分享一下我的经验，以供和我一样陷入困境及刚开始做克隆的同学参考。

关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。

但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。

有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。

以下我详细说明。

1，PCR引物的设计。

通俗的不说，需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。

做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。

常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。

dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG 位点（W是A或T）并甲基化。

如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。

容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（A TC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。

这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。

如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。

甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。

2，PCR产物。

两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。

我个人强烈建议第二种，连T载体。

因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。

分子克隆之载体构建完整步骤一、目的片段的扩增和酶切PCR反应的基本成分包括：模板DNA(逆转录所得cDNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液及水。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。

准备：A.模板DNA：质粒DNA，逆转录cDNA或挑菌落B.引物配制：a)存储液100uM：公司合成的引物干粉，13000rpm离心2min，加入管壁nmol数x10ul的ddH2O振荡充分溶解。

b)工作液10uM：上下游引物存储液各10ul加80ul ddH2O混匀配制100ul工作液。

终浓度200-400nM。

1. PCR反应体系(50ul)Taq酶体系：Thermo10x buffer （无Mg2+）5ulMgCl2（25mM）5uldNTP （10mM）1ul上下游引物工作液1ul模板cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ulTaq DNA聚合酶0.5ulddH2O 补充至50 ul注：1. 其他体系如菌落PCR反应20ul按比例调整即可。

2. 其他公司Taq酶或2x buffer mix已包含Taq酶、dNTPs时作相应调整。

PCR仪设置反应条件：95℃ 5min 预变性循环x30-35：变性95℃ 30s退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-3~5℃）延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：Taq酶效率约1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸4-10℃ 保温高保真Pfu酶体系（优选）：Thermo10x buffer 5uldNTP （10mM）1ul上下游引物工作液1ul模板DNA或cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ulpfu DNA聚合酶1ulddH2O 补充至50 ulPCR仪设置反应条件：95℃ 5min 预变性循环x30：变性95℃ 30s退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-5℃，特殊酶如NEB公司Phusion高保真酶需要高退火温度，参考官网）延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：pfu酶合成效率约600-1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸4℃ 保温2. 琼脂糖凝胶电泳验证取5ul样品+1ul DNA Loading buffer（6x）混匀上样，150V恒压电泳30min，凝胶成像仪紫外观察保存电泳图片。

第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。

二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。

本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。

三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。

2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。

四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。

（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。

2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。

（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。

3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。

（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。

4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。

（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。

5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。

（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。

（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。

选择题1. 1953年Watson和Crick提出（ A ）。

A．多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋 B．DNA的复制是半保留的，常常形成亲本-子代双螺旋杂合链 C．三个连续的核苷酸代表一个遗传密码 D．遗传物质通常是DNA 而非RNA E．分离到回复突变体证明这一突变并非是一个缺失突变2. DNA以半保留方式复制如果一个具有放射性标记的双链DNA分子在无放射性标记的环境中经过两轮复制。

其产物分子的放射性情况如何( A )。

A其中一半没有放射性 B都有放射性 C半数分子的两条链都有放射性 D都不含放射性质粒是一种细菌细胞内独立于染色体外的___DNAA. 线状B.环状C. 颗粒状D. 网状E. 不规则形答案：B1.RNA聚合酶特异性识别结合和启动转录的DNA序列是：（B）A.增强子B.启动子C.沉默子D.终止子2.转染的定义是：（C）A.将外源性的DNA分子导入原核细胞的过程B.利用噬菌体颗粒为载体，将外源性DNA导入受体细菌的过程C.将外源性的DNA分子导入真核细胞的过程D.其它以下哪个不是基因的点突变：A1.( C)是蛋白质合成的模版A tRNAB DNAC mRNAD 以上都不对2.64个密码子中，有（A）个是终止密码子A 3B 4C 5D 61. 遗传密码的性质:(E)A.所有的密码都是由3个连续的核苷酸组成，相邻的两个密码之间没有间隔的核苷酸存在；B.64个密码子中，有3个是终止密码（UAA、UGA、UGA)，其余61个都能编码氨基酸，其中AUG是起始密码；C.密码具有简单性D.密码具有通用性.E.以上全是2遗传病是指遗传物质的结构或功能发生改变引起的疾病，牙周病属于：（C）A.染色体病B.单基因病C.多基因病D.线粒体病.E.体细胞遗传病1.启动子通常含有以下哪些元件：eA.TATA框B.CAAT框C.GC框D.A和BE.A,B,C1;除了那个选项，都是釉质的主要蛋白质：bA.釉原蛋白B.胶原蛋白C.釉蛋白D.成釉蛋白E.釉丛蛋白1、转导是（C）A 将外源性的DNA分子导入原核细胞的过程。

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一、实验目的1. 学习并掌握分子克隆实验的基本原理和方法。

2. 通过实验操作，提高分子生物学实验技能。

3. 熟悉DNA提取、限制性内切酶酶切、连接、转化、筛选等实验步骤。

二、实验原理分子克隆是指将目的基因片段从供体DNA中分离出来，并通过体外重组、转化、筛选等步骤，将其插入到载体DNA中，形成重组质粒。

重组质粒再经过扩增、提取等步骤，得到大量的目的基因。

三、实验材料1. E. coli感受态细胞2. pUC19载体3. 目的基因片段4. 限制性内切酶（如HindIII）5. T4 DNA连接酶6. DNA分子量标准7. DNA凝胶电泳试剂盒8. 琼脂糖9. 载体提取试剂盒10. 其他试剂（如DNA模板、PCR引物、Tris-HCl缓冲液、NaCl等）四、实验步骤1. DNA提取：按照试剂盒说明书提取目的基因片段和pUC19载体DNA。

2. 限制性内切酶酶切：将提取的DNA进行HindIII酶切，反应条件按照酶切试剂盒说明书进行。

3. 连接：将酶切后的目的基因片段和载体DNA进行连接，反应条件按照T4 DNA连接酶说明书进行。

4. 转化：将连接产物转化到E. coli感受态细胞中，具体操作按照转化试剂盒说明书进行。

5. 筛选：将转化后的细胞涂布在含有抗生素的琼脂平板上，37℃培养过夜。

6. 提取重组质粒：从平板上挑取白色菌落，按照载体提取试剂盒说明书提取重组质粒。

7. 验证：将提取的重组质粒进行PCR扩增，检测目的基因是否插入载体。

8. 纯化：将PCR产物进行纯化，具体操作按照纯化试剂盒说明书进行。

9. 测序：将纯化后的PCR产物进行测序，验证目的基因序列的正确性。

五、实验结果与分析1. 酶切结果：在DNA凝胶电泳中，目的基因片段和载体DNA在HindIII酶切位点处均出现特异性条带，说明酶切成功。

2. 连接结果：转化后的平板上出现白色菌落，说明连接产物成功转化到E. coli 细胞中。

3. 筛选结果：提取的重组质粒经过PCR扩增，在预期位置出现特异性条带，说明目的基因成功插入载体。

分子克隆过程分子克隆，听起来是不是特别高大上？就好像是在分子的世界里当一个小小的造物主，把基因这个神奇的“小零件”按照我们的想法组合来组合去。

分子克隆其实就像搭积木。

我们知道，积木有各种各样的形状和颜色，基因呢，也有不同的类型和功能。

我们的目标就是把那些我们想要的“基因积木”挑出来，然后搭成一个新的“建筑”，这个“建筑”可能是一个新的蛋白质，或者是一种新的细胞功能。

那怎么开始这个神奇的分子克隆之旅呢？这得从找到我们想要的基因开始。

这就好比在一个巨大的仓库里找一个特别的小零件。

这个仓库就是生物体的基因组。

有时候这个基因很容易找，就像在一堆颜色鲜艳的积木里找那个红色的正方体一样简单。

但有时候，这个基因就像藏在一堆干草里的小针，特别难找。

我们可能要用到一些特殊的工具，比如说基因探针。

基因探针就像是一个带了导航的小机器人，专门去找那个我们想要的基因。

找到基因之后呢？就该把这个基因从它原来的地方取出来了。

这就像是从一个复杂的机械装置里小心翼翼地拆卸一个小零件。

我们会用到一种叫做限制性内切酶的东西。

这限制性内切酶可神奇了，它就像一把特别精准的小剪刀，只在特定的位置把基因剪下来，不会伤到其他的地方。

把基因取出来之后，得找个地方放呀。

这个地方就是载体。

载体就像是一辆小货车，把我们取出来的基因运到新的地方去。

常见的载体有质粒，这质粒就像是一个小巧的移动仓库，可以装载我们的基因。

把基因和载体连接起来就像是把货物小心翼翼地装到货车上，这个时候我们又需要一种工具，叫DNA连接酶，它就像一个超级胶水，把基因和载体牢牢地粘在一起。

然后就是把这个带着我们想要的基因的载体送进细胞里。

这细胞就像是一个小小的工厂，里面有各种各样的生产线，可以对我们送进去的基因进行加工。

把载体送进细胞的过程有点像把小货车开进一个有很多大门的大工厂。

有时候很顺利，就直接开进去了。

但有时候也会遇到困难，就像小货车的尺寸不符合大门的要求一样，我们就得想办法调整。