3.In situ hybridization
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原位杂交
原位杂交原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry,ISHH) 简称原位杂交(InSitu Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记(如35S，3H，32P等)仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)，更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定：目的是(1)保持细胞结构；(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；(3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：(1)稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
(2)去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
原位杂交技术(in situ hybridization)
原位杂交的基本原理原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。
RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。
该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。
其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。
RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。
尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。
原位杂交技术（in situ hybridization）是以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。
这一技术不需要从组织细胞中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的结构完整，反映特异核酸分子的定位。
特别是配合使用能定位特异蛋白分子的免疫细胞化学技术，就能对生理或病理条件下从DNA 到mRNA到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分析，是基因表达研究强有力的手段。
（一）原位杂交技术的原理原位杂交技术的原理是：使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
原位杂交名词解释
原位杂交名词解释
原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用
于检测和定位特定的核酸序列在细胞或组织中的分布情况。
该技术利用一段含有探针的核酸序列与待检测样品中的相应核酸序列进行互补杂交，通过标记的探针的位置和数量来确定目标序列的位置。
原位杂交的操作一般分为以下几个步骤：
1.固定样本：首先需要将待检测的细胞或组织样本固定在载玻
片或载体上，使其不被破坏。
2.脱氧核酸的解性处理：将样本中的DNA或RNA进行解性处理，使其成为单链的状态，以利于与探针的杂交。
3.制备探针：设计和合成一段与目标核酸片段互补的核酸探针，并进行标记。
标记可以使用荧光标记剂、酶标记剂等。
4.杂交：将制备好的探针加到固定的样品上，在合适的温度和
离子平衡条件下，使探针与待检测的样品中的目标序列发生互补杂交。
5.洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除未与目标序列相互补的探针。
6.检测和成像：利用显微镜或其他成像设备观察和记录探针的
标记位置和数量，以确定目标序列在样品中的分布情况。
原位杂交技术可以用于很多领域，如遗传学、细胞生物学和病理学等。
它可以用来研究基因表达、染色体异常、病原体感染等问题，帮助科学家更好地了解细胞和组织的结构和功能。
此外，原位杂交还可以用来诊断疾病，如肿瘤、遗传病等，通过监测特定基因的表达情况，帮助医生做出正确的诊断和治疗方案。
总的来说，原位杂交是一种研究和定位目标核酸序列在细胞或组织中分布情况的技术，具有高灵敏度和高特异性的优点，可以广泛应用于生命科学的各个领域。
原位杂交技术原理及其应用
• 早期应用的主要是DNA探针 • Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了 cDNA探针（complementary DNA），其基 本原理是以RNA为模板，经逆转录酶 （reverse transcriptase）又称为RNA指 导的DNA聚合酶催化产生的。该酶以RNA为 模板，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这 一途径与一般遗传信息流的方向相反，故 称逆转录。cDNA是指互补于mRNA的DNA分 子。
• 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境， 又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学 工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核 酸探针进行原位杂交。 • Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探 针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成 功。 • Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛 （DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原 性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探 针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交 探针。 • 这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高， 应用不够普遍。
• 多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ ethanolamine）中以减低静电效应，减少 探针对组织的非特异性背景染色。 • 有的作者除在室温下浸于上述溶液10min外， 还在预热37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中预 杂交15min，然后用2×SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸橼酸钠液中浸15min。 • 但也有报道乙酸酐和三乙醇胺液的处理并 不能起到减低背景的目的，不能改善ISHH 的信/噪比例。
• Pezzella（1987）创建了用磺DNA探 针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺 基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克 隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。 • 本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺 口平移标记，敏感度也较高。 • 生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立 的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测 了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化 物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞 中的定位。 • 生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是 在病毒学和病理学的临床诊断中。
原位杂交
原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。
其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。
原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。
这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。
该技术最早应用于6 0年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。
但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。
整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。
in situ hybridization
原位核酸分子杂交技术原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。
这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。
可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。
原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。
临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。
随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。
第一节原位核酸分子杂交技术的发展原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。
与此同时，Buongiorno Nardelli 和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。
Orth(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。
核酸分子杂交的几种类型 -回复
核酸分子杂交的几种类型-回复核酸分子杂交是一种用于研究DNA和RNA相互作用的常见实验技术。
该技术可以用于研究基因表达、蛋白质相互作用、突变分析等。
在核酸分子杂交中，两条核酸链通过互补配对形成杂交（或杂交化合物）。
下面将介绍几种常见的核酸分子杂交类型。
1. 片段杂交（Dot blot）片段杂交是一种最简单的核酸杂交技术。
在这种方法中，目标DNA片段（或RNA）以单链形式固定在固相载体上，如膜片或微孔板。
然后，配对探针标记有放射性同位素或荧光染料，与目标DNA一起进行杂交。
通过检测标记的探针，可以确定是否与目标DNA片段杂交。
2. 南方杂交（Southern blot）南方杂交是一种用于检测和定量目标DNA片段的杂交技术。
在这种方法中，DNA经电泳分离后，转移到膜片上。
然后，膜片上的DNA与互补的探针分子杂交，并通过标记的探针检测杂交的目标DNA。
3. 北方杂交（Northern blot）北方杂交是一种用于检测和定量RNA的杂交技术。
在这种方法中，RNA经电泳分离后，转移到膜片上。
然后，膜片上的RNA与互补的探针分子杂交，并通过标记的探针检测杂交的目标RNA。
4. 原位杂交（In situ hybridization）原位杂交是一种用于检测细胞和组织中RNA或DNA的特定序列的杂交技术。
在这种方法中，标记的探针与固定的细胞或组织中的目标核酸序列杂交。
然后，通过显微镜观察标记的探针和目标核酸的共定位，从而确定目标序列的存在。
5. 竞争性杂交（Competitive hybridization）竞争性杂交是一种用于研究不同核酸序列之间互相竞争结合的杂交技术。
在这种方法中，标记的探针与非标记的探针或样品中的DNA或RNA 竞争杂交。
通过比较标记的探针与不同浓度的非标记探针或样品杂交的强度，可以确定不同序列之间的亲和力或结合特性。
总之，核酸分子杂交是一种重要的实验技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
FISH杂交技术
.
.
荧光原位杂交特点
1.FISH不需要放射性同位素作探针标记,安全性高； 2.FISH探针稳定，一次标记后可在两年内使用，经济、安
全； 3.实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性
探针相当； 5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测
于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗
传学研究。
.
FISH发展
¡ 20世纪90年代， 随着人类基因组计划 的进行，由于绘制高 分辨人类基因组图谱 的需要，FISH技术得 到了迅速的发展和广 泛应用。
.
FISH原理
FISH是以荧光素直接标记的已知核酸分子 为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交 ，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和 离子强度下退火形成稳定的异源待检的杂交 体双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过 荧光显微镜观察杂交信号。
1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷酸探针成功地进 行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术。至此,以荧 光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
1985 年，荧光原位杂交技术被引进到植物。
1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原位杂交技术应用
.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FISH发展
1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA 获得成功之后,Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模 板,利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期 染色体标本进行了原位杂交,从而开创了RNA-DNA的 同位素原位杂交技术。他们都是采用放射性同位素标 记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的 限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交 技术不能很快得到广泛应用。
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荧光原位杂交特点
1.FISH不需要放射性同位素作探针标记,安全性高； 2.FISH探针稳定，一次标记后可在两年内使用，经济、安
全； 3.实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性
探针相当； 5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测
于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗
传学研究。
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FISH发展
¡ 20世纪90年代， 随着人类基因组计划 的进行，由于绘制高 分辨人类基因组图谱 的需要，FISH技术得 到了迅速的发展和广 泛应用。
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FISH原理
FISH是以荧光素直接标记的已知核酸分子 为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交 ，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和 离子强度下退火形成稳定的异源待检的杂交 体双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过 荧光显微镜观察杂交信号。
1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷酸探针成功地进 行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术。至此,以荧 光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
1985 年，荧光原位杂交技术被引进到植物。
1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原位杂交技术应用
.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FISH发展
1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA 获得成功之后,Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模 板,利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期 染色体标本进行了原位杂交,从而开创了RNA-DNA的 同位素原位杂交技术。他们都是采用放射性同位素标 记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的 限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交 技术不能很快得到广泛应用。
原位杂交实验指导
原位杂交实验指导原位杂交原位核酸分⼦杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization)，是⽤已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进⾏特异性结合⽽形成杂交体，然后再使⽤与标记物相应的检测系统，在显微镜或电⼦显微镜下观察细胞内定位。
原位杂交技术可分为直接法和间接法两种。
直接法主要⽤放射性同位素、荧光或酶标记的探针与靶核酸进⾏杂交，杂交后分别通过放射⾃显影、荧光显微镜术或成⾊酶促反应直接显⽰。
间接法⼀般⽤抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显⽰探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交技术已应⽤于基础研究如基因组图,转基因检测,基因表达定位等。
并也深⼊到产前诊断,肿瘤和传染性疾病诊断等临床诊断的领域中。
实验前准备在实验开始前，需准备好所需的试剂，如2×、0.5×、0.2×的SSC缓冲液，DAB 试剂盒和原位杂交试剂盒（其中包含了蛋⽩酶K，预杂交液，杂交液，封闭液，兔抗地⾼⾟抗体，HRP-⼭⽺抗兔IgG）本实验所使⽤的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的F1单道移液器、QSP盒装吸头，湿盒，切⽚缸，温箱，硅化盖玻⽚等本教材主要通过间接法原位杂交来展开实验，⼤体的流程有：样品玻⽚制备，杂交前处理，杂交，杂交后处理以及显⾊。
样品玻⽚制备⾸先制备细胞涂⽚：将2-3滴PBS重悬的细胞液滴于涂有多聚赖氨酸的载玻⽚上，培养箱⼲燥5min。
杂交前处理滴加1µg/ml的蛋⽩酶K稀释液，37°C细胞通透30min后，滴加0.1mol/L 的⽢氨酸溶液终⽌消化。
预杂交：⽤吸⽔纸轻轻吸去多余的液体，滴加20µl的预杂交液，盖上硅化盖玻⽚，37°C湿盒孵育30min。
⽤0.2× SSC缓冲液室温洗三次，每次洗涤5min。
杂交擦去周围多余的液体，滴加20µl的杂交液，盖上硅化盖玻⽚，将切⽚置于90°C环境下孵育10min ，将切⽚置于盛有2× SSC缓冲液的湿盒中，37°C孵育过夜。
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ALP用发色基质的种类及呈色
BCIP/NBT最常用 BCIP:5-溴4-氯3-吲哚
基磷酸
NBT:硝基四氮唑蓝
HRP用发色基质的种类及呈色
DAB最常用
DAB:二氨基联苯胺
Dig标记探针的显色步骤：
加碱性磷酸酶(ALP)标记的羊抗地高辛抗体， 37OC反应1h。 缓冲液清洗后加显色剂 BCIP/NBT 室温反应30-60分钟，阳性部位呈现紫蓝色。 清洗后用苏木素或甲基绿做细胞核染色。 水洗后根据需要用水溶性封片剂（如甘油明胶） 封片，或梯度脱水、透明后用树胶封片。
探针的设计
基本原则是：
G、C之和占碱基总数的50-60%。 探针两端的碱基不能是互补的 探针内部的互补碱基不能连续超过5个。 尽量避免连续出现4个或4个以上相同的碱基排列。 寡核苷酸探针的长度通常为20-40个碱基。 DNA探针的长度通常为80-200个碱基不等。 RNA探针的长度通常为200-300个碱基不等。 注意其特异性，不可与其他基因有较多的重复碱基排列。
Anti Dig-ALP BCIP/NBT
FISH
对照实验
阳性对照： Northern和Southern印迹杂 交法、免疫组化、已知阳性 组织标本
用正意cRNA探针所 做的阴性对照
阴性对照： 非标记探针、无关探针、 DNA或RNA酶处理标本、 正意cRNA探针
思 考 题
何谓原位杂交？简述其基本原理。
探针标记物的种类：
放射性的标记物 同位素（如35S, 32P） 非放射性标记物 地高辛（digoxigenin, Dig） 生物素（biotin） 酶（如HRP、碱性磷酸酶） 荧光素 磺基（如光敏DNP） *以Dig最常用。
原位杂交的程序
组织的固定：
目的：保持组织细胞的原有结构, 保持细胞内核酸的位置与水平 多采用4%的多聚甲醛缓冲液 直接固定（适合5mm3以下的小组织块） 灌流固定 冰冻切片后固定
1 atgaagaatc tttacatcgt ggctggattg tttgtaatgc tggtggccca 51 gactacagca aatacctaga cattgccaaa tttgagagcg gcatgctgaa 101 aaagaacagt aaacttagtc ggtcaactac ttcgagacc accgttccaa 151 gatttttaaa aaggaggaat aaacacgaga acacaggtat gcggtttgta 201 aaccagtaca cgaatgttta tcctatacag ctggatctat tgcccttacg 251 aaacatgctc ttaacttttg ctctttcgat gttaacctac gactatctag 301 ggataataag agagtcaaag ggtaaatgcc actgaagtta ctagtccaaa 351 agtgatttgc tgtgtaacca tcagataaaa acttctcgta attcaaagta 401 atgagcacaa aaatgagaga gttttatgac atacaaaggg attgtgtgaa 451 ctagcctcaa ccctgccatc cttccaggtc attgttccaa catggccctg 501 tggatgatgc tcctgcccct gctggccctg ctcgtcctct gggagcccaa 551 gcctgcccag aacagcacct cacctggtgg aggctctgat cctggtgtgt 601 gggactaact ggcataatcg cccaatgcta ………. ……….
4%多聚甲醛磷酸缓冲液 （pH7.4）
Na2HPO4·12H2O 29.01ｇ NaH2PO4·2H2O 2.96ｇ 焦碳酸二乙酯处理水(DEPC水) 800ｍｌ 多聚甲醛 40g 搅拌加热至溶解 （65OC—70OC） 追加 DEPC水至 1000ｍｌ
焦碳酸二乙酯处理水(DEPC水) 的配制
十二烷基磺酸钠(SDS)。 蛋白酶:多用1ug/ml的蛋白酶K
杂交
用杂交液将探针稀释为0.5-5.0ng/ul 的浓度.每张标本加10-20ul.置保湿盒 内于50OC恒温箱中反应16-20小时。 （杂交时间不能低于 2-4h）
杂交液的配制(10ml)
去离子甲酰胺 5ml (降低解链 温度) 20倍浓度SSC 2.5ml (缓冲液) 硫酸葡聚糖 1g (提高探针 浓度) 100倍Denhardt液 500ul (封闭剂) 10% SDS 500ul (去污剂) 10mg/ml 变性鲑精DNA 100ug (降低背景 着色) DEPC处理水 1.5ml
原位杂交
原位杂交(in situ hybridization，ISH) 是将 核酸分子杂交技术与组织化学或免疫组 织化学技术结合起来，利用已知的核酸 探针(probe)在组织细胞的原位显示某种 特定基因的存在或其mRNA表达的技术。
基本原理:
磷酸与脱氧核糖以 磷酸二酯键连成两 条多核苷酸链 两条多核苷酸链 借碱基之间的氢 键连接。A、T之 间有两条；G、C 之间有3条 碱基种类：
蒸馏水 1000ml DEPC 1ml 充分搅拌后静置数小时 高压灭菌(DEPC 乙醇+CO2) DEPC可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂 有致癌作用,使用时应注意。
切片时注意事项：
环境及器具的清洁 手套、口罩 DEPC水 干热灭菌 清洁玻片、涂粘附剂
杂交前处理：
*使用去污剂和蛋白酶处理以消除核酸表 面的蛋白质，增加探针穿透力，提高核酸杂 交效率。 去污剂:如0.01-0.3% 曲拉通(TritonX-100);
杂交后处理： 使用不同浓度、不同温度的盐溶液（常 用SSC）将非特异性探针结合漂洗清除。 并用RNA酶将非碱基配对的RNA消化， 达到降低背景着色、增加反差的目的。 漂洗原则： 漂洗液浓度由高到低； 漂洗液温度由低到高。
信号显示：
显示方法因标记物的种类不同而异。 放射性核酸探针用放射自显影法。 非放射性核酸探针用酶检测系统等。 酶检测系统的显色方法与免疫染色 的显色方法基本相同。 常用的酶为ALP和HRP
A: 腺嘌呤 G: 鸟嘌呤 C: 胞嘧啶 T: 胸腺嘧啶 U: 尿嘧啶
待测核酸一般是DNA或mRNA. 探针的主要种类有：
双链DNA DNA探针 单链DNA
RNA探针 寡核苷酸探针
探针的制作：
寡核苷酸探针：化学合成 双链DNA探针：聚合酶链反应（PCR）等。 单链DNA探针：PCR、化学合成或克隆载体M13. RNA探针：亚克隆技术：