18-2凝胶层析

实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。

2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。

二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。

当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。

该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。

凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。

当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。

大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。

若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。

总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。

将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。

实质上Vt是由V o，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。

Vg为凝胶本身的体积。

洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。

它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。

蛋白质层析法是一种用于分离和纯化蛋白质的技术，它基于蛋白质在不同条件下在固定相和流动相中的分配系数不同来实现分离。

层析技术的基本原理是将混合物中的各组分根据其物理或化学性质（如分子大小、电荷、亲和性等）在不同相中的不同分布和迁移速率来实现分离。

以下是一些常见的蛋白质层析技术：
1. **凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography）**：
- 也称为分子筛层析，利用凝胶的多孔结构将分子按大小分离。

小分子可以进入凝胶内部的孔隙，而大分子则被排阻在外部，因此迁移速度不同。

2. **离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）**：
- 根据蛋白质的电荷性质（如阴离子或阳离子交换树脂）来分离蛋白质。

带正电的蛋白质可以与阴离子交换树脂结合，而带负电的蛋白质则与阳离子交换树脂结合。

3. **亲和层析（Affinity Chromatography）**：
- 利用蛋白质与特定配体（如金属离子、生物大分子等）的特定相互作用来分离蛋白质。

4. **反相层析（Reverse Phase Chromatography）**：
- 基于蛋白质在不同极性溶剂中的不同保留行为来实现分离。

通常使用非极性固定相（如C-18柱）和极性流动相。

5. **尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）**：
- 也称为凝胶渗透层析，分离蛋白质混合物中的不同分子量蛋白质。

6. **疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）**：
- 利用蛋白质与固定相之间的疏水作用来分离蛋白质。

实验一蛋白质分子的测定─凝胶层析法一、实验原理凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。

将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，小分子可以进入凝胶内部，流苏缓慢，一直最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得以分离。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，其内部都具有很微细的多空网状结构。

凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（Sepharose），人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）和葡聚糖凝胶（Sephadex G）。

其中葡聚糖凝胶是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。

将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。

Vt由V o，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+V o。

V o为“孔隙体积”、“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积；Vg为凝胶本身体积；Ve为洗脱体积，即自加入样品时算起到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积，Ve与V o及Vi之间的关系为：Ve=V o+K d Vi，；K d为样品组分在二相间的分配系数，Kd=(Ve-V o)/Vi，有效分配系数为Kav，Kav=(Ve-V o)/(Vt-V o)。

在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析的特点，与一般层析方法不同。

Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。

Ve与分子量的关系为：Ve=K1-K2logM，K1与K2为常数，M为分子量，通常用Kav代替V e，建立标准蛋白质分子式量LgM与Kav的标准曲线，称为“选择曲线”。

层析凝胶的选择
层析凝胶是一种常用的分离和纯化生物分子的技术。

在层析凝胶中，样品可以通过根据它们与凝胶之间相互作用的差异，移动到凝胶的不同部分，从而实现分离和纯化的目的。

选择适当的层析凝胶对于获得高纯度和高效率的分离非常重要。

下面是一些选择层析凝胶的相关参考内容。

1. 分子大小：层析凝胶的孔径大小直接影响着分离效果。

一般来说，大分子需要较大的孔径，小分子需要较小的孔径。

根据所需分离的分子大小选择合适的层析凝胶是很关键的。

2. 亲和性：一些层析凝胶具有特定分子与它们的配体之间的特定相互作用。

选择具有目标分子所需的特定亲和性的层析凝胶可以实现高选择性和高纯度的分离。

3. pH稳定性：样品的pH值是选择层析凝胶时需要考虑的重
要参数。

许多生物分子在特定的pH值下更稳定。

因此，选择
具有适当pH稳定性的层析凝胶可以保证样品的稳定性和纯度。

4. 加载能力：加载能力是层析凝胶的另一个关键性能指标。

样品需要在凝胶中被均匀地分布，以获得高效的分离。

因此，选择具有适当的样品加载能力的层析凝胶以避免样品浓度梯度的形成是很重要的。

5. 性能稳定性：层析凝胶的性能稳定性是选择的重要参数之一。

较好的层析凝胶在重复使用的过程中能保持较好的性能和稳定性。

6. 厂家信誉：选择可靠的供应商和厂家可以保证获得高质量的层析凝胶和后续的技术支持。

总之，选择适当的层析凝胶对于成功的纯化和分离非常重要。

根据分子大小、亲和性、pH稳定性、加载能力、性能稳定性和厂家信誉等参数，选择适合实验要求的层析凝胶是提高实验效果的关键之一。

葡聚糖凝胶层析一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。

二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。

对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。

分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。

一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。

这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。

2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。

四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。

2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。

3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。

4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。

五、实验结果及分析1、实验结果：2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。

2024凝胶过滤层析结合液相色谱一串联质谱法测定血清中游离甲状腺激素基于凝胶过滤层析(GFC)进行前处理，结合液相色谱-串联质谱(1C-MS/MS)建立了血清中游离三碘甲腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)的高通量、高灵敏检测新方法。

选用Sephadex1H-20凝胶小柱对150μ1血清样本进行过滤分离，先用Tris-HCI缓冲液(0.1mo1∕1,pH7.4)淋洗去除结合蛋白的甲状腺激素，然后用甲醇对游离的甲状腺激素进行洗脱，采用1C-MS/MS法进行检测和定量，并进行方法学验证。

结果显示：FT3和FT4的线性相关系数(⑵均不小于0.9995,批内及批间相对标准偏差为18%~10%,准确度为85.4%-110%z基质效应为85.8%-114%z回收率为85.8%~107%o采用该方法与平衡透析法(ED)同时检测了95份血清样本，使用IBMSPSSStatistics26和MedCaIc统计软件(v.20.0.0)对检测结果进行配对t检验分析、PaSSingBab1ok回归分析和B1and-AItman 一致性分析。

结果表明，GFC∕1C-MS/MS与ED∕1C-MS∕MS法对血清中FT3、FT4的测定结果无统计学差异(P>0∙05).所建立的方法快速、简便，受干扰因素相对较少，便于临床推广，可为临床实验室游离甲状腺激素的快速、高效、准确检测提供参考方法，同时为其它游离激素的检测提供了一种新的思路。

三碘甲腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)和甲状腺素(Thyroxine,T4)是两种主要的甲状腺激素，其分泌量的增多或减少均可导致甲状腺功能障碍，并可增加心血管疾病、糖尿病并发症和妊娠并发症的发生风险。

正常情况下，T3、T4分别约99.7%和99.97%与特异的血浆蛋白相结合，仅有0.3%和0.03%为游离状态，简称为FT3和FT4o而游离激素假说认为，甲状腺激素的游离形式才是其活性部分，与生物效应密切相关。