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SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定方法

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棉花叶片和根系中SOD、POD、CAT、MDA的测定研究表明逆境胁迫可使植物体内活性氧的产生和消除平衡失调，造成植物体内大量的自由基累计，进而膜脂结构的损伤和加速植物的衰老进程。

测定植物体内膜脂过氧化产物MDA的含量及植物体内抗氧化酶SOD、POD的活性高低，可在一定程度上反映逆境对植物的损害程度合作植物的衰老进程。

关于干旱、渍水、盐害和高温等逆境胁迫对作物候期衰老的影响的研究已有不少报道，但是在不同根土空间对作物衰老方面的研究尚不多见。

张永清等研究表明高粱在不同根土空间下，根土空间缩写降低了SOD、POD的含量，而对于不同配置及水分条件下棉花根系及地上部生理活性的研究较少因此探讨不同根系空间条件下对棉花根系生理特性、棉花后期衰老的影响。

测定部位：
地上部：倒四叶
地下部：上层（0-20cm）中层（20-40cm）下层（40-80 cm）根样
一磷酸缓冲液的配制：
A液：0.2M的KH2PO4溶液称取分析纯KH2PO427.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。

B液：0.2M的K2HPO4溶液称取分析纯K2HPO4•3H2O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。

或
（A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O 31.21克，用蒸馏水定容至1000毫升。

B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O 71.64克，用蒸馏水定容至1000毫升。

）
二、酶液的制备：称取0.5g放入研钵中，加5毫升PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟（10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。

SOD（超氧化物歧化酶）的测定：
1.SOD反应液的配制：
母液的配制：
（1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;
(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml；
（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；
(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，避光保存；
(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。

SOD反应液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：核黄素（FD）：H2O的比例为15：3：3：3：3：2.5，按母液顺序配制。

2.SOD的测定：取型号相同的试管，吸取20微升的酶液，加入3毫升，4000Lux照光30
分钟，同时取四支试管，三支做对照，一支做空白（不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，遮光保存，以空白调零，560nm比色。

3.结果计算
SOD总活性（吸光度/g·FW）=（A CK—A E）×V／（W×0.5×A CK）
单位：NBT光还原50%为单位
SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度
四、POD（过氧化物歧化酶）的测定：
1.0.1M PH6.0磷酸缓冲液的配制：A液219.25+B液30.75，定容至500毫升；
2.POD反应液的配制：0.1M PH 6.0的磷酸缓冲液50毫升于烧杯中，加入愈创木酚28微
升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O219微升混合，保存于冰箱中。

3.POD的测定：20微升酶液+3毫升反应液于比色皿中，在470nm下每隔1分钟读数一次，
共读三次，以每分钟吸光度变化值（ΔA470/min·mg pr或ΔA470/ mgFW）表示酶活力的大小。

4.结果计算：POD活性（ΔA470/min·gFW）=ΔA470×V/V a/W=ΔA470×5/0.02/0.5
=ΔA470×500
五、CAT（过氧化氢酶）的测定：
1.CAT反应液的配制：
0.1MH2O2溶液：0.568毫升30% H2O2定容至100毫升。

0.1MPH7.0磷酸缓冲液：97.5毫升A液+152.5毫升B液，定容至500毫升。

0.1M的H2O25毫升+0.1M的PH7.0的磷酸缓冲液20毫升（即按1：4的比例）混匀，即为CAT反应液。

2.CAT的测定：0.1毫升（或50微升）酶液+2.5毫升反应液，240纳米下比色，每隔1分钟读数1次，共读数3次。

3.结果计算：CAT活性（Δ240/min·gFW）=Δ240×/0.05/0.5=Δ240×200=Δ240×V/Va/W
六、MDA（丙二醛）的测定：
1.MDA反应液的配置：0.6克TBA（硫代巴比妥酸），先用少量1MNaOH溶解，用10%TCA （三氯乙酸）定容至100毫升。

2.MDA的测定：1毫升酶液+2毫升0.6%的TBA，封口沸水浴15分钟，迅速冷却后再离
心，取上清液，在600、532、450nm 三个波长下比色。

3.结果计算：MDA（μmol/gfw）=(6.45×(D532-D600)-0.56D450) ×0.015/W或(6.45×
(D532-D600)-0.56D450) ×0.03/W。

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抗氧化酶SOD、POD、CAT活性测定方法

抗氧化酶SOD、POD、CAT活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化复原法）1、试剂的配制1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参照文件：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育第一版社，2000：267～268。

2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保留。

5）2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保留。

酶液制备：取0.2g（可视状况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定1）反响混淆液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混淆后摇匀；（2）分别取3ml反响混淆液和30μl酶液于试管中光照下反响（3）将试管置于光照培育箱中在4000lux20min；同时做两支比较管，此中后测定作为最大光复原管，1支试管取3ml反响混淆液加入30μlPBS（不加酶液）照光另1支只加缓冲液置于暗中测准时用于调零。

植物组织SOD、CAT、POD活性以及MDA、H2O2含量的测定

植物组织SOD、CAT、POD活性以及MDA、H2O2含量的测定

植物组织SOD、CAT、POD活性以及MDA、H2O2含量的测定•植物组织中通过多条途径产生O-.2、OH等自由基，•这些自由基具有很强的氧化能力，对许多生物功能分子有破坏作用。

•细胞内也存在消除这些自由基的多种途径。

如SOD可以消除O-.2（超氧物阴离子自由基）：SOD 2O-2·＋2H+ ──→ H2O2＋O22H2O2＋-.────→OH·＋O2•• CAT2H2O2───→ 2H2O＋O2•••••••••••••••••••••••••••••• 细胞2O2的积累可使CO2的固定效率降低,而CAT和POD•能分解••••H2O2, 只有SOD、CAT、POD三者活性协调一致，才能使自由基维持在••••••••••一个低水平，所以上述三种酶统称为保护酶系统。

•••••••••• 在正常情况下,细胞内自由基的产生和消除处于动态平衡状态，••••••••••自由基水平很低，不会伤害细胞。

但当植物受到逆境胁迫时，•植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破，O-.2、H2O2、OH•·（羟基自由•基）、·O2（单线态氧）的产量增加，•破坏和降低活性氧清除剂如SOD、CAT、POD、GR(谷胱甘肽还原酶以及VtE、VtC、CAR（类胡萝卜素、GSH（还原型谷胱甘肽）等的结构、活性或含量水平，从而伤害细胞。

•• 自由基伤害细胞的主要途径可能是下列两点：•• 1. 首先自由基导致膜脂过氧化作用, SOD、POD活性下降,•同时还产生较多的膜脂过氧化产物(乙烯、乙烷和丙二醛），膜的完整性被破坏；•• 2. 其次, 自由基累积过多, 也会使膜脂产生脱脂化作用,•磷脂••••••••••游离, 膜结构破坏。

膜系统破坏，•就会引起一系列生理生化紊乱，导致植物死亡。

•••••••••••••••••••••• 本实验利用正常生长和缺素培养的玉米苗为材料, •系统分析叶片中SOD、CAT、POD三种酶的活性及MDA、H2O2、可溶性蛋白质、•叶绿素的含量。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。

网上说定容到100ML我也不懂。

拜托（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。

取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。

SODPODCATMDA的测定方法

SODPODCATMDA的测定方法

缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1.SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3ml EDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：(1) 0.05mol/L PBS：pH7.8(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存) 注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：（1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml（2）0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml 方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零(2)50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时—1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。