乙型肝炎病毒核酸定量检测操作程序

1、目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。

2、原理本试剂盒采用乙型肝炎病毒(HBV)-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA,利用针对乙型肝炎病毒(HBV)核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒(HBV) DNA的定量检测。

整个试验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将血清或血浆样本直接加入PCR反应管中与乙型肝炎病毒(HBV) -核酸释放剂充分混合即可作为PCR扩增的模板，避免了常规样本核酸提取过程中的环境污染。

PCR检测体系含有UNG酶+dUTP防污染措施，将可能的产物污染充分降解，避免假阳性结果。

PCR检测体系含有阳性内对照（乙型肝炎病毒（HBV）内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。

PCR检测体系含有内参比荧光ROX，用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参比荧光ROX的比值，使定量更准确。

3、试剂保存及有效期试剂应避光密闭保存于-20±5℃。

试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。

采用泡沫加冰运输5天不会影响产品效期。

4、样本要求4.1. 适用样本类型:血清或血浆样本。

4.2. 样本采集:4.2.1 血清样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml, 注入无菌收集管，室温不超过4小时，待样本自行析出血清，或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血清，转移到1.5ml灭菌离心管中备用；4.2.2血浆样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml,注入含有EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的无菌收集管，立即轻轻颠倒混匀，室温不超过4小时，待样本自行析出血浆，或直接1600pm离心5分钟分离出血浆，转移到1.5ml灭菌离心管中备用。

乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书-模板1.目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。

2.范围适用于乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）定量检测（PCR-荧光探针法）。

3.职责3.1操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。

3.2专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。

3.3实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。

4.原理采用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样品核酸纯化之后，通过荧光定量PCR对HBV DNA进行扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（CT）实现对未知样品的检测。

另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。

5.样品要求5.1适用样品类型：血清或血浆。

5.2样品采集：5.2.1血清用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2:^，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。

5.2.2血浆用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA （乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂的真空采血管，立即轻轻颠倒混匀5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后分离血浆于无菌的1.5ml 灭菌离心管。

5.3样品保存和运送使用专用样品0c冰壶送检，温度约维持在4℃左右。

分离后的血清或血浆可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。

5.4拒收样品：拒绝重度溶血样品、肝素抗凝的血浆。

6.仪器和试剂6.1仪器AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。

1 目的规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。

2 范围本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）3 试剂中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒4 仪器Roche LightCycler荧光PCR检测仪高速台式冷冻离心机微量加样器（覆盖1-1000μl）5 样品处理样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。

6 测定6.1 PCR扩增6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。

6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。

6.1.3 将循环条件设定为：6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。

6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。

6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。

6.2 产物分析6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。

点击Quantification读取结果。

6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。

6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。

6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。

6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。

7结果判断7.1 如果Ct值＝40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。

7.2 如果Ct值＜40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＝ M7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。

1 目的规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。

2 范围本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）3 试剂中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒4 仪器Roche LightCycler荧光PCR检测仪高速台式冷冻离心机微量加样器（覆盖1-1000μl）5 样品处理样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。

6 测定6.1 PCR扩增6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。

6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。

6.1.3 将循环条件设定为：6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。

6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。

6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。

6.2 产物分析6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。

点击Quantification读取结果。

6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。

6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。

6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。

6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。

7结果判断7.1 如果Ct值＝40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。

7.2 如果Ct值＜40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＝ M7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。

乙型肝炎病毒核酸定量检测操作程序
标本编号：操作时间：操作者：
1、将浓缩液及样品从-20℃取出，平衡至室温（ - ）。

2、用移液器加（）ul血清到（）ul浓缩液，振荡混匀。

3、将混匀好的标本放入高速冷冻离心机（）转离心（）分钟。

4、弃上清，沉淀中加入（）ul DNA提取液混匀。

5、（）℃恒温（）分钟（10±1分钟）。

6、（）转离心（）分钟，备用。

7、吸取（）ul上清到反应管，瞬时离心（）秒。

8、将反应管通过传递窗到产物扩增区准备扩增。

9、用ABI 7500扩增仪进行扩增.
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乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）操作规程1.目的规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。

2.原理2.1 汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。

2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。

试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。

标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。

加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。

洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。

纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。

2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。

在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。

通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。

选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。

在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。

UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。

2.4 质量控制原理为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。

2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）操作规程1.目的规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。

2.原理2.1 汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。

2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。

试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。

标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。

加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。

洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。

纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。

2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。

在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。

通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。

选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。

在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。

UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。

2.4 质量控制原理为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。

2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。

2.3 吸取已编号的待测血清或血浆样本、试剂盒中的阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照及定量标准品（1→）各200μl,分别加入到1.5ml离心管中，在离心管上编好号，振荡混匀。

2.4 56℃温浴15-2Omin,期间颠倒混匀数次。

2.5 加入200Ul无水乙醇，充分混匀，将全部液体转入装有2ml收集管的硅胶柱中，IoOoorPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。

2.6 在硅胶柱中加入500Ul溶液Wl（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。

2.7 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。

2.8 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇）,IoOOOrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液。

2.9 将硅胶柱放入收集管中，1200OrPm空管离心3min,丢弃收集管。

2.10 将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置L2min,往硅胶柱中心加入80Ul 的TE洗脱液，静置2-5min,1200OrPm离心2min,丢弃硅胶柱，盖好离心管盖，做好相对应的编号。

（注意：TE洗脱液的体积应不少于50ul,体积过小影响回收率。

为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。

获得的DNA应保存在-20°C,以防DNA降解。

）3 .加样（在样本处理区进行）3.1 向设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1处理好的样品DNA、强阳性对照、临界阳性对照、阴性对照以及定量标准品（4个）各20μ∣,盖紧管盖，稍做离心。

3.2 将PCR反应管转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。

4 .PCR扩增（检测区）4.1 循环条件设置使用ABI7500和Line-Gene9660荧光PCR检测仪时循环程序设置如下：1150℃2min无2195℃9min无34595℃15sec无58℃50sec单次采集荧光4138℃10sec无■阴性对照无定量值出现，且内标Ct值W40；■强阳性对照检测值范围(3.16X105-3.16X106),临界阳性对照检测值范围(3.16×101-3.16×102),且内标Ct值W40。

乙型肝炎病毒核酸定量检测1原理本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（TAQ酶）、核苷酸单体（DNTPS）等成分，用PCR体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA。

2 标本种类及收集要求2.1 标本采集2.1.1标本种类：血清或血浆。

2.1.2标本要求：血清——用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥生化管，使用水平离心机，3000rpm离心10min;吸取上层血清，转移至1.5ML进口灭菌管。

血浆——用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5~10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，3000rpm离心10min;吸取上层血浆，转移至1.5ML 进口灭菌管2.2 标本储存：标本可立即用于测试，也可以保存与—20℃待测，保存期为6个月。

2.3标本运输：密封，室温运输。

2.4标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。

3试剂3.1 试剂名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）3.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司。

3.3 包装规格：20人份/盒3.4 试剂盒组成DNA浓缩液，DNA提取液，PCR反应管，HBV临界阳性质控品，HBV强阳性质控品，阴性质控品，HBV阳性定量参考品（1.0×104IU/ml、1.0×105 IU/ml、3.5试剂储存条件及有效期：-20℃避光保存，有效期6个月。

4 仪器设备4.1 仪器名称：生物安全柜(Ⅱ级)、高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪、恒温金属浴。

4.2 仪器厂家：上海培清、美国NUAIR公司、美国eppendorf、美国ABI生物技术公司、广州达安基因有限公司。

4.3 仪器型号：ABI7300、DA7600。

5 操作步骤5.1 DNA提取：5.1.1 标本处理（血清和血浆标本处理相同）-取100ul血清加入等量DNA浓缩液，振荡器振荡混匀5sec；12，000rpm离心10min；去上清，沉淀中加入30ul DNA 提取液，振荡器剧烈振荡混匀5-10sec，瞬时离心数秒，100℃恒温处理10±1min；12，000rpm离心5min，备用。

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）操作规程1.目的规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。

2.原理2.1 汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。

2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。

试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。

标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。

加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。

洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。

纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。

2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。

在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。

通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。

选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。

在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。

UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。

2.4 质量控制原理为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。

2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。

乙型肝炎病毒(HBV DNA PCR ABI7300)检侧标准操作程序一、INFORMATIONFORTEST检测信息项目名称乙型肝炎病毒核酸方法聚合酶链反应方法依据卫生部《全国临床检验操作规程》第三版（2006）第七篇第六章第一节二、ANALYTICALPRINCTPLE检测原理聚台酶链式反应(PCR〕可对特定核苷酸片段进行指数级的扩增，而实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料。

我们目前是使用TaqMan荧光探针的检测原理：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’一3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号强度也等比例增加（图一）。

这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

三、操作步骤（一）试剂配制1、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出HBV-DNA检测试剂盒。

查看外包装盒(包括生产批号、有效期)，无误后拆开试剂盒，取出核酸提取液、反应液及Taq酶(核对核酸提取液、HBVPCR反应液及Taq酶管上批号与试剂外包装盒批号是否一致)（图1），不一致则不可使用，需更换新的试剂。

室温平衡20min，完全融化后2000rpm离心备用。

2、核酸提取液的分装（1）取0.5ml离心管架置于超净工作台内(开机前用紫外线消毒30分钟)，用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架（注意应夹住离心管外壁，不能碰到管内壁)，摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔行排，离心管个数为n(n=样本数+对照品+质控品)。