RNAscope在炎症及免疫研究中的应用

研究LncRNA的⼀种新⽅法---RNAscope技术我们对RNA 的理解在过去⼏⼗年⾥不断得到发展，RNA不仅仅只承担遗传信息中间载体的辅助性⾓⾊，⽽是更多地承担了各种调控功能。

ncRNA在发育和基因表达中发挥的复杂精确的调控功能极⼤地解释了基因组复杂性之难题。

对ncRNA的研究主要的⼿段是对细胞或组织提取的RNA进⾏定量和定性的分析，常⽤的⽅法包括定量PCR，芯⽚，测序，northern blot等。

为了获得ncRNA在细胞及组织中的表达信息，对细胞或组织直接进⾏RNA检测也是⾮常必要的，这就需要⽤到原位杂交的⽅法。

原位杂交的⽅法可以提供⽬标RNA在单个细胞内的空间定位，以及结合组织形态学显⽰在组织中不同类型细胞表达RNA的精确信息。

传统RNA原位杂交选择放射性标记、荧光标记或⽣物素标记的RNA探针，存在特异性差、灵敏性差的缺点，因此在ncRNA研究中的应⽤受到了很多的限制。

RNAscope 是基于独特的探针设计和信号放⼤⽅法的原位杂交⽅法。

它采⽤类似于荧光共振能量转移(FRET) 的探针设计策略, 两个独⽴的探针( 双Z 探针) 必须串联杂交到⽬标序列才能引起信号放⼤发⽣，结合在⾮特异性位点的单个Z探针不会产⽣⼀个完整的信号放⼤分⼦结合位点，从⽽防⽌⾮特异性信号的放⼤，显著提⾼了检测的特异性（见图1）。

每个RNA分⼦只需三对双Z RNA探针结合到⽬标RNA就可以检测到信号，该⽅法的⾼灵敏性使RNAscope平台具有原位检测⼈类转录组中⼤多数基因的能⼒，很多低丰度的RNA也可以清晰的显⽰空间位置。

RNAscope双Z探针的设计⽅法要求检测的RAN长度要求⾄少300碱基以上，因此，这个⽅法已经被⼴泛⽤于长链⾮编码RNA（LncRNAs）的研究。

图1：RNAscope测定在⼀天内就能完成。

制备样品后，加⼊与⽬标RNA靶标互补的寡核苷酸探针进⾏杂交。

然后⽤双Z探针系统放⼤特异性信号，并⽴即通过标准光学显微术进⾏检测和定量。

个体化医疗研究的捷径Advanced Cell DiagnosticsRNAscope® –新一代RNA原位杂交技术个体化医疗研究的捷径产品概述ACD公司坐落于美国加利福尼亚州的硅谷中心，作为新兴的分子病理诊断的领导者，开发了基于细胞和组织测试的方法和平台, 并可应用于个体化医疗领域。

ACD公司的RNAscope®专利技术提供了一种能够在组织细胞原位水平对单分子RNA生物标志物进行定性及定量分析的方法，具有较高灵敏度及特异性，是首个能够进行多重荧光和显色标记的原位杂交技术平台。

同时为缺乏高灵敏度及特异性的生物标志物研发项目提供了很好的替代检测方法，该平台将生物标志物检测环节减少到了3个星期。

ACD公司已开发了多个具有自主知识产权的肿瘤检测相关试剂，更好的解决了病人及疾病异质性检测的问题，并通过与制药和生物公司建立合作关系，开发更多与药物研发及生命科学研究相关的检测试剂，同时也为伴随诊断生物标志物的识别和验证提供了有力的工具。

RNA生物标志物的检测，同样也可应用于感染性疾病、神经生物学以及相关领域的基础医学研究。

为什么要进行RNAscope®原位杂交检测RNAscope®技术能够在同一实验结果中同时提供分子定量分析与形态学信息，得益于ACD独特的探针设计专利技术。

RNAscope®是目前最先进的能够同时实现信号放大与并降低背景噪音的多重核酸原位杂交检测技术，是原位杂交领域重大的进步之一。

原位杂交技术的新突破✧40多年来，RNAscope®技术一直是原位杂交领域最重要的进展之一。

✧凭借单分子级检测灵敏度和多重检测能力，RNAscope®使基因在复杂组织中的表达实现可视化。

一次测定，获得分子和细胞的基因信息✧RNAscope®能够在单细胞量级上实现RNA单分子检测与基因表达的定量分析。

✧RNAscope®保存了样品的组织结构完整性，在完整的形态学环境中获取精确的RNA信息。

RNAscope是一种专有的显色原位杂交（ISH）方法，用于在单个细胞水平上可视化单个RNA分子，从空间上对其进行检测，同时维持空间组织微环境。

以下是RNAscope的一些关键步骤和技巧：1. 样本准备：确保样本质量是实验成功的关键。

对于FFPE样本，需选择适当的染色程序以保留RNA。

新鲜样本则无需特殊处理。

2. 靶点修复：在修复靶点之前，应使用靶标修复试剂对样本进行预处理。

这一步的目的是使细胞通透并暴露RNA。

3. 杂交：使用RNAscope的探针与样本进行杂交。

不同的探针适用于不同的RNA类型和目标。

4. 信号放大：通过一系列的洗涤和酶促反应，信号被放大并变得可见。

这一步是RNAscope技术的核心，需要精确控制时间和温度。

5. 显色：最后，通过添加显色底物，将信号转化为可见的染色斑点。

6. 图像采集：使用显微镜观察样本并采集图像。

高质量的图像需要适当的曝光和对比度设置。

7. 结果分析：计数斑点以量化RNA表达。

分析应考虑到背景噪声、非特异性染色和其他潜在的假阳性信号。

8. 质量控制：始终进行必要的质量控制，包括阴性对照和阳性对照。

这有助于验证实验的可靠性和准确性。

9. 注意事项：避免样本暴露于日光、高温和化学物质，以免影响结果。

此外，应遵循所有安全预防措施，特别是在处理潜在的传染性物质时。

10. 验证与优化：根据研究目的和样本类型，可能需要验证和优化RNAscope实验条件。

这包括调整探针浓度、杂交时间和洗涤条件等。

总之，RNAscope是一种强大的技术，但也需要一定的实验技巧和经验。

建议参考相关指南或教程以获得更详细的信息，并在实验中不断探索和总结经验。

基于RNAscope(R)原位杂交技术对PRRSV感染组织样本的检测分析MA Ze-lin;ZHANG Yong-li;LIU Qiang;HU Shou-ping;ZHANG Zhuo;HE Xi-jun 【摘要】为扩大RNAscope(R) 原位杂交技术(RNAscope(R) ISH)在猪繁殖与呼吸综合征病-毒(PRRSV)基础研究中的应用范围,本研究将该技术与免疫组织化学技术(IHC)相结合,通过条件优化建立了RNAscope(R)ISH-IHC双重染色技术.经检测不同病毒感染的组织切片中的PRRSV表明该技术具有良好的特异性.采用该双重染色技术检测PRRSV感染的猪淋巴结组织切片中巨噬细胞感染PRRSV情况,结果显示PRRSV核酸主要存在于巨噬细胞胞浆中,在胞核中也有分布,但在一些非巨噬细胞中也散在PRRSV阳性信号,表明PRRSV不仅在猪淋巴结巨噬细胞中复制.利用该双重染色技术检测PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中凋亡相关调节基因Bid、Bcl-xl表达水平,结果显示一段时间内Bid基因转录水平上调、Bcl-xl基因转录水平下调,与同条件下荧光定量PCR结果一致.综上,本研究建立的RNAscope(R) ISH-IHC双重染色技术结合了RNAscope(R) ISH与IHC各自的优势,不仅能够检测病毒感染后在组织中的定位,还可以分析病毒感染后宿主内源性基因转录的变化趋势,实现了在同一组织切片中对核酸与蛋白的双重检测.经验证该检测方法适用于PRRSV实验室研究,为PRRSV的相关基础研究提供新的检测手段.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】6页(P40-45)【关键词】RNAscope(R) 原位杂交;免疫组织化学;细胞凋亡;猪繁殖与呼吸综合征病毒【作者】MA Ze-lin;ZHANG Yong-li;LIU Qiang;HU Shou-ping;ZHANG Zhuo;HE Xi-jun【作者单位】【正文语种】中文【中图分类】S852.65原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是以碱基互补配对为原则，通过检测探针标记物间接检测目的基因序列的一种技术。

生物谷专访罗宇龄博士：RNAscope(R)开启分子诊断新时代PCR作为传统的分子诊断技术 ,具有灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短 ,可进行定性、定量检测等优点。

但它有一个缺点 ,必须打破细胞 ,把目标分子释放到溶液中才能检测。

而很多慢性疾病〔如癌症等〕的诊断 ,其样品中标识分子和细胞是密切相关的 ,因而更多的需要从单细胞、单分子水平进行检测。

RNAscope(R)能够在原位、单分子水平上高灵敏的检测和定量RNA生物标志物 ,是新一代原位杂交技术平台。

ACD除了开发具有自主知识产权的癌症检测试剂 ,还与制药企业和生物公司建立合作关系 ,验证靶向治疗开展中的生物标志物。

ACD的技术突破了伴随诊断中识别和验证的关键性难题。

RNAscope(R)开启分子诊断新时代生物谷：罗博士您好 ,近年来分子诊断的概念日渐风行 ,能否请您简单为大家介绍一下分子诊断技术相对于传统的诊断方法具有哪些先进之处？我们了解到 ,贵公司成功开发出RNA原位细胞分子诊断的核心技术——RNAscope(R) ,请问这项技术最大的优势是什么？罗宇龄：分子诊断主要通过核酸检测实现 ,其检测的灵敏度和特异性相对于传统检测方法高很多 ,同时也能进行定量检测 ,比方PCR；这些技术上的优势在传染性疾病检测方面已经全面显现。

然而传统的分子检测技术如PCR并不太适合癌症诊断。

因为它需要先打破样本中的细胞并提取核酸才能进行检测。

测到的只是样本中核酸标识分子的平均值。

这种方法对传染性疾病的检测是有效的。

因为病原体于人体而言是外来物质 ,只要在样本中检测到了病原体标识分子 ,就可以断定病因。

但对于自身引起的疾病 ,比方癌症、自身免疫疾病等来说 ,标识分子常存在于自身正常细胞中。

仅仅在样本中检测到标识分子就没有意义了 ,必须知道标识分子出现在那一种细胞中。

这样一来 ,不破坏细胞的“原位〞分子检测技术就非常重要了。

这是PCR等传统的分子检测技术无法做到的。

病毒衍生的小型RNA和miRNA在免疫调节中的作用在人类体内，不仅存在着复杂的生物化学反应网络，还存在着丰富多彩的生物表达调控系统。

而这些系统中， RNA 也扮演着极其重要的角色。

其中，由病毒感染后衍生出的小型 RNA (viral-derived small RNA) 和 microRNA (miRNA) 及其在免疫调节中的作用引起了许多科学家的兴趣。

病毒衍生的小型 RNA ：一个在宿主防御和病毒感染过程中的新角色与更广泛的 RNA 类似，病毒衍生的小型 RNA 通常也指数十到数百个nucleotides 长度的 RNA。

这些 RNA 获取自于病毒基因组、转录组和衍生物、或被剪接或裂解的宿主细胞 RNA 。

它们可能携带着与病毒感染直接相关的序列，同时也可能与病毒基因组不相关，而来自于干扰 RNA（siRNA）或其他机制。

病毒衍生的小型 RNA 目前已被证实具有多个功能，其中最引人注目的是免疫调节。

在病毒感染时，病毒衍生的小型 RNA 可以通过多个途径介导免疫反应。

具体来说，这些 RNA 可以通过受体上调、增强细胞因子释放和免疫细胞浸润从而增强宿主细胞的反病毒能力。

此外，这些 RNA 还可以直接抑制病毒基因组表达和病毒 RNA 进行复制等过程。

总体而言，病毒衍生的小型 RNA 帮助宿主细胞更有效地消灭感染病毒。

miRNA：免疫细胞中的重要调节因子除了病毒衍生的小型 RNA，miRNA 也是调控宿主免疫反应的重要因子。

miRNA 是一种约22个 nucleotides 长度的 RNA，它在宿主细胞中广泛存在，并发挥着各种各样的生物学功能。

目前已知 miRNA 可以通过几种机制诱导或抑制免疫反应，例如可以在 B、T 和自然杀伤细胞中抵制炎性反应，并能够抑制干扰素和白细胞介素的产生等等。

此外，miRNA 也可以作为转录因子，从而介导免疫细胞的分化和发育。

miRNA 在肿瘤治疗中的应用由于 miRNA 可以抑制癌症细胞的增殖、迁移和侵袭能力，因此，miRNA 被广泛用于治疗肿瘤。

RNA原位杂交的金标准——RNAscope®RNAscope®是一项新型的RNA原位杂交技术，可在组织和细胞中检测目标RNA。

该技术基于其独特的探针设计与背景抑制技术，并且融合了传统RNA原位杂交技术与FISH技术的优点，在单细胞水平，实现了单个RNA的可视化，代表了RNA原位杂交领域的一项重大进步，是目前最精准的RNA检测技术。

RNA 表达水平高度动态，并集成了遗传和表观遗传学的调控机制，可以作为极佳的分标记物指示细胞的功能状态。

近年来，转录组分析在癌症研究中的广泛应用业已证明，RNA 与蛋白质一样可以作为临床诊断、治疗评估及预后预测的生物学指标。

为了充分利用RNA作为生物学标记物的这些潜力, 迫切需要开发出有效的方法来常规检测RNA 。

RNAscope®正是可满足这一需求的技术，它可以在形态学基础上，绘制真实而重要的信号通路和关联网络。

RNAscope®工作流程Step 1透化：通过RNAscope®预处理试剂盒处理载玻片上固定好的组织或细胞，以暴露目标RNA。

Step 2杂交：RNAscope®针对靶基因设计的20对Z型目标探针与目标RNA杂交。

Step 3信号放大：RNAscope®检测试剂盒通过信号扩增序列与显色标记有序互补结合，从而扩大信号。

Step 4可视信号形成：在透视光学显微镜或者多光谱成像系统的观测下，每一个目标RNA分子以一个点状信号的形式呈现。

Step 5量化分析：显微镜下，直接计数或者使用RNAscope® SpotStudio™ or HALO自动化图像分析软件，对每一个细胞中的RNA单分子信号进行精确定量分析。

RNAscope®探针设计与信号放大原理1、探针设计为了能够显著提高RNA原位杂交的信噪比，RNAscope®采用了类似于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的设计原理。

ʌ文章编号ɔ1006-6233(2023)06-0928-05RNAscope技术检测hTERC RNA组分在宫颈鳞状上皮内瘤变中的表达及其应用价值胡倩岚,㊀张㊀爽,㊀李红娜,㊀毛㊀昕,㊀刘㊀芳,㊀吴晨阳,㊀宋旭东(华北理工大学附属医院病理科,㊀河北㊀唐山㊀063000)ʌ摘㊀要ɔ目的:探讨RNAscope技术检测hTERC RNA组分表达对宫颈鳞状上皮内瘤变分级诊断价值㊂方法:筛选2021年9月至2022年2月华北理工大学附属医院病理科已确诊为HR-HPV感染的宫颈活检标本80例,分3组:炎症组14例㊁低级别组34例㊁高级别组32例㊂分别采用荧光原位杂交技术及RNAscope技术检测石蜡包埋组织中hTERC基因的扩增状况及其RNA组分的表达㊂结果:FISH 检测hTERC基因扩增三组间具有差异性(P<0.05)㊂RNAscope检测三组间检出率具有统计学差异(P< 0.05)㊂组织学诊断分组中,炎症组14例中hTERC RNA组分阳性表达程度均为(-/++),低级别组中以hTERC RNA组分(++)为主(19/34),高级别组中以hTERC RNA组分(+++/++++)为主(27/32),上述染色模式表达情况在组织学分级诊断中具有统计学差异(P<0.05)㊂结论:RNAscope技术检测宫颈上皮内瘤变组织中hTERC RNA组分的表达有助于宫颈病变组织学诊断及进展预测㊂ʌ关键词ɔ㊀RNAscope技术;㊀荧光原位杂交;㊀宫颈上皮内瘤变;㊀人端粒酶RNAʌ文献标识码ɔ㊀A㊀㊀㊀㊀㊀ʌdoiɔ10.3969/j.issn.1006-6233.2023.06.09Expression of hTERC RNA Fraction in Cervical Squamous Intraepithelial Neoplasia by RNAscope Technique and Its Application ValueHU Qianlan,ZHANG Shuang,LI Hongna,et al(The Affiliated Hospital of North China University of Technology,Hebei Tangshan063000,China)ʌAbstractɔObjective:To investigate the diagnostic significance of hTERC RNA fractions expression de-tected by RNA scope technique in cervical squamous intraepithelial neoplasia.Methods:A total of80cervi-cal biopsy specimens diagnosed with HR-HPV infection in the Department of Pathology,Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology from September2021to February2022were screened in3 groups:inflammation group(14cases),low-grade group(34cases),and high-grade group(32cases). The amplification status of hTERC gene and the expression of its RNA components in paraffin-embedded tis-sues were detected by fluorescence in situ hybridization and RNAscope techniques,respectively.Results: FISH detection of hTERC gene amplification was different among the three groups(P<0.05).Detection rate by RNAscope was statistically different among the three groups(P<0.05).In the histological diagnostic sub-groups,the degree of positive expression of hTERC RNA fraction was(-/++)in all14cases in the inflamma-tion group,the hTERC RNA fraction(++)was predominant in the low-grade group(19/34),and the hTERC RNA fraction(++++/++++)was predominant in the high-grade group(27/32),and the expression of the above staining patterns in the histological graded diagnosis had statistical differences(P<0.05).Con-clusion:The RNAscope technique to detect the expression of hTERC RNA fraction in cervical intraepithelial neoplasia tissue helps in the histological diagnosis and progression prediction of cervical lesions.ʌKey wordsɔ㊀RNAscope technique;㊀Fluorescence in situ hybridization;㊀Cervical squamous intraep-ithelial neoplasia;㊀Human telomerase RNA㊃829㊃ʌ基金项目ɔ2018年度河北省医学适用技术跟踪项目,(编号:G2018067)ʌ通讯作者ɔ宋旭东㊀㊀在全球女性恶性生殖性肿瘤中,宫颈癌位居第二,严重威胁女性健康[1]㊂据数据统计2020年全球新发病例超60万,死亡人数达34万[2]㊂宫颈癌是目前唯一明确病因的恶性肿瘤,高危型HPV(HR-HPV)感染是主要致癌因素,因此如何有效防止宫颈癌的发生发展,及早预防㊁精准诊治是目前研究热点㊂研究发现, HR-HPV可导致宫颈鳞状上皮细胞3号染色体长臂人端粒酶RNA组分(human telomericRNA component, hTERC)基因异常扩增,该基因异常表达是宫颈肿瘤发生的基础,也是宫颈癌形成的早期事件[3]㊂RNAscope 技术是一项新型RNA原位杂交检测方法,它利用 Z 型双探针引物与目标RNA序列互补结合,实现特异性信号放大,使其拥有高灵敏度及特异度,并能在显微镜下直接观察病变中RNA的表达情况[4,5]㊂本课题采用RNAscope技术检测宫颈上皮内瘤变患者hTERC RNA组分的表达,探讨该技术在宫颈鳞状上皮内瘤变病理诊断中的意义㊂1㊀资料与方法1.1㊀一般资料:筛选2021年9月至2022年2月华北理工大学附属医院病理科已确诊为HR-HPV感染宫颈活检标本80例,由两位高级职称病理医师按照2020年(第五版)WHO女性生殖器官肿瘤分类行组织病理诊断,其中炎性病例14例(简称炎症组)㊁低级别鳞状上皮内瘤变34例(简称低级别组)㊁高级别鳞状上皮内瘤变32例(简称高级别组)㊂所有病例均无相关治疗或其他恶性肿瘤放化疗史,且临床资料完备㊂1.2㊀荧光原位杂交技术(FISH):按照试剂盒操作说明对石蜡包埋宫颈组织学标本行FISH检测,橘红色荧光素标记的TERC探针检测TERC基因,绿色荧光素标记的CEP3探针检测3号染色体着丝粒序列,杂交信号结果记录为绿ʒ红,正常细胞为2ʒ2型,异常细胞包括2ʒ3㊁2ʒ4㊁3ʒ3㊁4ʒ4以及hTERC基因高拷贝型(N:5及以上)等㊂1.3㊀RNAscope技术:石蜡切片经二甲苯透明㊁梯度乙醇脱蜡至水,取出切片在室温下风干5min,滴加双氧水室温下10min后蒸馏水清洗,将切片浸入到接近沸腾的靶标修复试剂中,99ħ15min,然后用蒸馏水清洗切片,在无水乙醇中清洗3~5次,风干㊂疏水笔在每张切片样本周围画疏水圈,室温下放置至完全干燥㊂在上述每张切片上加约5滴蛋白酶放入预热至40ħ的HybEZ湿盒,加盖密封,放入杂交炉,40ħ孵育30min,蒸馏水清洗去除切片上的过量液体,在每张切片上加入4滴探针,置于杂交炉中,40ħ孵育2h㊂取出温度控制盘,用清洗缓冲液室温清洗切片2min㊂擦净阻水圈周围的液体,分别依次加入6次杂交反应液,反应温度40ħ,反应时间分别为30min㊁15min㊁15min㊁15min㊁30min㊁15min㊂每次反应结束均用缓冲液清洗玻片㊂加入配置好的Red工作液,室温显色20min,苏木素复染㊁去离子水冲洗㊂1.4㊀结果判读:FISH结果判读:在10ˑ物镜下查找FISH检测细胞区域,然后在40ˑ物镜下扫描整个杂交区域,观察标本的质量,随机计数100个细胞,分别记录正常信号及异常信号细胞的数目㊂正常细胞信号绿ʒ红为2ʒ2型,异常细胞包括2ʒ3㊁2ʒ4㊁2ʒ5㊁3ʒ3型等㊂以20例正常宫颈组织学标本中FISH检测结果建立阈值,阈值=均数+3ˑ标准差,计算结果阈值为6%,即异常细胞数/计数细胞总数ȡ6判断为hTERC 基因扩增,结果为阳性㊂RNAscope结果判读:hTERC RNA组分阳性反应为肿瘤细胞胞质及胞核中可见紫红色颗粒状染色,同时根据阳性细胞在宫颈鳞状上皮垂直切面的分布进行分级:(+)为基底和基底旁细胞染色;(++)为表皮下1/3层的细胞染色;(+++)为超过表皮下1/3层,但未达到2/3层的细胞染色;(+++ +)为超过表皮下2/3层和到全层的细胞染色㊂肿瘤细胞呈阴性反应或阳性反应仅局限于基底或基底旁者均视为hTERC RNA组分不表达,即(-)与(+)均判读为hTERC RNA组分阴性表达(Ⅰ级),(++)染色为Ⅱ级,(+++)和(++++)染色为Ⅲ级㊂1.5㊀统计学方法:采用SPSS26.0软件进行统计学分析,FISH和RNAscope检验结果采用配对χ2检验;一致性检验采用Kappa检验㊂检验水准α=0.05,P<0. 05为差异有统计学意义㊂2㊀结㊀果2.1㊀宫颈活检标本中hTERC基因扩增情况:80例标本中有24例呈hTERC基因扩增(见图1),总扩增率为30.0%(24/80),炎症组㊁低级别组及高级别组扩增阳性率分别为0%(0/14)㊁23.53%(8/34)及50%(16/ 32),统计分析三组阳性率比较具有统计学差异(χ2= 12.773,P=0.002),见表1㊂组间比较,仅高级别组与炎症组之间差异有显著统计学意义(P=0.01)㊂以上结果提示HR-HPV感染宫颈鳞状上皮可以引发hTERC基因扩增,并参与宫颈鳞状上皮瘤变,但hTERC基因扩增阳性结果对宫颈上皮内瘤变分级及预测病变进展的帮助有限㊂㊃929㊃图1㊀FISH检测hTERC基因扩增情况(ˑ100)A.正常宫颈组织无hTERC基因扩增(绿色信号ʒ红色信号=2ʒ2);B.宫颈高级别鳞状上皮内病变hTERC基因扩增阳性(绿色信号ʒ红色信号=8ʒ40)表1㊀FISH检测宫颈组织标本中hTERC基因扩增情况(n)分组例数扩增结果阳性㊀㊀㊀㊀阴性阳性率(%)炎症组140140低级别组3482625.53a高级别组32161650.00bc χ212.773P0.002㊀㊀注:三组之间两两进行比较,χ2分割(α=0.05/3=0. 0167);a示低级别组与炎症组比较,P=0.085;b示高级别组与炎症组比较,P=0.001;c示高级别组与低级别组比较,P=0. 0252.2㊀宫颈活检标本中hTERC RNA组分表达情况:80例HR-HPV感染的宫颈活检组织标本中有53例hTERC RNA组分呈阳性表达,总阳性率为66.25% (53/80),炎症组㊁低级别组及高级别组阳性率分别为0%(0/14)㊁67.65%(23/34)及93.75%(30/32)(见表2)㊂三组hTERC RNA组分阳性表达率的统计学差异显著(χ2=38.334,P=0.000),其中炎症组的阳性率显著低于宫颈鳞状上皮内瘤变组(低级别组及高级别组)(χ2分别为18.184㊁33.715,P值均为0.000),高级别组的阳性率显著高于低级别组(χ2=7.101,P=0. 008)㊂以上结果提示hTERC RNA组分表达增高参与宫颈癌的发生发展㊂参照组织学分级诊断标准,对hTERC RNA组分表达程度进行分级,其中炎症组hTERC RNA组分阳性表达程度均为Ⅰ级(-/+)(14/14),低级别组中以Ⅱ级(++)为主(19/34),高级别组中以Ⅲ级(+++/++++)为主(27/32)(见图2㊁表3)㊂统计学分析示RNAscope检测hTERC RNA组分分级染色模式在宫颈组织学分级中差异具有统计学意义(P<0.05),该结果提示hTERC RNA组分阳性表达的程度与宫颈病变级别呈正比,采用RNAscope检测宫颈组织中hTERC RNA组分的表达可辅助宫颈鳞状上皮内瘤变的组织学诊断㊂图2㊀RNAscope检测hTERC RNA组分表达情况(ˑ200) A.正常宫颈组织hTERC RNA组分(-)㊁B.慢性子宫颈炎hTERC RNA组分(+)㊁C.宫颈低级别鳞状上皮内瘤变hTERC RNA组分(++)㊁D.宫颈高级别鳞状上皮内瘤变hTERC RNA 组分(+++)㊁E.宫颈原位癌hTERC RNA组分(++++) 2.3㊀hTERC RNA组分在宫颈鳞状上皮内瘤变一致性分析:将宫颈鳞状上皮内瘤变中hTERC RNA组分阳性表达程度分Ⅰ级(-/+)㊁Ⅱ级(++)㊁Ⅲ级(+++/+++ +),分别对应组织学诊断中的慢性宫颈炎㊁低级别鳞状上皮内瘤变及高级别鳞状上皮内瘤变㊂根据宫颈鳞状上皮内瘤变临床分层管理共识,将宫颈鳞状上皮内瘤变及hTERC RNA组分阳性表达程度重新分为两级管理(见表4)㊂依据表4分析hTERC RNA组分表达㊃039㊃对宫颈高级别鳞状上皮内瘤变诊断的灵敏度为84. 37%(27/32)㊁特异度为100%(48/48)㊁阳性预测值为100%(27/27)㊁阴性预测值为90.57%(48/53)㊁准确率为93.75%(75/80),一致性检验Kappa值为0.866,一致性显著㊂表2㊀RNAscope检测宫颈组织标本中hTERCRNA组分表达情况组别例数阳性程度-㊀㊀㊀㊀㊀㊀+㊀㊀㊀㊀㊀㊀++㊀㊀㊀㊀㊀㊀+++㊀㊀㊀㊀㊀㊀++++阳性率(%)炎症组141130000低级别组3474194067.65a高级别组32203111693.75bc χ238.334P0.000㊀㊀注:三组之间两两进行比较,χ2分割(α=0.05/3=0.0167);a为低级别组与炎症组比较,P=0.000;b为高级别组与炎症组比较,P=0.000;c为高级别组与低级别组比较,P=0.008表3㊀RNAscope检测分级诊断和组织学分级诊断情况n(%)检测方法组别组织学诊断炎症组㊀㊀㊀㊀低级别组㊀㊀㊀㊀高级别组χ2PRNAscopeⅠ级14(100.0)11(29.7)2(6.3)38.3340.000Ⅱ级0(0.0)19(55.9)3(9.4)24.3200.000ⅢI级0(0.0)4(11.8)27(84.4)47.3550.000合计143432表4㊀RNAscope检测hTERC RNA组分一致性比较检测方法分级宫颈鳞状上皮内病变高级别病变㊀㊀㊀低级别及以下病变Kappa PⅡI级270RNAscopeⅠ/Ⅲ级5480.8660.000合计32483㊀讨㊀论端粒酶是一种维持端粒长度的核蛋白复合体㊂hTERC基因是端粒酶上具有11个碱基的模板序列,在端粒延伸过程中起模板作用,同时也是端粒延伸的重要组成部分㊂该基因异常扩增会导致端粒酶表达过度,致端粒酶延伸,最终造成细胞恶性循环增殖而产生肿瘤[3,6]㊂hTERC基因的表达与端粒酶活性一致,hTERC在许多正常组织和良性组织中均有表达,但其相对上调可反映恶性进展程度,在恶性肿瘤中高表达㊂在宫颈癌和癌前病变中,hTERC也有不同程度的扩增,被认为是宫颈癌的潜在肿瘤标志物[7]㊂HR-HPV 感染是导致hTERC重新激活的起始因子,两者的联合作用使宫颈细胞获得无限的增殖能力㊂目前国内外关于hTERC基因研究也证实了以上观点,Haizhen He[8]㊃139㊃及杨淑玲[9]等研究运用FISH技术检测hTERC基因扩增阳性率,结果显示在宫颈癌中最高,在CIN3中为中度,在CIN1/2类病变中最低,说明hTERC基因在不同宫颈病变的分级诊断中存在明显差异,即随着宫颈病变严重程度增加,hTERC基因表达也增加㊂本实验结果与上述研究一致㊂hTERC RNA组分是由DNA转录产生,在疾病的诊断与治疗中发挥重要作用,但极易降解,而RNA-scope技术所具备的高灵敏度及特异度优势可以显著提高RNA检出率并能提供有效的组织形态学特征㊂本研究中,hTERC RNA组分在各级宫颈病变中均有表达,但是在宫颈高级别鳞状上皮内瘤变中hTERC RNA 组分检出率达90%以上,且组间差异有显著统计学意义(P<0.05),显微镜原位观察hTERC RNA组分染色范围也随着宫颈鳞状上皮内瘤变程度的增加从基底层逐渐向表层覆盖,其染色模式在不同级别的宫颈鳞状上皮内瘤变中的表达具有统计学差异(P<0.05),且具有显著的诊断效能㊂以上统计分析示,RNAscope技术相比于目前主流的FISH技术,它具有更显而易见优势,如明了染色模式㊁判读方便㊁一致率高等,除此之外,在宫颈病变分级诊断中具有显著的灵敏度及特异度,并能直观反应病变进展情况㊂在本研究中,FISH 检测hTERC基因扩增阳性率无法象RNAscope一样进行分级比较,且组间阳性率比较无统计学意义,更加突出RNAscope技术优越性㊂hTERC RNA组分原位杂交染色最显著价值是对宫颈组织学标本进行染色定位㊂在本研究中,hTERC RNA组分在炎症组㊁低级别组及高级别组中显示了不同的染色模式,因此可利用hTERC RNA组分原位杂交为基础来对宫颈病变发展进行推测㊂众所周知, HPV感染从病毒损伤鳞状上皮黏膜基底细胞层开始,随后病毒将其基因整合入宿主基因组中并开始大量复制,最后扩散至整个上皮层,并表达大量E6㊁E7蛋白,破坏宿主DNA修复功能和细胞凋亡,同时上调端粒酶活性使hTERC基因扩增表达,导致上皮细胞无限增殖,最终导致癌的发生[10]㊂本研究中,低级别组大部分病例为表皮下1/3层表达模式,与复制期感染过程相符㊂在高级别病变中,大部分病例表现为表皮下2/ 3层至全层的染色模式,与转化期感染过程一致㊂因此可以通过hTERC RNA组分原位染色变化间接地反映了HPV感染过程㊂故在宫颈上皮内瘤变分流诊断中,对于病理诊断不明确或有分歧时,行hTERC RNA 组分检测可辅助组织学病理诊断以指导临床治疗,对hTERC RNA组分无阳性表达的CIN1及慢性宫颈炎病例,酌情考虑随诊,以避免过度治疗㊂当hTERC RNA 组分阳性表达级别增高时,极大可能为宫颈高级别病变或进展为高级别病变,而予以积极治疗防止漏诊㊂综上所述,采用RNA scope技术检测hTERC RNA 组分的表达,相对于FISH检测hTERC基因扩增状态,更有效地作为宫颈癌前病变的早期筛查辅助手段,并有助于宫颈病变组织学分级诊断㊂ʌ参考文献ɔ[1]㊀Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statis-tics2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortalityworldwide for36cancers in185countries[J].CA:A CancerJournal for Clinicians,2020,70(4):133-133. [2]㊀Sung H,Ferlay J,Siegel RL,et al.Global cancer statistics2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortalityworldwide for36cancers in185countries[J].CA CancerClin,2021,71(3):209-249.[3]㊀Bruno Bernardes de Jesus,Maria A.Blasco.Telomerase atthe intersection of cancer and aging[J].Trends in Genetics,2013,29(9):513-520.[4]㊀Zavalov O,Irizarry R,Flamm M,et al.Mesoscale model ofthe assembly and cross-linking of HPV virus-like particles[J].Virology,2019,537(C):53-64.[5]㊀Deleage C,Chan CN,Busman-Sahay K,et al.Next-genera-tion in situ hybridization approaches to define and quantifyHIV and SIV reservoirs in tissue microenvironments[J].Retrovirology,2018,15(1):4.[6]㊀Armstrong C A,Tomita K.Fundamental mechanisms of te-lomerase action in yeasts and mammals:understanding telo-meres and telomerase in cancer cells[J].Open Biology,2017,7(3):160338-160338.[7]㊀Liu Y,Fan P,Yang Y,et al.Human papillomavirus and hu-man telomerase RNA component gene in cervical cancer pro-gression[J].Scientific Reports,2019,9(3):2675-2686.[8]㊀He H,Pan Q,Pan J,et al.Study on the correlation betweenhTREC and HPV load and cervical CINI/II/III lesions andcervical cancer[J].Journal of Clinical Laboratory Analysis, 2020,34(7):e23257.[9]㊀杨淑玲,张琳,张燕,等.荧光原位杂交法检测hTERC扩增在宫颈鳞状上皮内病变分级诊断中的价值[J].诊断病理学杂志,2020,27(8):533-538.[10]㊀Panczyszyn A,Boniewska-Bernacka E,Gtab G.Telomeresand telomerase during human papillomavirus-induced car-cinogenesis[J].Mol Diagn Ther.2018;22(4):421-430.㊃239㊃。

MiRNA在免疫炎症反应中的调节作用研究近年来，微小核酸(miRNA)的发现和研究成为了生命科学领域的热点之一。

它们是一种长度在20-22个核酸的短链RNA分子，通过与mRNA分子的互补结合，影响目标基因的表达。

研究表明，miRNA在肿瘤、心血管等疾病的发生和发展中起到了重要的调节作用。

除此之外，当前越来越多的研究表明，在免疫炎症反应过程中，miRNA也具有重要的调节作用。

免疫炎症反应是机体对外界刺激的一种保护性反应。

它伴随着一系列复杂的生化过程，包括突破细胞膜、核内转录、翻译过程等。

在这个过程中，miRNA就是一个具有重要作用的因子之一。

miRNA的表达调控主要通过切割、降解或抑制靶基因的翻译等方式实现。

其中，miRNA-132是一种调节免疫炎症反应的miRNA之一，它可以通过控制T细胞、B细胞的活性，参与调节免疫炎症反应的发生过程。

在过去的研究中，研究人员发现，当机体的免疫系统遭遇外界刺激而产生炎症反应时，miRNA-132的表达会明显上升。

此时，miRNA-132可以抑制T细胞和B细胞的活性，降低它们分泌的炎性因子，从而减缓机体的炎症反应。

这表明，miRNA-132在免疫炎症反应分子调节过程中起到了重要的作用。

此外，还有一些其他的miRNA也与免疫炎症反应有关。

例如，miRNA-21、miRNA-146等都可以参与免疫炎症反应的调节过程。

研究表明，当这些miRNA的表达水平发生改变时，机体的炎症反应也会出现相应的变化。

因此，对这些miRNA的调节机制进行研究，对于深入了解免疫炎症反应的机理具有重要的意义。

miRNA的研究展现出了它在免疫炎症反应中的调节作用，但目前的研究尚处于探索阶段。

现阶段，研究人员主要通过miRNA高通量检测、体外和体内功能检测等方法，来鉴定和筛选与免疫炎症反应有关的miRNA，进而深入研究其调节机制。

为了更好地了解miRNA的免疫炎症反应调控作用，还需要进行大规模的基础研究和临床研究。

微小RNA及其在疾病治疗中的应用近年来，微小RNA逐渐成为了医学领域中备受瞩目的一个研究方向。

微小RNA，简称miRNA，是一类长约22个核苷酸的RNA分子。

由于其体积非常小，且能够通过调控基因表达发挥作用，因此在疾病治疗中具有巨大的潜力。

本文将会详细论述微小RNA及其在疾病治疗中的应用。

一、微小RNA的特征和功能微小RNA是一类细胞内调节基因表达的重要分子。

在多种生物中广泛存在，包括人类、动物、植物等。

它主要通过与靶基因的mRNA结合，从而抑制其转录、翻译或者加速其降解。

基因表达调控的是生命的核心过程，因此微小RNA在细胞内的调节作用非常重要。

微小RNA主要由多种酶进行合成，其中主要的酶包括Drosha和Dicer。

Drosha主要参与初级的miRNA前体RNA的加工，Dicer则参与miRNA的生物合成的终止阶段。

此外，一个大约72个核苷酸的二级结构也是miRNA产生的必要之处。

这个结构的稳定性和正确性对miRNA的功能发挥至关重要。

二、微小RNA在疾病诊断中的应用miRNA通过对基因表达的调控，间接地影响了许多生理和病理过程。

众多研究表明，许多肿瘤、神经退行性和心血管疾病都与miRNA的功能异常有关。

与传统基因诊断方法相比，微小RNA的特异性更高，而且可以通过简单的技术手段检测到血液、尿液、唾液等生物样本中的miRNA，将其作为疾病的“指纹”来进行诊断。

例如，miR-21是一种常见的肿瘤相关miRNA。

许多研究表明，它的高表达与肺癌、肝癌、人类黑色素瘤等多种肿瘤的发生有关。

miR-21的检测可以在早期确定疾病的风险，以指导患者进行个体化的治疗。

三、微小RNA在疾病治疗中的应用已经有多项研究表明，miRNA作为基因治疗的重要手段，可以在靶向治疗中发挥关键作用。

miRNA的靶向治疗分为两种：一种是通过转染改变miRNA的表达水平，另一种是通过选择性的miRNA模拟剂和拮抗剂来靶向调节miRNA的功能。