假单胞菌M_6菌株对微囊藻毒素MC_LR的降解机理初探

收稿日期:2007-12-16基金项目:福建省自然科学基金资助项目(D0310007);国家自然科学基金资助项目(50308006)作者简介:李艳波(1978-),女,河南济源人,硕士研究生。

水污染防治假单胞菌M-6菌株对微囊藻毒素MC-LR 的降解机理初探Discussion on Degradation Mechan ism of Microcystin -LR byPseudomonas sp.M -6李艳波1 史 怀2 苑宝玲3 陈彩云3(1.福建省农业职业技术学院 福州 350007);(2.福建省农业科学院生物技术研究所 福州 350003);(3.福州大学环境资源学院 福州 350002)摘要 研究了以假单胞菌M -6菌株对藻毒素M C-L R 的降解机理。

结果表明M -6菌株的胞外物质提取液对M C -LR 没有降解能力,而胞内物质提取液60min 能将15mg /mL 的M C-L R 降解92%。

SDS-P A GE 电泳发现经M C-L R 诱导后M -6菌株胞内有三种蛋白的表达量增加,HP LC 图谱显示在降解过程中产生了两种中间产物和两种终产物。

关键词 假单胞菌M -6菌株 M C-L R 降解机理Abstract T he int racellular ext racts could deg rade 92%of 15mg/mL M icrocy st in-L R in 60mins,w hile the ex tracellu ar didn't have degr adation capabilit y.T he result of SDS-PA GE demonstrated that ex pr ession o f thr ee prot eins are increased after inductio n w ith M icrocy st in-LR.HP LC chr omato gr ams show that ther e ar e tw o inter mediate deg radatio n product s and two end deg radatio n pro ducts.Key words P seudomona s sp.M -6 Micr ocys tin -LR Degradation Mechanism水体富营养化现象以及由此带来的环境与生态问题日益严重,蓝藻爆发性繁殖引起的藻毒素污染就是其中一种[1]。

微囊藻毒素是以动物肝脏为作用靶器官的一类肝毒素,能够特异性地抑制蛋白磷酸酶活性进而诱发癌症等一系列病变,是世界各地广泛存在并且危害极大的一种蓝藻毒素[2]。

MC-LR 是其中存在最广泛,危害最大的藻毒素之一,其分子结构为带有特征的共扼二烯芳香族氨基酸支链的一类环状七肽化合物,结构稳定,在300 高温下还能维持很长时间不分解,传统的水处理工艺很难将MC-LR 从水中去除[3]。

研究生物降解可能是解决大面积藻毒素污染的最佳切入点之一。

近十几年,国内外开展了大量利用微生物方法降解M C-LR 的研究[4],但降解机理方面的研究少见报道。

本实验室从发生水华的水体中分离出一株高效降解M C-LR 的菌株,经鉴定为假单胞菌,并对其降解效能进行了研究[5]。

本文对该菌株降解机理进行了初步的研究,为进一步展开M C-LR 的微生物治理提供有效的菌源与理论依据。

1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌株 假单胞菌M -6,本实验室从发生水华的水体底泥中分离。

1.1.2 培养基及培养条件 NaH 2PO 40 05%,M gSO 4 7H 2O 0 02%,CaCl 20 01%,K 2H PO 40 05%,自然pH ,M C-LR 15m g/L 。

菌株接种于装有200m L 液体培养基的三角瓶中,30 150rpm 摇床避光培养。

1.2 实验方法M C-LR 含量的H PLC 测定条件[6]:固定相为C-18反相硅胶柱,流动相为乙腈和0 1%三氟乙酸(60!40),流速0 8mL/m in,紫外检测波长238nm ,外标法定量。

本条件下M C -LR 的保留时间为4 7min 。

∀4∀环境保护科学 第34卷 第5期 2008年10月1.2.1 M -6菌株胞内外物质提取液的制备 假单胞菌M -6菌株经诱导培养3d 后取菌液,8000rpm 离心10m in,收集菌体。

上清液为胞外物质,设为A1。

以20倍体积的0 1m ol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7 0)清洗菌体细胞3次,并配制成细胞悬浊液,置于冰浴中超声波破碎15min 。

破碎液8000rpm 离心20min 取上清,即为胞内物质,设为A2。

A1、A2均保存在-4 冰箱中备用。

1.2.2 M -6菌株降解M C-LR 活性物质的定位 将A1和A2分别加入到等体积的30m g/L MC-LR 溶液中,并设空白对照,于30 150rpm 下催化降解M C-LR,每60min 取样测定各溶液中MC-LR 的降解情况。

1.2.3 MC -LR 诱导培养前后M -6菌株的全细胞蛋白电泳 对诱导培养前后M -6菌株的胞内物质提取液进行SDS-PAGE 电泳。

电泳条件:分离胶与浓缩胶浓度分别为15%和5%,10mA 恒定电流4h 。

考马斯亮蓝R -250染色,0 5mol/L NaCl 溶液脱色。

1.2.4 M -6菌株催化降解MC -LR 过程观测 在5mL 离心管中加入胞内物质提取液A2与30m g/L 的M C-LR 溶液各1mL,均匀混合。

于30 ,150rpm 下催化降解MC -LR,每15m in 取样200 L,立即加入2 L 6m ol/L 浓盐酸中止降解反应,H PLC 进行测定。

2 结果与分析2.1 M -6菌株降解M CLR 活性物质的定位假单胞菌M -6的胞内外物质对M C-LR 的降解活性见表1。

A1组与空白对照组中M C-LR 含量均无明显的变化,而A2组中MC -LR 含量则明显降低,60min 时M C -LR 降解率达92%。

由此可以看出,对M C-LR 产生降解作用的为假单胞菌M-6的胞内物质,其胞外代谢物对MC-LR 基本上没有降解能力。

表1 菌株M -6胞内外物质对M C-LR 的降解活性处理初始浓度(mg/L)处理后浓度(mg/L)降解率%胞外物质胞内物质空白对照15 0015 0015 0014 981 214 97-92-2.2 藻毒素诱导培养前后M -6菌株的全细胞蛋白电泳电泳结果见图1。

可以看出,菌株M-6在诱导前后所含蛋白条带总数量相同,表明没有新的蛋白被诱导产生。

但却有一种低分子量蛋白(A)及两种中等分子量蛋白(B 、C)的表达量增加,尤其是蛋白A 和蛋白B 表达量的增加极为明显。

由此可推测这三种蛋白即是与MC-LR 降解有关的酶类,这与鞘氨醇单胞菌降解藻毒素相关的酶在数量上类似[7]。

图1 诱导前后细胞全蛋白SDS-PA GE 电泳结果2.3 M -6菌株催化降解MC -LR 过程观测M-6菌株催化降解M C-LR 过程观测结果见图2。

保留时间4 7min 的峰为M C-LR,反应图2 降解过程的H PL C 谱图15m in 后M C-LR 的峰高明显降低,此时在保留时间4 0m in 处出现了第1个M C-LR 降解产物A 的峰。

反应30m in 后产物A 的峰高有所增大,∀5∀假单胞菌M-6菌株对微囊藻毒素M C-LR 的降解机理初探 李艳波同时在保留时间3 4min和7 2min处出现了MC -LR的第2个和第3个降解产物B和C的峰。

此后随时间的延长,产物A的峰高降低,而产物B 和C的峰逐渐升高,反应60m in后,MC-LR的峰消失。

反应120m in后,产物C的峰开始降低,出现了产物D的峰。

反应10个h后,只检测到产物B和D。

从H PLC图谱的变化中可以看出,MC-LR在假单胞菌M-6菌株胞内酶的催化降解过程中,产生了4个非常明显的降解产物,分别是中间代谢产物A和C以及终产物B和D。

Bourne 等[7]同样降解过程中发现两种M C-LR的降解中间物质,推测是线性的(acyclo-)M C-LR和四肽NH2-ADDA-Glu(iso)-甲基脱氢丙胺酸ala-OH。

本实验及H iro shi等[8]的研究结论与其一致。

3 结论(1)假单胞菌M-6菌株降解M C-LR的活性物质为胞内酶。

(2)至少有三种酶与降解过程有关,这三种酶为非诱导性酶类。

(3)假单胞菌M-6酶促降解M C-LR的过程中产生2个中间产物和2个终产物,推测降解步骤如下:步骤1:酶#将MC-LR降解为中间产物A;步骤2:酶∃将中间产物A降解为终产物B和中间产物C;步骤3:酶%将中间产物C降解为终产物D。

参 考 文 献1.许秋瑾,高光,陈伟民.微囊藻毒素的污染研究进展[J].中国公共卫生,2002,18(6):761-763.2.Haider S,Naithani V,Visw anath an P N,et al.Cyanobacterial tox ins:a g row ing en vironme-ntal concern[J].C hem os phere, 2003(52):1-21.m bert T W,Holm es C F B,H rudey S E.M icrocystin class of toxins:health effects and safety of drin king w ater su pplies[J]. Environ Rev,1994,2(1):167-186.4.Park H D,S as aki Y,M aru yama T,et al.Degradation of the cy anobacterial h epatotoxin microcystin by a new bacterium isolated from a hypertr oph ic lak e[J].En viron.T oxicol.,2001(16):337 -343.5.苑宝玲,李艳波,赵艳玲,等.高效藻毒素降解菌的筛选及其降解藻毒素的效能研究[J].福建师范大学学报(自然科学版),2005, 21(3):48-51.6.苑宝玲,曲久辉.藻类肝毒素的富集提取与分离[J].分析化学, 2001,29(12):1406-1408.7.Bourne D G,J ones G J,Blakeley R L,et al.E nzymatic pathw ay for th e degradation of the cyanobacterial toxin microcystin LR [J].Ap pl E nviron M icrobiol,1996,62(11):4086-4092.8.Hiroshi Ishii,M iyuki Nishijima,T oshih iko Abe.Characteriza tion of degradation progres s of cyanobacteria h epatotoxin s by a gram-negative aerobic bacterium[J].W ater Resear ch,2004 (38):2667-2776.(上接第3页)~2006年来看NO2浓度整体变化呈下降趋势。