生物化学实验5

生物化学实验讲义化学工程与技术学院基础部实验一酪蛋白的制备一、目的学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。

二、原理．牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为 35g/L 。

酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7 。

利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH 调至4.7 时，酪蛋白就沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。

三、器材1 、离心机2 、．抽滤装置3 、精密 pH 试纸或酸度计4 、电炉5 、烧杯6 、温度计．四、试剂与材料1 、牛奶 2500mL2 、 95 ％乙醇 1200mL3 、无水乙醚 1200mL4 、 0.2mol ／ L pH 4.7 醋酸—醋酸钠缓冲液 3000mL5 、．乙醇—乙醚混合液 2000mL五、操作1、将 100mL 牛奶加热至 40 ℃。

在搅拌下慢慢加入预热至 40 ℃、 pH 4.7 的醋酸缓冲液 100 mL 。

用精密 pH 试纸或酸度计调 pH 至 4.7 。

将上述悬浮液冷却至室温。

离心 15 分钟 (3 000r ／ min) 。

弃去清液，得酪蛋白粗制品。

2、用水洗沉淀 3 次，离心 10 分钟 (3000r ／ min) ，弃去上清液。

3、在沉淀中加入30mL 乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。

用乙醇—乙醚混合液洗沉淀 2 次。

最后用乙醚洗沉淀 2 次，抽干。

4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。

5、准确称重，计算含量和得率。

含量：酪蛋白 g ／ 100mL 牛乳 (g ％ )得率：思考题1 、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？实验二小麦萌发前后淀粉酶活力的比较一、目的1. 学习分光光度计的原理和使用方法。

2. 学习测定淀粉酶活力的方法。

3 . 了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。

二、原理种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。

淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。

2 （ C 6 H 10 O 5 ） n +nH 2 O nC 12 H 22 O 11麦芽糖有还原性，能使 3 ， 5--- 二硝基水杨酸还原成棕色的 3- 氨基 -5- 硝基水扬酸。

后者可用分光光度计测定。

休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。

本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。

三、器材1.25mL 刻度试管2. 吸管3. 离心管4. 乳钵5. 分光光度计6. 恒温水浴7. 离心机四、试剂和材料1 、小麦种子2 、 o.1 ％标准麦芽糖溶液精确称量 100mg 麦芽糖，用少量水溶解后，移入 100mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度。

3.pH6.9 ， 0.02mol/L 磷酸缓冲液0.2mol/L 磷酸二氢钾 67.5mL 与 0.2mol/L 磷酸氢二钾 82.5 混合，稀释 10 倍。

4 、 1 ％淀粉溶液1g 可溶性淀粉溶于 100mL0.02mol/L 磷酸缓冲液中，其中含有 0.0067mol/L 氯化钠。

5 、 1 ％ 3 ， 5—二硝基水杨酸试剂将 1.00g3 ， 5—二硝基水扬酸溶于 20ml 2M L 1 NaOH 溶液和 50ml 水中，加入30g 酒石酸钾钠定容至 100ml 。

6 、 1 ％氯化钠溶液五、实验操作1 、种子发芽小麦种子浸泡 2.5 小时后，放入 25 ℃恒温箱内或在、室温下发芽。

2 、酶液提取取发芽第3 或第4 天的幼苗 15 株，放入乳钵内，加入 1% 氯化钠溶液 10mL ，用力磨碎。

在室温下放置 20 分钟，搅拌几次。

然后将提取液离心（ 1500r/min ） 6—7 分钟。

将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。

进行酶活力测定时，用缓冲液将发芽第 3 或第 4 天的幼苗稀释 10 倍。

取干燥种子 15 粒作对照（提取步骤同上）。

3 、酶活力测定（ 1 ）取 25mL 刻度试管 4 支，编号。

按下表要求加入各试剂（各试剂须在 25 ℃预热 10 分钟）试管标号试剂1 2 3 4干燥种子的酶提取液发芽第 3 或第 4 天的幼苗的酶提取液标准管空白管酶液（ mL ）0.5 0.5 ——标准麦芽糖溶液（ mL ）——0.5 —1 ％淀粉溶液（ mL ） 1 1 1 1 水（ mL ）———0.5将各管混匀，放在 25 ℃水浴中，保温 3 分钟后，立即向各管加入 1 ％ 3 ， 5—二硝基水杨酸溶液 2mL 。

（ 2 ）取出各试管，放入沸水浴加热 5 分钟。

冷却至室温，加水稀释至 25mL 。

并混匀。

在 A 500nm 处测定各管的吸光度。

填入表中试管号干燥种子的酶提取液发芽第 3 或第 4 天的幼苗的酶提取液标准管空白管A 500nm 吸光度4 、计算根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，本实验规定： 25 ℃时 3min 内水解淀粉释放 1mg 麦芽糖所需的酶量为 1 个酶活力单位（ u ）。

酶活力计算公式为：式中： C 酶酶液麦芽糖的浓度， V 酶提取酶液的总体积， n 酶酶液稀释倍数。

思考题1、为什么此酶提纯整个过程在 0—5 条件下进行？而测酶的活力时要在 25 预保温？反应后又放入沸水浴中？2、实验结果说明什么？实验三纸层析法分离鉴定氨基酸一、目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。

二、原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

层析溶剂由有机溶剂和水组成。

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用 R f 值 ( 比移 ) 来表示的：…在一定的条件下某种物质的只 R f 值是常数。

R f 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

本实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、器材1. 层析缸2. 毛细管3. 喷雾器4. 培养皿5. 层析滤纸 ( 新华一号 )四、试剂1 、扩展剂 650mL4 份水饱和的正丁醇和 1 份醋酸的混合物。

将 20mL 正丁醇和 5mL 冰醋酸放入分液漏斗中，与 15mL 水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。

取漏斗内的扩展剂约 5mL 置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。

2 、氨基酸溶液 0.5 ％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液 ( 各组份浓度均为 0.5 ％ ) 。

各 5mL3 、显色剂 50 ～ 100mL1. 1 ％水合茚三酮正丁醇溶液。

1. 将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。

2. 取层析滤纸 ( 长 22cm 、宽 14 cm) 一张。

在纸的—端距边缘 2 ～ 3cm 处用用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔 2cm 作一记号如图。

3. 点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这 6 个位置上，干后再点一次。

每点在纸上扩散的直径最大不超过 3 mm 。

4. 扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。

将盛有约 20mL 扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中 ( 点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线 1cm) 。

待溶剂上升 15—20 cm 时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

5. 显色用喷雾器均匀喷上 O.1 ％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤 5 分钟(100 ℃ ) 或用热风吹干即可显出各层析斑点。

6. 计算各种氨基酸的只 R f 值。

思考题1 、何谓纸层析法 ?2 、何谓片 R f 值 ? 影响 R f 值的主要因素是什么 ?3 、怎样制备扩展剂 ?3、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？实验四酶的特性一、目的加深对酶的性质的认识。

二、内容本实验由温度对酶活力的影响； pH 对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制剂；酶的专—性 4 组实验组成。

( 一 ) 温度对酶活力的影响酶的催化作用受温度的影响。

在最适温度下，酶的反应速度最高。

大多数动物酶的最适温度为 37-40 ℃，植物酶的最适温度为 50 ～ 60 ℃。

酶对温度的稳定性与其存在形式有关。

有些酶的干燥制剂，虽加热到 100 ℃，其活性井无明显改变，但在 100 ℃的溶液中却很快地完全失去活性。

低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。

2 、器材(1) 试管及试管架 (2) 恒温水浴 (3) 冰浴 (4) 沸水浴3 、试剂和材料(1)0.2 ％淀粉的 0.3 ％氯化钠溶液 150mL 需新鲜配制(2) 稀释 200 倍的唾液 50mL用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量筒并稀释 200 倍 ( 稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整 ) ，混匀备用。

(3) 碘化钾—碘溶液 50mL将碘化钾 20g 及碘 l0g 溶于 100mL 水中。

使用前稀释 10 倍。

4 、操作淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。

糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。

最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。

在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。

取 3 支试管，编号后按下表加入试剂：管号 1 2 3淀粉溶液 (mL) 1.5 1.5 1.5稀释唾液 (mL) 1 1 —煮拂过的稀释唾液 (mL) —— 1摇匀后，将 1 、 3 号两试管放入 37 ℃恒温水浴中， 2 号试管放人冰水中。

10 分钟后取出 ( 将 2 号管内液体分为两半 ) ，用碘化钾—碘溶液来检验 1 、 2 、 3 号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。

记录并解释结果，将 2 号管剩下的一半溶液放人 37 ℃水浴中继续保温 10 分钟后，再用碘液实验，结果如何 ?( 二 )pH 对酶活性的影响1 、原理酶的恬力受环境 pH 的影响极为显著。

不同酶的最适 pH 值不同。

本实验观察 pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适 pH 约为 6.8 。

2 ．器材(1) 试管及试管架 (2) 吸管 (3) 滴管 (4)50mL 锥形瓶 5) 恒温水浴 3 、试剂和材料(1) 新配制的溶于 0.3 ％氯化钠的 0.5 ％淀粉溶液 250 mL(2) 稀释 200 倍的新鲜唾液 100mL(3)0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 600mL(4)0.1 mol/L 柠檬酸溶液 400Ml(5) 碘化钾—碘溶液 50mL(6)pH 试纸 pH=5 、 pH=5.8 、 pH=6.8 、 pH=8 四种4 、操作取 4 个标有号码的 50mL 锥形瓶。

用吸管按下表添加 0.2mol ／ L 磷酸氢二钠溶液和 0.1 mol/L 柠檬酸溶液以制备 pH5.0 ～ 8.0 的 4 种缓冲液。

锥形瓶号码0.2mol ／ L 磷酸氢二钠0.1 mol/L 柠檬酸pH1 5.15 4.85 5.02 6.05 3.95 5.83 7.72 2.28 6.84 9.72 0.28 8.0从 4 个锥形瓶中各取缓冲液 3mL ，分别注入 4 支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加 0.5 ％淀粉溶液 2 mL 和稀释 200 倍的唾液 2mL 。