聚乙二醇牛血红蛋白偶联物对血清炎性因子的影响

聚乙二醇牛血红蛋白偶联物对血清炎性因子的影响作者：赵明霞，龙村，贺学英，管博，王蕊【摘要】目的探讨在体外循环（extracorporeal circulation，ECC）预充液中加入聚乙二醇牛血红蛋白偶联物（PEG-bHb）对兔血清炎性因子的影响。

方法 24只成年健康大耳白兔，通过股动脉、颈静脉插管建立体外循环通路，转流1 h。

随机分成三组，对照组（n＝8），以晶/胶体液作为ECC预充液；实验组1（n＝8），在预充液中加入PEG-bHb，PEG-bHb占总容量（兔循环血量＋预充量）的5%；实验组2（n＝8），预充液中加入PEG-bHb，占总容量（兔循环血量＋预充量）的15%，ECC开始时放出自体血（放血量占兔循环血量的20%），ECC 结束后将自体血回输。

每组监测ECC前、中和ECC后的血气参数，用ELISA法测定各时间点血清白介素－6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、C反应蛋白（CRP）浓度。

结果三组在ECC后各时间点的炎性因子无显著差异，但实验组2在ECC后各时间点的炎性指标较对照组相比有下降的趋势。

结论血液代用品PEG－bHb单纯用于预充对兔ECC 后炎性反应无影响，用PEG-bHb置换自体血有可能减轻兔ECC后炎性反应。

【关键词】炎性因子；血液代用品；体外循环；PEG-bHb Abstract: OBJECTIVE To investigate the effect of PEG-conjugated bovine hemoglobin (PEG-bHb) on inflammatory factors when added directly to extracorporeal circulation（ECC）prime in anaesthetized rabbit. METHODS 24 anaesthetized rabbits (2.59±0.19)kg, connected to ECC by jugular venous and femoral arterial cannulation and bypass for 1 hour, were randomly divided into 3 groups. In control group(n=8), a crystalloid/colloid solution was used as prime solution. In experimental group 1(n=8), PEG-bHb (5% total volume) was added to the pump prime of bypass. Total volume is the sum of circulation volume and prime volume. In experimental group 2(n=8), PEG-bHb (15% total volume) was used in the pump prime with previous blood harvesting(20% circulation volume) before ECC. Blood gas were monitored throughout the procedure. The inflammatory factors (IL-6,TNF-α,CRP) were measured using ELISA.RESULTS There were no significant difference of IL-6,TNF-α and CRP between three groups. But in experimental group 2, the inflammatory factors were less than those in control group, but not significantly.CONCLUSION PEG-bHb added to the prime of a rabbit ECC circuit does not independently affect inflammatory response. PEG-bHb on the prime with previous blood harvesting before ECC may improve inflammatory response.Key words： Inflammatory factor; Blood substitute; Extracorporeal circulation; PEG-bHb聚乙二醇牛血红蛋白偶联物（polyethylene glycolconjugated bovine hemoglobin，PEG-bHb）是我国研究开发的一种血红蛋白类血液代用品，研究表明，PEG-bHb具有良好的携带、释放氧的能力，同时具有大分子物质的扩容效应，因此，PEG-bHb在提升血压、恢复微循环血流量的同时，可以改善组织的氧供(资料由北京凯正生物工程发展有限责任公司提供)。

血液代用品摘要医学实践表明，对于急性大量失血的患者，如在受伤早期几小时内得到有效的血液补充，救治率可达90％以上。

研究人血代用品自然而然也就成了世界各国科学家争先涉足的领域。

用动物血液代替人血是人血代用品的主攻方向，血液中的最主要成分是人血红细胞。

研究人血代用品，实际上就是研究人血红细胞代用品。

血红蛋白是人血红细胞中的具有携氧功能的有效成分，我国科学家采用现代生物技术手段以动物血红蛋白为原料，采用分子修饰的方法有效的解决了输血过程致命的免疫反应。

最终将动物血红蛋白转化为安全有效的人血红蛋白代用品。

关键字人血代用品血红蛋白正文血液代用品的种类目前可载氧血液代用品的研究主要集中在两大类：氟碳类化合物(perfluorocarbon compounds，PFC)和血红蛋白类制剂(hemoglobin，Hb)。

1 氟碳类化合物(PFC)：这类化合物是一类直链或环状碳氢化合物的氟取代物，其特点能有效地溶解气体(02、CO2和其他气体)，不能直接溶于水，需经表面活性剂乳化后才能输入体内。

高氟碳乳胶液在血液中的半衰期取决于其相对分子质量，一般数小时至数天不等，通过体循环到达各个组织和器官，最终通过网状内皮系统以原形由肺排出。

第1代氟碳类化合物如2O％全氟萘烷已获FDA批准，但由于副作用强，还仅限于冠状动脉成形术后冠状动脉灌流。

第2代氟碳类化合物如全氟辛溴含有卵磷脂作为表面活性剂，具有更高携氧能力和保存期，被应用于静脉营养输入。

但其有限的氧含量和体内半衰期短影响其广泛应用。

全氟类化合物产生明显的流感样症候群副作用。

有人认为，此类副作用的出现是机体清除排斥反应的结果，也是体内单核和巨噬细胞被破坏、花生四烯酸分解代谢、前列腺素和过氧化物释放，以及引起迟发性发热反应的细胞因子的释放等因素参与作用的结果。

因此，全氟类化合物在广泛用于临床之前必须解决输注时产生的流感样综合征等副作用。

严格意义上说，全氟碳化合物还不等于血液代用品，其作用只能是在血液极稀释情况下维持组织的氧合作用，延缓自体血的回输时间。

聚乙二醇在药物制剂中的应用聚乙二醇别名聚氧乙烯醇或聚氧乙烯二醇,系环氧乙烷与单乙二醇或双乙二醇在碱性催化剂催化之下聚合而成,分子质量因聚合度不同而异,通常在200～35 000之间,PEG 的性质随分子质量而变化,目前常见的PEG种类有PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000等;药物溶剂PEG200、PEG300、PEG400、PEG600 系无色、略有微臭的粘性液体,化学性质稳定,安全低毒,故常作为药物的溶剂;另外,为了增加难溶性药物的溶解度,常使用潜溶剂即乙醇、甘油、丙二醇、苯甲醇、聚乙二醇等与水组成的混合溶剂;用于软胶囊剂软胶囊剂的囊材多以一定比例的明胶、增塑剂和水等组成,因此对蛋白质性质无影响的药物和附加剂均可填充;如各种油类、液态药物、药物溶液、药物混悬液和固体药物等;由于低分子质量PEG 能与水混溶,故是水溶性药物和某些有机药物很好的溶剂,如硝苯地平软胶囊;目前,软胶囊剂多为固体药物粉末混悬在油性或非油性PEG400 等分散介质中包制而成;另有报道,水合氯醛应用聚乙二醇作为溶剂可大大降低它对明胶蛋白的分解作用用于注射剂由于PEG200～PEG600 可提高难溶性药物的溶解度且对水不稳定药物有稳定作用,故可作为注射用溶剂;单一以PEG 作为注射用溶剂的注射剂并不多见,如噻替哌注射液以PEG400 或PEG600作为溶剂,可避免噻替哌在水中的聚结沉降作用；盐酸苄去氢骆驼莲碱注射液以 PEG200 作为溶剂,安全稳定,贮放 2 a 保持不变;但一般多用混合溶剂潜溶剂,如以V PEG300: V苯甲醇: V 丙二醇 = 80:5:15 时可作为质量分数为5 % 黄体酮或睾丸酮注射液的混合溶剂,此2 种注射液经肌肉注射后,与体液接触即在局部析出药物沉淀,形成药物仓库,逐渐从组织中释放,具有长效作用,售商品有病毒灵注射液、安乃近注射液、痢菌净注射液、穿心莲注射液、菌毒杀星注射液等;用于滴眼剂研究表明,以PEG400 为溶剂,可制成吲哚美辛滴眼剂;对此滴眼剂进行的稳定性研究结果表明,PEG400 处方优于Span80 处方;另外,PEG 可作为滴眼剂中的增稠剂,增加粘度,使药物在眼内停留时间延长,从而增加药效,减少刺激作用;润滑剂与粘合剂PEG4 000、PEG6 000是片剂中水溶性润滑剂的典型代表,在片剂处方中可直接加入适量聚乙二醇进行整粒,也可将其先配成醇溶液、混悬液或乳液进行制粒,润滑效果不变;利用聚乙二醇制得片剂的崩解和溶出不受影响,可提高主药在胃内的溶解性,最终有助于增加生物利用度;近年来,聚乙二醇在片剂中的使用越来越广泛,它们不仅可用作润滑剂,还可作为粘合剂,以PEG4 000最为常用;如以 PEG4 000为粘合剂熔点较低,在高速搅拌下呈熔融态,α -乳糖为填充剂,交联聚乙烯吡咯烷酮为崩解剂,硬脂酸镁为润滑剂,采用熔融制粒法可制备卡马西平速释片另外对于热不稳定药物,若采用 PEG4 000为粘合剂,可在干燥状态下进行粉末直接压片,效果较为理想;市售商品主要有痢菌净片、多钙片、钙中钙片、痢特灵片等;药物载体PEG 随分子量的增加则由液体逐渐呈半固体至固体,熔点也随之升高;由于PEG 对人体无毒无害,亦无致畸,致癌和基因突变等副作用,且可增加某些药物的溶出速率,提高药物的生物利用度,故是最常用的水溶性载体之一;基质PEG 是一类亲水性基质,其性质稳定,对皮肤无刺激性,而具有润滑性,故广泛应用于软膏剂、栓剂、凝胶剂、滴丸剂、乃至胶囊剂;如水硫软膏基质系由PEG300 与PEG4 000质量比为 2:1 时于70 ℃水浴熔合而成;复方磺胺甲恶唑SMZ栓以mPEG6 000 : mPEG4 000:m水=57:33:10 为基质,其融变时限和体外药物溶出速率均优于可可豆酯、半合成脂肪酸酯等基质;以PEG 为基质,加入主药和一些药物赋形剂可制备水凝胶剂,如氯硝西泮水凝胶,擦在病人身体上可使药物快速透过皮肤进入血液循环从而发挥抗惊厥作用;另外,PEG400、1 500、4 000～20 000 均可作为半固体基质,将硬胶囊改装液体或半固体药液,如硝苯地平1 份、液体 PEG 5 ～25份、PVP ～10 份混合药液罐装的硬胶囊剂具有长效作用,可广泛用于心绞痛的治疗聚乙二醇作为软膏剂水溶性基质,市售的品种有百多邦莫匹罗星、环丙沙星霜等；作为栓剂基质,市售的品种有制霉菌素栓、甲硝唑栓、新霉素栓等;固体分散材料固体分散体系指药物以分子、胶态、无定型、微晶等状态均匀分散在某一固体载体物质中所形成的分散体系;PEG 分子质量为1 000～20 000 是一类常用的水溶性载体材料,可用于增加药物的溶出速率,如以 PEG6 000作为载体,采用熔融法制备格列苯脲固体分散体,其溶出速率和生物利用度与市售达安宁片相比显着提高PEG 也可作为缓释固体分散体的载体材料,如采用熔融法,将药物溶解于熔化的PEG 中,将药液装入硬胶囊中,室温下药液固化,药物按溶蚀机制缓慢释放,故具有缓释作用;另外,药物从PEG 载体中溶出的快慢主要受PEG 分子质量的影响,一般随着 PEG分子质量增大,药物溶出速率会降低;当药物为油类时,宜用分子质量更大的 PEG 类作为载体,如PEG12 000 或PEG6 000与PEG20 000 的混合物,若单用 PEG6 000作载体,固体分散体会变软,特别是在温度高时载体会发粘稳定剂目前,蛋白质类药物制剂的主要问题是药物稳定性差;对于液体剂型蛋白质类药物,可通过加入辅料稳定剂如聚乙二醇、糖类、盐类、表面活性剂等改变其性质增加稳定性;高浓度的PEG常作为蛋白质的低温保护剂和沉淀/ 结晶剂,它可与蛋白质的疏水链作用;研究表明,不同分子量的PEG 作用不同,如 PEG300 质量分数为 %或2 % 可抑制rhKGF 重组人角化细胞生长因子的聚集；PEG200、400、600 和1 000可稳定 BSA 和溶菌酶；PEG4 000不同质量分数可高达质量分数15 %可抑制低分子量尿激酶的热聚集此外,复合型乳剂稳定性差也是妨碍其广泛应用的主要原因;W/O/W型复乳常见的问题是分层,不过发生了分层的复乳经振摇后可复原;油膜破裂使内水相外溢是W/O/W型复乳不稳定的主要原因;若在内外水相中加入高分子物质作为稳定剂可增加其稳定性,如在外水相中加入PEG 、泊洛沙姆等可使复乳的粘度增大,降低复乳乳化膜的流动性,这对减小W/O/W型复乳的分层是有利的,且不影响其倾倒性和通针性;增塑剂与致孔剂PEG 是亲水性高分子物质,可作为增塑剂以改变聚合物的物理机械性质,使其更具柔顺性、塑性;如为了使明胶微囊具有良好的可塑性,不粘连且分散性好,常需加入增塑剂如聚乙二醇,山梨醇,丙二醇,甘油等;研究表明,在单凝聚法制备明胶微囊时,加入增塑剂可减少微囊聚集,降低囊壁厚度,且加入增塑剂的量同释药半衰期之间呈负相关;PEG 作为增塑剂也广泛应用于薄膜包衣材料中,PEG 带有羟基,可作为某些纤维素衣材的增塑剂,如以醋酸纤维素为膜材,PEG400 为增塑剂,阿拉伯胶为渗透压活性物质和助悬剂所制备的难溶性药物萘普生的单室单层渗透泵上下面均有释药小孔以零级速率释药,药物在12 h 的累积释放率可达 81 %;此外,PEG 作为增塑剂在膜剂和涂膜剂中也有应用;PEG 是能与水互溶的聚合物分子,所以 PEG 可作为膜控型缓控释药物的致孔剂;PEG 这类致孔剂能很快溶于介质中,形成较大的孔道,随着孔道的增加,外部溶剂很容易扩散穿过控释膜,加速了药物的释放;因而通过选择合适的聚合物衣膜和致孔材料可使药物达到恒速释放;如头孢氨苄缓释小丸以乙基纤维素为包衣材料,PEG6 000为致孔剂,此缓释胶囊包衣增质量 30 %,在 7 h内表现为药物零级释放,释药重现性良好;又如伪麻黄碱渗透泵无释药小孔以醋酸纤维素为膜材,酞酸二乙酯和PEG400 为致孔剂,碳酸氢钠为渗透压活性物质,其在12 h 内遵循零级释药规律修饰材料聚乙二醇类PEG 修饰剂是 pH中性、无毒、水溶性的聚合物,具有高度的亲水性和良好的生物相容性及血液相容性,并且没有免疫原性;故采用PEG 进行结构修饰可改善药物的以下性质：1 增加稳定性,降低酶降解作用；2 改善药物动力学性质,如延长血浆半衰期、降低最大血药浓度、血药浓度波动减小等；3 降低免疫原性和抗原性；4降低毒性,提高体内活性；5改善体内药物分布,靶向性增强；6 减少用药频率,提高病人依从性用于修饰脂质体传统脂质体和免疫脂质体易被网状内皮系统RES 的细胞识别并摄取,导致血循环半衰期很短通常低于30 min,到达靶器官之前即被清除,故应用很受限制;若在脂质体膜表面引入亲水性聚合物分子PEG ,可在脂质体表面形成一层水化膜,掩盖脂质体表面的疏水性结合位点,阻碍血浆成分接近脂质体,从而降低RES 对脂质体的识别和摄取,延长脂质体的血循环时间;PEG 修饰脂质体可以在病变部位如肿瘤、感染、心肌梗死等区域通过所谓的“被动靶向” 或代偿滤过机制缓慢积累,并促进药物在这些区域的转运;如PEG 修饰的多柔比星脂质体在动物实验及人体临床试验中均取得显着效果,且已有产品长效脂质体多柔比星Doxil 上市;此外,PEG 修饰的阿霉素脂质体与传统的阿霉素脂质体相比,药代动力学特征显着变化,抗肿瘤活性明显增强,毒性有所降低;这表明了PEG 修饰脂质体是一种很有前景的药物传递系统;用于修饰乳剂长循环乳剂是指对静脉注射用脂肪乳剂表面进行适当的修饰,以避免单核吞噬细胞系统MPS 的吞噬,延长体循环时间的乳剂;乳滴表面被柔顺而亲水的 PEG 链覆盖,亲水性增强,减少血浆蛋白与其相互作用的几率,降低被 MPS 吞噬的可能性;以二棕榈酰磷脂酰胆碱为乳化剂,助乳化剂,三油酸甘油酯为油相,加入适量PEG 修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE-PEG,可制得粒径为44 nm 的微乳,静注后在血中的清除率比未经修饰的微乳明显降低布洛芬溶解度极小,市售只有其衍生物氟布洛芬酯的乳剂,Park 等以油酸乙酯为油相、卵磷脂为乳化剂、DSPE-PEG 为助乳化剂制备了氟布洛芬微乳,与前者相比,t1/2、AUC、MRT都显着增加,同时可降低MPS的吞噬;另外,据文献23 报道,以 PEG 和叶酸修饰的阿柔比星微乳对于癌细胞具有显着的靶向性;用于修饰纳米粒和微球可生物降解的聚合物纳米粒作为药物输送载体有很多优势,如可控释、靶向、低毒等;但是,由于聚合物纳米粒经静脉给药后,数秒或数分钟内会被RES 清除而无法普遍应用;为克服这一缺点,可引入亲水性聚合物PEG 对聚合物进行修饰;研究表明,亲水性PEG 修饰的纳米粒,用于静脉给药时,血液清除和RES 摄取显着减小,并且PEG 引入会影响纳米粒的生物降解行为,调节释药方式;如Ruxandra 等以乳化溶剂蒸发法制备的环孢酶素CyA PLA-PEG共聚物纳米粒粒径分布很窄,呈单峰分布,且此分散体系性质稳定,包封率很高83 ℅ ～96 ℅ ,其体外释药符合扩散机制;另外,PEG 修饰的吲哚美辛脂质微球与传统的脂质微球相比,体内总清除率明显降低,药物靶向性显着提高,药物动力学参数如t1/2、AUC、MRT都显着增加用于修饰多肽和蛋白类药物 PEG 末端的醇羟基化学性质不活泼,为保证其与药物活性基团间有适宜的反应速率,需对醇羟基进行活化,以利于与蛋白质的α-和ε-氨基的反应;按PEG 与蛋白质氨基形成的连接键类型,活化PEG 可分为以下两类：1 烷基化 PEG ,如醛基化 PEG 、PEG-三氟乙基磺酸酯PEG-T 等；2 酰化 PEG ,如 PEG 琥珀酰亚胺基琥珀酸酯PEG-SS、PEG 琥珀酰亚胺基碳酸酯PEG-SC等;蛋白质和多肽类药物主要包括酶、细胞因子等一些具有特殊功能的蛋白质,其PEG 的修饰即PEG 化,是将活化的 PEG 通过化学方法偶联到蛋白质和多肽上;PEG 修饰蛋白药物可以延长药物的半衰期、降低免疫原性和毒副作用,同时最大限度地保留其生物活性;自从1991 年第一种用 PEG 修饰的腺苷脱氨基酶PEG-ADA被 FDA 批准上市后, PEG 修饰药物蛋白的技术飞速发展,近几年上市的还有PEG-干扰素、PEG-GSF、PEG-生长抑素;如普通干扰素α-2b 的半衰期只有 4 h,而经过聚乙二醇化的干扰素α-2b 的半衰期达 40 h ,可在体内持续作用168 h,刚好满足1 周1 次给药;故聚乙二醇干扰素又叫长效干扰素商品名：佩乐能;另外,PEG 修饰的重组人粒细胞集落刺激因子也已经上市,其体内半衰期显着延长,临床上用于治疗化疗引起的嗜中性白血球减少症;目前处于临床前研究的 PEG 修饰的蛋白药物有几十种,处于临床实验的有：超氧化物歧化酶即将上市,美国Enzon 公司、白介素-2 Ⅱ期临床,挪威Chiron 公司、水蛭素Ⅱ期临床,德国 BASF AG公司、抗-TNFα抗体片段Ⅲ期临床,瑞典Pharmacia公司、牛血红蛋白Ⅰ期临床,美国Enzon 公司、抗-PDGF 抗体片段Ⅱ期临床,英国Celltech公司等;渗透促进剂渗透促进剂是指能可逆的改变皮肤角质层的屏障功能,又不损伤任何活性细胞的化学物质;理想的渗透促进剂应无药理活性、无毒、无刺激性、无致敏性,与药物、基质和皮肤有良好的相容性,无臭无味;常见的渗透促进剂有亚砜类、表面活性剂类、多醇类、吡咯酮类等;多醇类化合物有乙醇、丙二醇、聚乙二醇、异丙醇和丙三醇等;多元醇类的作用机制是使角蛋白溶剂化,占据蛋白质的氢键结合部位,减少药物与组织间结合,增加并用的其他渗透促进剂在角质层的分配;Chaudhuri等比较了心得安在 5 种介质中的人体透皮速率,结果 PEG > 二乙醇 > pH 磷酸盐缓冲液 > 辛醇 > 肉豆蔻酸异丙酯;据 Touitou等报道,包含油酸、PEG 等基质能使茶碱对大鼠的透皮吸收增强260 倍;另有研究表明,在1 % 普萘洛尔水溶液中各加 5 % 的促渗剂,对 5 种渗透促进剂促渗效果进行了比较,结果二甲基亚砜 > PEG400 ,油酸 > 丙三醇 > Span80 ;综上,PEG 在透皮吸收制剂中的作用并不亚于油酸;但据研究报道,PEG 由于含有大量的醚氧原子,与药物产生氢键结合可能性很大,这势必降低药物的热力学活性;同时,由于 PEG 本身粘度较大,故会增加载体微环境的的粘度,这样不仅抑制了角质层的水合,而且角质层会因其高渗作用发生脱水,促渗效果并不理想;因此,PEG 应与油酸、氮酮、丙二醇等促渗剂联合应用应用局限性聚乙二醇有以下缺点：作为软膏基质时,长期应用可引起皮肤干燥；可与一些药物如苯甲酸、水杨酸、鞣酸、苯酚等络合,导致基质过度软化,也会降低酚类防腐剂的活性;聚乙二醇作为软胶囊填充剂时,由于选择性吸收胶囊壳内水分,导致囊壳硬化,从而影响药物释放速率;制备栓剂易出现孔洞影响外观；随高分子量的聚乙二醇加入量增加,水溶性药物的释放率减小;对粘膜的刺激性比脂肪性基质大;聚乙二醇的不良反应已有报道：局部用药可能引起过敏反应,包括荨麻疹和延迟性过敏反应；最严重的不良发应在烧伤病人局部应用聚乙二醇产生的高渗性,代谢物的酸中毒和肾功能减退;低分子量的聚乙二醇毒性最大,但二醇类毒性是相当低的;。

聚乙二醇－牛血红蛋白停搏液对离体心脏功能和超微结构的影响【摘要】目的观察含聚乙二醇－牛血红蛋白（polyethylene glycol-bovine hemoglobin， PEG-bHb）的心脏停搏液对离体心脏功能的影响。

方法 32只成年雄性S-D大鼠根据停搏液不同随机分为4组，麻醉后开胸取心，建立Langendorff离体心脏灌注模型，平衡20 min后灌注冷St. Thomas液或三种不同浓度的PEG-bHb停搏液，30℃保持60 min后恢复灌注。

记录各组左室发展压（LVDP）、左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）和冠脉流出量（CF）等血流动力学指标，并行超微结构观察。

结果恢复灌注后，三个PEG-bHb组的LDVP、±dp/dtmax及CF均显著高于St.Thomas液组（P<0.05），超微结构也得到较好的保护。

三个PEG-bHb组之间除CF外，其余指标均无明显差异（P>0.05）。

结论以PEG-bHb制成的含血停搏液可以改善离体心脏的血流动力学表现和超微结构。

【关键词】聚乙二醇－牛血红蛋白停搏液心脏功能血流动力学超微结构Abstract: OBJECTIVE To evaluate the effect of polyethyleneglycol-bovine hemoglobin (PEG-bHb)-containing cardioplegic solution on cardiac function in isolated animal hearts. METHODS The hearts of 32 male S-D rats were harvested and transferred to langendorff circuit. They were pided into 4 groups according to cardioplegia: St.Thomas or 3 different concentrations of PEG-bHb in St.Thomas solution. After 20 min balance period，hearts were perfused with cold (4℃) cardioplegic solutions，and preserved at 30℃ for 60 min， then reperfused. RESULTS After reperfusion， left ventricular developed pressure (LVDP)，derivative of pressure (±dp/dtmax) and coronary flow (CF) were higherin PEG-bHb groups (P<0.05). Ultrastructures were better preserved inPEG-bHb groups. There was no difference among 3 PEG-bHb groups except CF. CONCLUSION PEG-bHb in cardioplegic solutions can improve hemodynamic values and ultrastrctures in hearts after ischemia.Key words： Polyethylene glycol-bovine hemoglobin; Cardioplegic solution;Myocardial function;Hemodynamics;Ultrastructure70年代晶体停搏液成功用于心脏手术，随后Follette等［1］提出了含血心脏停搏液。

血红蛋白氧载体研究进展王程;隋春红;吕士杰【摘要】血红蛋白氧载体(HBOCs)作为血液代用品有广阔的临床应用前景.将无细胞基质血红蛋白制备成适用于临床的HBOCs已经历了30余年研究,国内近几年的HBOCs产品研究也有长足进步.本文综述了HBOCs制备所用血红蛋白的来源、无基质Hb及各种HBOCs作为基础血液代用品的最新研究进展.【期刊名称】《吉林医药学院学报》【年(卷),期】2008(029)001【总页数】5页(P44-48)【关键词】血红蛋白氧载体;血液代用品【作者】王程;隋春红;吕士杰【作者单位】吉林医药学院,生化教研室,吉林,吉林,132013;吉林医药学院,化学教研室,吉林,吉林,132013;吉林医药学院,生化教研室,吉林,吉林,132013【正文语种】中文【中图分类】R452自1901 年维也纳大学Landsteiner首先发现人红细胞血型以来[1]，输血成为医疗的一部分。

临床常规输血技术是安全的，但是由于血液贮存期短、供-受血者之间需要配型、血液传播血源性疾病等原因，限制了配体输血技术在紧急状况的广泛应用，由此促进了血液代用品的研究开发。

血液代用品是具有携氧扩容功能的溶液，有人将其定义为“携带氧气的扩容剂”[2]，必须具备来源充足、无毒性、无免疫原性、良好的流变学性质、较长的血管内存留时间和正常的生理代谢途径等特点。

目前有两类血液代用品正在研究开发之中：一类是血红蛋白氧载体(hemoglobin-based oxygen carriers，HBOCs)，另一类是氟碳化合物(Perfluorocarbon Compounds，PFC)。

在此主要阐述HBOCs的研究进展。

1 制备HBOCs的血红蛋白来源目前用于制备HBOCs的血红蛋白(hemoglobin,Hb)来源有3种：一是过期的人血红细胞(outdated human erythrocy)。

由于其来源限制，难以大规模发展人源性HBOCs。

摘要越来越多的蛋白质多肽类药物被应用于人类疾病的治疗，与其它合成化学药物相比，它们有易引起机体的免疫反应，体内半衰期短，在体内易水解、变性等缺点。

化学修饰作为一种新兴技术，能改善上述不良特性。

本文主要优化合成了一种PEG修饰剂——mPEG．NHs，采用牛血清白蛋白BsA和溶菌酶作为模式蛋白对其修饰条件进行了优化，并用层析法分离修饰后蛋白质。

mPEG．NHS的合成主要通过两个反应得到，第一步是mPEG同丁二酸酐之间的酯化反应，得到mPEG—SA，第二步是mPEG—SA同NHS(N．羟基硫代琥珀酰亚胺)反应，在脱水剂DCCI(N．N’一二己基碳二亚胺)的催化下得到mPEG．NHS。

通过优化反应条件使得mPEG的转化率和mPEG．NHs的纯度都得到提高。

优化后反应条件分别为：n1酯化反应采用毗啶为催化剂，酸醇比为10：I，反应时间3 h；f2)脱水反应时间25h，温度400C反应物摩尔比mPEG．sA：NHS为1：2．5。

优化后的两步反应的转化率分别为60．1％和56．O％。

mPEG—NHS修饰蛋白质在不同的反应条件下得到不同修饰率的蛋白质，优化反应条件后能得到更高氨基修饰率的修饰产物。

最佳修饰反应条件为：反应时间10min，蛋白质和修饰剂质量比为1：5，采用pH=9．O的硼砂缓冲液，在优化条件下可得到修饰率为47．5％的产物。

由于修饰反应得到的蛋白质溶液中含有连接有修饰剂的蛋白质和未连接修饰剂的蛋白质，可通过层析的方法将它们分离开。

溶菌酶修饰产物采用seDhadex G．75凝胶层析和Deae．sepharose CL-6B阳离子交换层析相结合的方法：BsA 修饰产物采用sephadex G．100和Q．SeDharose阴离子交换层析相结合的方法。

用sDs．PAGE电泳检测分离产物，证明未修饰的蛋白质同被修饰的蛋白质被分离开来。

关键词：PEG修饰化学修饰合成优化分离层析随着生物工程技术的迅速发展，生物技术活性物质不断面世，已有不少生物技术药物应用于I}缶床，国内外已批准上市的约40多种，目前正在研究的则成倍增加，在这些品种中，大量的均为多肽与蛋白质类药物“。

142019·12中国工作犬业Disease· breeding犬病 繁育犬膀胱移行上皮癌的病例报告陶巍夫 卫少光 倪宏波>>> 一、病例信息雪纳瑞犬，雌性，11kg，疫苗驱虫完全，未绝育，犬粮饲喂为主。

持续血尿约2年，近3天全程红色尿液。

>>>二、临床检查（一）理学检查体温38.6℃、呼吸数22次/min、脉搏135/min。

ASA 评分Ⅱ级，BCS 评分5分。

（二）血液学检查血液学检查见表1～2，血液生化检测显示肌酐降低，血液细胞分析结果显示白细胞总数、淋巴细胞数目和淋巴细胞百分比升高，中性粒细胞百分比、红细胞总数、血红蛋白、红细胞压积、平均血红蛋白浓度降低。

提示机体可能存在病毒感染、严重贫血。

犬膀胱肿瘤占已报告犬肿瘤的2%，犬膀胱移行上皮癌(TCC)约占膀胱肿瘤的90%。

TCC 是一种侵袭性很强的肿瘤，常发生于膀胱三角区。

TCC 的临床症状包括血尿、排尿困难、尿频和尿淋漓等。

手术治疗可能出现局部和远端转移，化疗治疗可改善犬的生活质量，但多数犬的TCC最后会死亡。

表1 血液细胞分析仪检测报告表2 血液生化检测报告152019·12中国工作犬业Disease· breeding犬病 繁育（三）影像学检查（大概）X 线检查见图1~4，胸片显示肺部非血管线性纹理增多，考虑与老年相关，腹片显示膀胱内存在3颗结石。

B 超检查见图5，膀胱内可见3.29mm×1.40mm 中等回声、不规则团块，考虑膀胱肿瘤或息肉。

图1 术前胸部腹背位X 线图2 术前胸部右侧位X 线图3 术前腹部右侧位X 线图4 术前腹部腹背位X 线图5 膀胱B 超检查>>>三、诊断结果膀胱结石，膀胱内肿物。

>>>四、手术治疗（一）麻醉方案麻醉前吸氧3min，后按每千克体重静脉注射丙泊酚5mg 诱导麻醉，诱导后进行气管插管。

聚乙二醇在医药行业的应用中国医药对外贸易公司 张建革，徐冲，王飏摘要：聚乙二醇是一种常用的药用辅料，在多种剂型中广泛应用，且可以作为药物的修饰材料和原料药。

本文综述聚乙二醇在医药行业的应用情况。

关键词：聚乙二醇、药用辅料、应用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）别名聚氧乙烯醇或乙二醇聚氧乙烯醚，系环氧乙烷与单乙二醇（或双乙二醇）在碱性催化剂催化之下聚合而成，分子质量因聚合度不同而异，通常在200至20000之间，其化学通式为HOCH2(CH2 OCH2)n CH2OH。

PEG通过平均分子量来命名，目前常用的PEG种类有PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG1000、PEG1450、PEG3350、PEG4000、PEG6000、PEG8000 等。

PEG的性质随分子质量而变化，PEG1000为半固体，分子量低于1000的为液体形态，高于1000的为固体形态，随着分子量的增加其水溶性逐渐降低。

PEG最突出特性是它与各种溶剂的广泛相容性、广泛的黏度范围、保湿性、粘结性和热稳定性，而且具有低毒性、不凝血性以及生物相容性，能被机体迅速排出体外而不产生任何毒副作用等诸多优点，因此被广泛应用于医药领域多种剂型，如软膏、栓剂的基质，片剂、丸剂的载体等。

1 药物载体由于PEG 对人体无毒无害，亦无致畸，致癌和基因突变等副作用，且可增加某些药物的溶出速率，提高药物的生物利用度，故是最常用的水溶性载体之一。

1.1 基质PEG 是一类亲水性基质，其性质稳定，对皮肤无刺激性，而具有润滑性，故广泛应用于软膏剂、栓剂、凝胶剂、滴丸剂、胶囊剂。

复方磺胺甲噁唑（SMZ）栓以m(PEG6 000) :m(PEG4 000):m(水)=57:33:10 为基质，其融变时限和体外药物溶出速率均优于可可豆酯、半合成脂肪酸酯等基质；水硫软膏基质系由PEG300与PEG4000质量比为2:1时于70℃水浴熔合而成[1]。

28
图2 治疗第2、3、5天超声复查结果
注：A中绿色箭头指示高回声的肠系膜；B中的绿色五角星位
置为腹水；C中的绿色箭头指出回声增强的肠系膜。

讨论与结论
为了更精确地制定治疗方案和给出预后，临床兽医
需要将肾衰病例进一步区分为急性肾衰和慢性肾衰。

AKI是肾功能的突然下降，而CKD是指肾损伤已超过
个月以上的慢性肾病[7]。

AKI的肾功能不全是可逆的
表2 治疗不同时间点的血常规复查结果（仅列出部分异常数据）
治疗时间D2D5D7
白细胞（WBC）20.7642.5859.0824.75
淋巴细胞（LYM） 2.60 2.34 4.5 3.62
中性粒细胞（NEU）17.0239.6553.2719.80
红细胞（RBC） 5.838.817.807.45
65.122.8
2.09
111
128151。

㊀第41卷㊀第5期2022年5月中国材料进展MATERIALS CHINAVol.41㊀No.5May 2022收稿日期:2021-04-15㊀㊀修回日期:2021-11-25基金项目:国家自然科学基金资助项目(81971750);江苏省自然科学基金资助项目(BK20191266)第一作者:李㊀菂,女,1996年生,硕士研究生通讯作者:杨㊀芳,女,1979年生,教授,博士生导师,Email:yangfang2080@韩樾夏,男,1981年生,博士,助理研究员,Email:yuexia@DOI :10.7502/j.issn.1674-3962.202104022血红蛋白氧载体的研究与应用进展李㊀菂1,韩樾夏2,杨㊀芳1(1.东南大学生物科学与医学工程学院江苏省生物材料与器件重点实验室,江苏南京210096)(2.中国科学院空间应用工程与技术中心,北京100094)摘㊀要:人体多种疾病的发生常伴随着缺氧情况和乏氧微环境的出现,因此,研发性能良好的氧载体,在疾病病灶特异性递送高浓度的氧气,有望成为相关疾病治疗的新方法之一㊂血红蛋白来源于生物体本身,是红细胞的主要组成部分,其依靠分子中心血红素中的铁原子承担机体氧气运输的功能㊂因其独特的携氧特性以及优异的生物相容性与安全性,成为人工携载氧的优良仿生生物载体㊂然而,由于游离血红蛋白具有运载缺陷与肾毒性,研究者们通过偶联㊁交联㊁吸附等化学修饰或脂质体㊁聚合物等微囊包封等多种手段,在实现高氧负载的条件下,增长其循环时间㊂构建的这些新型氧载体结构被用于贫血㊁脑损伤㊁恶性肿瘤㊁缺血性休克㊁骨骼肌疲劳及器官肢体灌注的治疗㊂综述了近年来血红蛋白氧载体材料加工制备中的相关化学修饰与微囊封装手段与方法,及其面向多类疾病的治疗应用与结合其它疗法的联合治疗应用㊂关键词:血红蛋白;氧载体;氧气传输系统;乏氧;修饰;包载中图分类号:R457;R963;TQ460.6㊀㊀文献标识码:A㊀㊀文章编号:1674-3962(2022)05-0338-07引用格式:李菂,韩樾夏,杨芳.血红蛋白氧载体的研究与应用进展[J].中国材料进展,2022,41(5):338-344.LI D,HAN Y X,YANG F.Research and Application Progress of Hemoglobin Oxygen Carrier[J].Materials China,2022,41(5):338-344.Research and Application Progress ofHemoglobin Oxygen CarrierLI Di 1,HAN Yuexia 2,YANG Fang 1(1.Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices,School of Biological Science and Medical Engineering,Southeast University,Nanjing 210096,China)(2.Technology and Engineering Center for Space Utilization,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100094,China)Abstract :The occurrence of a variety of human diseases is often accompanied by the emergence of hypoxia and hypoxicmicroenvironment.Therefore,the development of oxygen carriers with good performance becomes the key to overcome vari-ous diseases and achieve many medical functions.Hemoglobin comes from the live organism.As the main component of red blood cells,hemoglobin relies on the iron atom in the molecular center heme to play the function of oxygen transport.Be-cause of its unique oxygen carrying properties,excellent biocompatibility as well as safety,hemoglobin has become a good choice for artificial oxygen carrier.Due to the transport defects and nephrotoxicity of free hemoglobin,researchers have ex-tended its circulation time,improved its oxygen carrying efficiency,expanded its applicable conditions and enriched its med-ical functions by chemical modification such as coupling,cross-linking and adsorption or microencapsulation with liposome and polymer.These oxygen carriers are used to treat anemia,brain injury,malignant tumor,ischemic shock,skeletal mus-cle fatigue and organ and limb perfusion.This paper reviews the chemical modification and microencapsulation methods inthe preparation of hemoglobin oxygen carriers in recent years,as well as the treatment methods for many kinds ofdiseases and the combined application with other therapies.Key words :hemoglobin;oxygen carrier;oxygen deliv-ery system;hypoxia;modification;encapsulation1㊀前㊀言氧在自然界中分布非常广泛,更是生命之源㊂对于生物与医疗来说,许多病症均伴随着氧气的缺乏,因此All Rights Reserved.㊀第5期李㊀菂等:血红蛋白氧载体的研究与应用进展不断开发与更新性能良好的医用载氧材料成为热门的研究课题㊂血红蛋白来源于生物体本身,作为红细胞的主要组成部分,依靠分子中心的铁原子承担机体氧气运输的功能,在携氧能力㊁安全性或生物相容性方面,均具有独特的优势㊂由此,以血红蛋白为基础的氧载体在生物医学领域的相关研究应运而生㊂血红蛋白氧载体通常由血红蛋白加以化学修饰,或由多种材料组成的膜壳结构包封构成,应用于多种由于缺氧引起或呈现乏氧症状的疾病的治疗㊂如图1所示,本文对近年来血红蛋白氧载体的制备研究与临床应用进展进行综述㊂图1㊀血红蛋白氧载体构建与应用示意图Fig.1㊀Construction and application of hemoglobin oxygen carrier2㊀血红蛋白的化学修饰血红蛋白因其对氧的攫取和运载能力而成为人工氧载体的良好选择㊂然而,裸露在血液中的血红蛋白容易被人体固有免疫系统识别并迅速清除㊂且游离于血液中时,血红蛋白分子中的2对珠蛋白链构成的四聚体极易降解为二聚体,使其不仅失去载氧功能,而且产生肾毒性[1,2],危害人体健康㊂为了克服这一问题,研究者需要对血红蛋白氧载体进行表面化学修饰或包封,以保证安全性与良好的携氧能力,从而延长循环时间,提高载氧效率㊂在化学修饰层面,多使用偶联㊁交联或物理吸附等方式增加血红蛋白的稳定性㊂2.1㊀氧化葡聚糖修饰血红蛋白Hickey等[3]通过控制乙醇的浓度沉淀血红蛋白,合成了粒径约为250nm的去溶剂化血红蛋白纳米颗粒,如图2所示,其以氧化葡聚糖作为有效的表面稳定剂,保持粒子的完整性,改善了普通聚合血红蛋白材料颗粒大小和形状不均匀等缺点㊂Kloypan等[4]也进行了氧化葡聚糖交联血红蛋白的制备研究,该材料溶血率低,不影响白细胞的吞噬功能,也不会引起血小板的活化,因此具有良好的血液相容性,是很有前景的氧气及药物载体㊂氧化葡聚糖的修饰步骤相对简单,虽然在材料携氧量上不具有附加优势,但可基本维持血红蛋白的化学稳定性,并规避体内屏障,保障顺利运氧㊂图2㊀去溶剂化血红蛋白纳米颗粒合成示意图[3]Fig.2㊀Synthesis schemitc of desolvent hemoglobin nanoparticles[3]2.2㊀戊二醛多聚血红蛋白Gu等[5]制备了具有不同交联密度的超高分子量(>500kDa)的结合氧气(松弛态,R态)或未结合氧气(紧张态,T态)的戊二醛聚合牛血红蛋白(PolybHbs),如图3所示,其均具有良好的携氧能力,其中T态Poly-bHbs的氧气卸载速率明显更高㊂Belcher等[6]尝试了气体交换和试剂添加的控制方法,采用完全耦合的小型切向流超滤系统对合成的聚合人血红蛋白(PolyhHb)分子进行纯化和浓缩,从而更精确地控制PolyhHb分子的尺寸㊁形貌及其分散性,保留其携氧能力㊁氧亲和力和氧卸载特性㊂戊二醛多聚血红蛋白可根据应用要求调节聚合物分子量大小,从而调节材料的氧亲和力,聚合产物分子933All Rights Reserved.中国材料进展第41卷图3㊀T 态和R 态聚合牛血红蛋白合成示意图[5]Fig.3㊀Synthesis schematic of T-and R-state PolybHb[5]量越高,氧亲和力越强;但其缺点是导致血红蛋白自氧化性能增加[7],使部分血红蛋白失去携氧能力㊂2.3㊀有机基团共轭血红蛋白早在1983年,Iwashita 等[8]通过酰胺键将血红蛋白分别与聚乙二醇㊁聚丙二醇以及环氧乙烷和环氧丙烷等聚合物共价偶联,研制出一类含血红蛋白或血红蛋白衍生物的有机聚合物载氧材料㊂1986年,Iwasaki 等[9]则公开发布了其血红蛋白的化学修饰结构,通过聚环氧乙烷的端基和血红蛋白的氨基之间的键结合,形成 CH 2 O CH 2 CONH Hb 的结构㊂Christoforidis 等[10]研制了牛源聚乙二醇化碳氧血红蛋白为基础的氧载体,用以向缺氧组织释放氧㊂该氧载体可在软脑膜小动脉血管舒张㊁抗肿瘤和抗炎等方面发挥作用,并可向严重缺氧组织输送氧气,在减缓急性脑卒中缺血性损伤方面显示出良好的应用前景㊂2.4㊀血红蛋白与其他材料结合Prapan 等[11]通过2次㊁3次沉淀法对人血清白蛋白㊁透明质酸和丙氨酸进行了表面吸附研究,结果表明,不同表面修饰的血红蛋白亚微米颗粒不仅会影响氧的结合能力,还会影响对抗血红蛋白抗体㊁免疫球蛋白和触珠蛋白的结合㊂Xia 等[12]将金纳米粒子血红蛋白复合物纳米粒子负载于血小板上(Au-Hb@PLT),如图4所示,这些Au-Hb@PLT 体积小,能使金纳米粒子血红蛋白复合物深入肿瘤组织,作为放射增敏剂来增强肿瘤细胞对X 射线的敏感性,同时血红蛋白作为氧载体来缓解缺氧,从而增强低剂量放疗的治疗效果㊂将血红蛋白联合各类材料,在应用层面除可以更精确地调节释氧量外,也可进行病灶靶向联合其它疗法进行治疗,使血红蛋白载体材料功能更丰富,更有针对性㊂图4㊀Au-Hb@PLT 材料合成示意图[12]Fig.4㊀Synthesis schematic of Au-Hb@PLT [12]3㊀血红蛋白的微囊封装技术为进一步提高血红蛋白氧载体的携氧能力并增加载体功能,研究者运用多种材料制备膜壳结构,封装血红蛋白,形成尺度为微纳级别的囊泡,构成更加稳定和多元的氧运载系统㊂微囊封装的方式不仅增加了血红蛋白包封率,更使血红蛋白内核的功能得以完善保留㊂与此同时,不同膜壳材料本身的分子特性丰富了微囊载体的功能,并且可以提升其生物相容性,以适应更为复杂的生物环境,使血红蛋白氧载体拥有更广泛的应用前景㊂43All Rights Reserved.㊀第5期李㊀菂等:血红蛋白氧载体的研究与应用进展3.1㊀脂质体包载血红蛋白Arifin等[13]研究了脂质体包裹的四聚血红蛋白分散体,其通过挤压的方式制备而成,膜壳使用物质的量的比为10ʒ9ʒ1的二嘧磺酰磷脂酰胆碱㊁胆固醇和二嘧磺酰磷脂酰甘油的脂质混合物,具有较高的血红蛋白包封效率㊁较低的高铁血红蛋白水平,以及较好的氧结合特性㊂Awasthi等[14]则使用聚乙二醇二硬脂酰磷酸酯酰乙醇胺作为脂质体包封膜壳,以中性或负电荷的血红蛋白为载体㊂聚乙二醇降低了网状内皮系统对血红蛋白载体材料的截留,从而降低其肝脏摄取率,而增加了脾脏摄取率㊂聚乙二醇化的材料设计不仅提高了囊泡内血红蛋白的含量,同时改善了血红蛋白载体在循环系统内的传输作用,为后续应用提供了更多可能㊂Li等[15]则继续引入肌动蛋白基质,制备了脂质体包裹的肌动蛋白-血红蛋白的分散体㊂相比单纯的聚乙二醇化血红蛋白的循环特性,增加肌动蛋白基质将进一步延长氧载体的循环半衰期,从而拓展了脂质体包裹血红蛋白氧载体的应用前景㊂同时,脂质体由于磷脂分子的双亲性特质,赋予了材料更加多元化的载药方向,也根据粒径和包载形式的不同而具有不同的体内分布特性,并且具有更高的生物相容性㊂3.2㊀聚合物囊泡包载血红蛋白Arifin等[16]将牛血红蛋白包封在聚丁二烯-聚乙二醇(PBD-PEO)聚合物囊泡中,构成两亲性多聚体包裹血红蛋白的分散体㊂与传统脂质体相比,该聚合物囊泡具有更长的PEG链和更厚的疏水膜,其血红蛋白载量也高于脂质凝胶包裹的血红蛋白颗粒和纳米水凝胶包裹的血红蛋白颗粒㊂囊泡平均半径大于50nm,氧亲和力与人红细胞相当,可以发展成为一种有效的氧疗法㊂Rameez 等[17]开发了由聚环氧乙烷(PEO)㊁聚己内酯(PCL)和聚丙交酯(PLA)组成的两亲性二嵌段共聚物自组装包裹血红蛋白的材料㊂在两亲性二嵌段共聚物中,PEO作为亲水性嵌段,而PCL或PLA则可作为疏水性嵌段;其中PCL和PLA可生物降解,而PEO㊁PCL和PLA均是生物相容性聚合物㊂因此该材料具有可生物降解和生物相容性,血红蛋白负载能力较好㊂聚合物囊泡包裹的血红蛋白氧载体携氧性能良好,且在体内的循环时间延长,作为治疗性氧载体具有良好前景㊂4㊀血红蛋白氧载体的治疗应用血红蛋白氧载体的应用范围非常广泛,如作为细胞培养添加剂,可提升细胞增殖率㊁增强细胞活力等[18]㊂而在临床上,许多疾病是由缺氧引起的,由适合的氧载体递送氧气常常可以直接减轻症状㊂虽然输血技术在今天已经逐步趋于安全和完善,但相比于输血,运用人工氧载体进行输氧具有不可替代的优势,例如氧载体与所有血型的相容性㊁避免交叉配血㊁可用性高㊁感染风险低等,并且能够满足长期储存的需要㊂以血红蛋白为基的氧载体正在作为一种 氧桥 ,取代或补充标准输血在危及生命的极端状况下的需要,例如在偏远地区㊁条件恶劣的战场或患者由于宗教反对拒绝血液用品等㊂除此之外,很多伴随症状出现的乏氧情况,也可以通过人工氧载体补充氧气得以治疗㊂而使用人工氧载体联合化疗或光动力疗法等,更加速了治疗的进程,具有非常可观的应用前景㊂4.1㊀红细胞替代品血红蛋白氧载体作为红细胞替代品的研发,40多年来已历经3代,其修饰手段从化学修饰逐渐演变为封装在合成膜中[19]㊂Jansman等[20]制备了聚丙交酯-乙交酯核(PLGA),随后用血红蛋白和纳米酶修饰㊂血红蛋白被聚多巴胺包被,以保持蛋白质的结构和功能,如图5所示㊂Romito等[21]使用聚乙二醇偶联牛源碳氧血红蛋白,在血液稀释过程中可增加组织氧输送并减少失血,适合等容血液稀释,可在心脏手术的体外循环中更好地保存血液㊂Rubinstein等[22]将牛血红蛋白氧载体HBOC-201运用于纯图5㊀不同功能组分吸附至聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)核合成示意图[20]Fig.5㊀Synthesis of different functional components adsorbed to PLGA core[20]143All Rights Reserved.中国材料进展第41卷红细胞再生障碍性贫血(PRCA)的治疗中㊂PRCA患者网织红细胞绝对值减少,骨髓中红细胞前体细胞缺失或严重减少㊂在接受HBOC-201治疗后,患者出现了红细胞计数恢复的迹象,加予免疫抑制治疗,最终改善红细胞生成㊂4.2㊀心脑缺氧程度缓解Ito等[23]将血红蛋白载氧与局部冷灌注疗法结合起来,对脑缺血再灌注损伤等产生更强的神经保护作用㊂他们在大鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型中,采用一种核壳结构的血红蛋白-白蛋白簇与局部灌注进行联合治疗,灌注7d后对神经功能缺损和梗死体积减少的疗效显著,脑血流减少㊁脑水肿和蛋白质外渗也有明显改善,是一种对严重缺血性中风很有前景的神经保护策略㊂Gekka 等[24]发现了血红蛋白-白蛋白簇构成的氧载体显著抑制缺氧及复氧处理细胞中活性氧的产生,具有良好的微血管灌注和氧输送能力及可能的抗氧化作用,同样对短暂性脑缺血具有神经保护作用㊂4.3㊀恶性肿瘤治疗4.3.1㊀改善恶性肿瘤乏氧微环境Jiang等[25]开发了一种由血红蛋白联合化疗药物卡巴唑构成的脂质体人工氧载体系统,能够有效地向肿瘤输送氧气,并抑制肿瘤生长与转移㊂该载体不仅能减轻肿瘤缺氧的程度,缓解肿瘤乏氧微环境,有效地将癌细胞滞留在肿瘤部位,而且能下调低氧诱导因子(HIF)的表达,有利于降低肿瘤的恶性程度㊂同时将血红蛋白氧载体注入体循环,也可以通过缓解实体瘤缺氧情况的方式提高化疗药物的疗效㊂Belcher等[26]设计了计算模型来模拟人体肿瘤结构,进行了聚合人血红蛋白增强肿瘤氧合的模拟,以确定氧载体在肿瘤中的异质性血管结构下的潜在有效性㊂Belcher等[27]也研究对比了结合氧气(松弛态,R态)和未结合氧气(紧张态,T态)的聚合人血红蛋白调节低氧(FME)和常氧(LOX)人黑色素瘤异种移植物中的氧输送情况㊂通过对FME和LOX肿瘤异种移植物的生长率㊁血管和局部血流的观察,输注低氧亲和力的T态血红蛋白载体材料,从而使缺氧肿瘤组织氧合增加,血流量减少,血管生成减少,肿瘤生长减少㊂然而,输注T态和R态的血红蛋白载体材料在常氧性肿瘤中则并无改善㊂因此,肿瘤本身的氧气状态是输注血红蛋白氧载体材料的效用和结果的主要决定因素㊂因此,面对肿瘤治疗,血红蛋白氧载体类材料的研究更需要聚焦于乏氧微环境的靶向与调控,精准释氧,以发挥最大效益㊂4.3.2㊀光动力疗法联合治疗光动力疗法因其无创性㊁副作用小等优点,已成为一种具有前瞻性与热度的肿瘤治疗方法㊂然而,肿瘤部位由于癌细胞的增殖而缺氧的内环境,严重阻碍了光动力疗法的治疗效果㊂因此,及时补充氧气,提高活性氧的生成,可以有效辅助肿瘤的光动力治疗㊂其中,依赖肿瘤内源性过氧化氢分解的原位制氧,并结合血红蛋白或全氟化碳高载氧量的氧传递方式,成为光动力疗法联合治疗的良好选择㊂原位制氧技术对肿瘤具有很高的特异性,但其制氧效率受到肿瘤内过氧化氢水平的限制㊂与此相反,输氧法虽然缺乏肿瘤特异性,但具有载氧效率高的优点㊂将血红蛋白作为氧载体运载于脉管系统中,可以更高效和更具普适性地提升光动力疗法的有效性㊂Zheng等[28]采用共沉淀法将血红蛋白掺杂到碳酸钙中,再将碳酸钙交联去除,得到血红蛋白微粒,以吲哚菁绿(ICG)溶液孵育得到血红蛋白/ICG颗粒(HbIPs),并保持了载氧能力,比游离的ICG产生更多的活性氧,杀死比游离ICG多22%的癌细胞,很好地起到了补充光动力治疗效果的作用㊂Luo等[29]通过二硫键重组将血红蛋白和白蛋白进行杂交,同时包埋阿霉素,制备了肿瘤靶向性杂交蛋白氧载体,作为纳米药物用于精确的肿瘤氧合,同时联合化疗和光动力治疗,提供更佳疗效,如图6所示㊂4.4㊀缺血性休克与复苏失血过多是导致创伤或失血性休克患者死亡的主要原因,而目前用于急救的院前复苏液提供的作用仅是纠正低血容量,保障有效的血输出量和器官的血流灌注㊂图6㊀肿瘤靶向性杂交蛋白氧载体合成示意图[29]Fig.6㊀Synthesis schematic of Tumor targeted hybrid protein oxygen carrier[29]243All Rights Reserved.㊀第5期李㊀菂等:血红蛋白氧载体的研究与应用进展若材料可增加携氧能力,则可减轻失血性休克时的微血管缺血和组织缺氧,对血液功能也是一种有效补充㊂William等[30]验证了聚乙二醇化碳氧基团修饰的血红蛋白的氧载体(PEG-COHb)对失血性休克大鼠全身及微循环的影响,证明PEG-COHb能有效改善心血管参数,降低乳酸含量,延长机体存活时间㊂同时复苏后未检测到高血压,进一步支持了该载体材料对失血性休克症状缓解的效果㊂Philbin等[31]评价了HBOC-201对猪的合并软组织损伤导致失血性休克的复苏效果,该氧载体组别平均动脉压㊁平均肺动脉压和全身血管阻力指数较高,心脏指数㊁血流动力学和组织氧合恢复快,并减少了液体量需求,是一种效果较好的复苏液体㊂4.5㊀骨骼肌氧合Horn等[32]研究发现无基质牛血红蛋白溶液对骨骼肌组织氧合具有影响,该氧载体的治疗有助于升高平均动脉压和平均肺动脉压并提高吸氧率,在严重动脉狭窄期间,增加氧摄取,改善骨骼肌组织氧合㊂Kawaguchi等[33]研究了高氧亲和力的脂质体包裹血红蛋白对骨骼肌人工输送氧气的作用㊂他们设计了大鼠快型跖肌(PLT)和慢型比目鱼肌(SOL)原位抗疲劳试验,原位分离PLT和SOL的远端肌腱并分别连接到力传感器上,记录对同侧坐骨神经刺激产生的张力㊂结果表明,该氧载体额外的氧气供应可能会加速含有丰富线粒体的慢型有氧溶胶肌肉中的三羧酸循环与电子传递链,并有助于更快地去除如乳酸等的肌肉疲劳物质㊂4.6㊀器官及肢体灌注Bodewes等[34]提出使用血红蛋白氧载体进行供体肝脏的离体机器灌注,以起到维持器官活力和细胞功能的关键作用㊂在心肌梗塞治疗中,心肌缺血缺氧,可利用血红蛋白氧载体保持毛细血管充分开放,使心肌得到有效灌注,使平均动脉压升高,更大程度地加快氧的运输[35]㊂George等[36]检测并证明了血红蛋白氧载体HBOC-201具有在急性㊁严重心肌缺血再灌注时减少梗死面积并提高心肌存活率的功效㊂Mahboub等[37]研究了肾脏逐渐复温过程中以血红蛋白氧载体代替简单扩散碳流充氧的效果㊂该研究模拟了循环死亡肾移植后的供体,结果表明,在循环死亡的肾脏经历从10到37ħ的逐渐复温过程中,与无氧复温相比,使用血红蛋白氧载体的组别呈现了良好的肾功能,超滤率增加,肾小球滤过率提高,钠重吸收也有所改善㊂Aburawi等[38]则证明了合成血红蛋白氧载体在人体肾脏常温灌注中使用的可行性㊂Meur 等[39]研究了细胞外血红蛋白M101作为器官保存液添加剂对缺血及再灌注损伤的优势,同时证实了M101的安全性㊂相比标准冷藏保存,离体常温肢体灌注(EVNLP)方式保存下的肢体存活能力更好;而与无细胞灌注液相比,含有填充红细胞的灌注液则可改善预后㊂但该灌注方式也具有局限性,包括可用性有限㊁交叉配血的需要㊁机械性溶血和促炎蛋白的激活等㊂Said等[40]对使用聚合牛血红蛋白的氧载体HBOC-201制备EVNLP材料的可行性进行了研究,HBOC-201具有免疫原性低㊁无溶血反应危险㊁增强对流以及扩散氧传递等优点㊂通过猪前肢灌注,对结晶和破坏特征进行观察,发现线粒体超微结构得到了更好的保存,肌肉收缩力也得到更好的保留㊂5㊀结㊀语近年来,研究者通过偶联㊁交联㊁吸附等各种方式进行化学修饰,以及利用脂质体㊁聚合物等各种材料进行微囊包埋,不断研发和更新血红蛋白氧载体,其应用多处于临床研发阶段,包含贫血㊁脑损伤㊁恶性肿瘤㊁缺血性休克㊁骨骼肌疲劳以及器官肢体灌注等方面,使传输和供给氧气更加便捷和高效㊂血红蛋白氧载体由于不存在完整的细胞结构,其释氧速率快于天然红细胞,需要进行表面修饰优化以达到缓释的目的㊂未来血红蛋白作为氧载体的研究可能会更加聚焦于开发更合适的包埋和修饰材料,使其理化性质更加稳定,更加适应瞬息万变的机体环境;连接靶向物质,实现面对病灶的定向特异性供氧,使治疗范围更精准;联合一氧化氮等材料,逆转治疗中的肺动脉高压等情况,减轻血红蛋白氧载体的不良反应,进一步提升治疗的安全性㊂参考文献㊀References[1]㊀DOYLE M P,APOSTOL I,KERWIN B,et al.Journal of BiologicalChemistry[J],1999,274(4):2583-2591.[2]㊀RIESS J G.Chemical Review[J],2001,101(9):2797-2920.[3]㊀HICHEY R,PALMER A ngmuir[J],2020,36(47):14166-14172.[4]㊀KLOYPAN C,SUWANNASOM N,CHAIWAREE S,et al.ArtificialCells,Nanomedicine and Biotechnology[J],2019,47(1):241-249.[5]㊀GU X 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Hepcidin研究进展张丽;张连峰【摘要】Hepcidin是肝脏特异性表达的一种小分子抗菌肽,是铁代谢的负调节激素.与炎症性贫血、遗传性血色沉着病等疾病的发病机制密切相关.证据显示,Hepcidin直接抑制肠上皮细胞铁吸收和诱导单核巨噬细胞铁滞留.同时,Hepcidin还具有广谱抗菌活性,与固有免疫密切相关.铁超载、感染、炎症及细胞因子可诱导Hepcidin表达,而贫血和缺氧则抑制其表达.Hepeidin的发现及其相关的铁离子运输机制的研究,将为铁离子吸收及分配的铁稳态调节和炎症性贫血、遗传性血色沉着病中的铁代谢障碍的分子机制探索开辟新的途径.本文就Hepcidin 的分子特征、表达调控及生物学功能等方面研究进展进行综述.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2010(020)001【总页数】5页(P52-56)【关键词】铁代谢;固有免疫;激素;调控;心脏【作者】张丽;张连峰【作者单位】中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京100021;中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京100021【正文语种】中文【中图分类】R-33Hepcidin是 2000年发现的由肝脏特异表达的小分子防御性抗菌肽,但后来的研究表明其不仅具有广谱抗菌活性,而且还参与调节铁吸收,目前被认为是维持铁稳态极其重要的负调节激素[1]。

实验表明,Hepcidin具有抑制小肠对铁的吸收和可能促进铁在网状内皮系统中滞留等作用,介导血色素沉着病、慢性病贫血等多种铁代谢紊乱性疾病,但其作用机制仍停留于假说阶段,迄今为止也还未找到Hepcidin的受体。

因此,Hepcidin功能与作用机制的研究已成为当前铁代谢及相关疾病研究领域中的热点问题之一。

本文就 Hepcidin的分子生物学功能、作用机制及最新的研究进展进行综述。

临床医学检验临床免疫技术：临床免疫技术考试题库三1、单选可作为定量测定的免疫电泳技术是（）A.对流免疫电泳B.火箭电泳C.交叉免疫电泳D.免疫电泳E.免疫固定电泳正确答案：B2、多选溶血能使血清中（江南博哥）何种物质测定值明显增高（）A.KB.ASTC.ALTD.LDHE.Glu正确答案：A, B, C, D3、单选ROC确定的临界值，它反映了（）A.最佳的敏感度B.最佳的特异度C.最佳阳性预测值D.最佳阴性预测值E.敏感度与特异度处于最满意状态正确答案：C4、单选两个临床应用目的相同的试验，评价它的临床应用价值大小的可靠方法是（）A.敏感度B.特异度C.预测值D.ROC曲线下覆盖的面积E.临界值确定是否合理正确答案：D5、单选粗提血清γ－球蛋白的简便方法是（）A.超速离心法B.硫酸铵盐析法C.亲和层析法D.离子交换层析法E.超声破碎法正确答案：B6、单选制备人工抗原时，最常用于耦联半抗原的载体是（）A.人血清白蛋白B.牛血清白蛋白C.血蓝蛋白D.牛甲状腺球蛋白E.人甲状腺球蛋白正确答案：B参考解析：牛血清白蛋白溶解度大，免疫活性强，且易获得，是最为常用的载体。

考点：载体的选择。

7、单选利用聚乙二醇沉淀法检测CIC时，聚乙二醇分子量为（）A.1000B.1500C.4000D.6000E.20000正确答案：D8、单选肺结核患者，检出血清中有特异性抗体，表明（）A.检出结果错误，因为结核只有细胞免疫B.该患者处于活动期C.病人已恢复D.应动态观察特异性抗体水平的变化，估计疾病的转归E.病人有免疫力正确答案：D9、单选Ⅳ型超敏反应中起关键作用的效应细胞是（）A.效应性T细胞B.肥大细胞C.NK细胞D.B细胞E.中性粒细胞正确答案：A10、单选所有B淋巴细胞具有的分化抗原是（）A.CD34B.CD10C.CD38D.CD19E.CD34正确答案：D11、单选患者女性，35岁。

黄疸、贫血伴关节酸痛3个月，体检：巩膜黄染，脾肋下2cm，血红蛋白58g／L，白细胞5×10／L，血小板120×109／L，网织红细胞25％，外周血涂片成熟红细胞形态正常，尿隐血试验（－）。

（２）ＴＮＢＳ法测定要素（时间）的确定①取不同量的牛血红蛋白样品加入试管；②向各试管中加入３０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＴＮＢＳ溶液４０皿，加硼酸缓冲液至５ｍＬ，并充分混合均匀；③在３２℃温水浴中反应２小时，并用５０皿甲酸（８８％）终止反应。

④测量溶液在４２０ｎｌｎ下的吸光度⑤根据所得数据，得到不同的曲线。

（３）ＴＮＢＳ测定ＳＣ－ｍＰＥＧ对牛血红蛋白的修饰程度参考文献方法完成修饰产物的偶联度检测。

量取不同含量的样品（４ＩｔＬ～３２ｒｔＬ），加入５０止．的３０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＴＮＢＳ溶液，加硼酸缓冲液至总体积为５ｍＬ，３２℃水浴，暗处放置反应２小时，以甲酸（８８％）终止反应。

用未加样品的反应液作为空白，测定样品的Ａ４２０，将测定结果线性回归后，得血红蛋白和ＰＥＧ－ｂＨｂ的直线的斜率分别为Ｋｂｍ和Ｋ懈－ｂｈｂ，平均修饰率＝１一Ｋｐ蟹ｂｈｂ依ｂ｜Ｉｂ。

３．３结果与讨论３．３．１不同条件下的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ图（１）ＳＣ．ｍＰＥＧ与ｂＨｂ不同配比反应产物的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ图图中Ｍ—ＳＤＳ．－ＰＡＧＥＭａｒｋｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，分子量为１１６ｋ，６６ｋ，４５ｋ，３５ｋ。

２５ｋ，１８．４ｋ和１４．４ｋ），ｂＨｂ为空白对照图３．２不同的ＰＥＧ—ｂＨｂ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图随反应物中ＳＣ．ｍＰＥＧ与血红蛋白比例从２０：１增加到１００：１，未反应的血红蛋白明显降低到，而高分子量修饰产物所占比例明显增加。

从图中可以看出６０：１有很明显的高分子修饰物，未反应的血红蛋白明显减少，结合节省原料的因素，选取６０：１为最佳配比。

（２）不同反应温度的ＰＥＧ－ｂＨｂ时ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图中Ｍ—ＳＤＳ－ＰＡＧＥＭａｒｋｅｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，分子量为１１６ｋ，６６ｋ，４５ｋ，３５ｋ，２５ｋ，１８．４ｋ和１４．４ｋ），ｂＨｂ为空白对照图３．３４℃下不同配比反应ＰＥＧ．ｂＨｂ的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ图从图３．３中可以看出，室温时与４℃的反应产物没有明显区别，温度对反应的影响不如配比大，但由于血红蛋白是生物制剂，以后又要制备成注射剂使用，为了最大程度的降低高铁血红蛋白的产生，降低染菌的几率，以后所以的反应在４℃下冷室内进行。

聚乙二醇化蛋白质类药物的结构分析方法摘要近年来,聚乙二醇修饰技术已经成为改良蛋白药物最有效的技术之一,得到越来越广泛的应用。

鉴于聚乙二醇本身的特性与蛋白质结构的复杂性，如何使它更好的修饰蛋白并对修饰后产物进行分析鉴定是研究的重点与难点。

本文主要就PEG定点修饰的技术和PEG化蛋白的成分、结构分析方法及各种方法的优缺点作一介绍，并展望了未来的发展趋势。

Abstract Polyethylene Glycol(PEG) modification technology has become one of the most effective technologies in protein drugs ,getting more and more widely used in recent years. In view of the characteristics of polyethylene glycol itself and the multiple structure of proteins,it’s necessary and difficult to achieve better modification and analyse the Modified products. In this paper,we fixed on the PEG-modified-protein technology and components, structural analysis methods and the advantages and disadvantages of various methods to make a presentation and prospect the future trend of development.关键词：蛋白类药物，聚乙二醇化，修饰位点，结构分析方法Key words:Protein drugs, Peginterferon, modification sites, structure analysis methods.正文药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化,是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上。