蛋白相互作用Pull-Down实验

➢ 2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220rpm， 30℃培养至OD600=0.4-0.6;
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备

百泰派克生物科技
GST pull-down实验
GST pull-down实验原理
Pull-down（拉下实验）是一种体外亲和纯化蛋白的技术，Pull-down技术利用被亲和试剂标签（如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸六肽、生物素）标记的已知的蛋白特异性识别混合体系中的配体蛋白，以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白质的目的，是体外研究蛋白与蛋白相互作用的有力工具。

当诱饵蛋白被谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记时进行的Pull-down实验，称为GST pull-down实验，也称GST pull-down融合蛋白沉降技术。

GST pull-down可用于证实已知的蛋白或肽的相互作用，也可以用来发掘未知的蛋白或肽的相互作用。

GST pull-down实验应用
了解蛋白质间的相互作用可进一步探究某项生理活动的分子机制，GST pull-down 技术在研究不同生物体内蛋白相互作用方面得到了广泛的应用。

GST pull-down技术联合高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)可对相互作用蛋白进行定性定量分析，研究蛋白互作网络及由此介导的信号通路和调节机制。

百泰派克生物科技提供基于质谱的GST pull-down蛋白互作分析一站式服务，后续基于液质联用技术（LC-MS/MS）对IP、Co-IP样品及GST融合蛋白Pull-down等纯化样本中的蛋白/蛋白混合物的质谱鉴定。

欢迎免费咨询152-****7680。

.；.Pull Down实验流程1. 混合两种预测相互作用的蛋白。

（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。

如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。

）2. 加入1 mL Binding Buffer。

Binding Buffer：50 mM Tris.HCl （pH7.50.）100 mM NaCl0.25% Triton-X 10035 mM β-Me（巯基乙醇）3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h。

4. 加入20-30 μL GST-Bind TM Resin结合2-4 h。

5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。

第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。

6. 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。

7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。

8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的Loading Buffer，95℃金属浴5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。

电泳样品顺序：Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。

用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下：（input，蛋白量为后两者的1/10）Marker，Protein-B-HIS ，GST+ Protein-B-HIS，Protein-A-GST+ Protein-B-HISMarker，Protein-A-GST ，HIS+ Protein-A-GST，Protein-B-HIS+ Protein-B-GST9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。

深入解析pull down实验：从技术原理到生物学意义蛋白质在细胞内发挥着关键的生物学功能，它们之间的相互作用是细胞内信号传递和调控的基础。

为了揭示蛋白质互作网络，科学家们发展了许多实验技术，其中pull down实验是一种被广泛应用的方法。

本文将从技术原理和生物学意义两个方面，深入解析pull down实验。

1.技术原理：Pull down实验基于亲和层析原理，利用蛋白质之间的特异性相互作用，通过诱捕靶蛋白及其相互作用伙伴，进而对其进行分离和鉴定。

该实验通常包括以下步骤：1.1选择适当的亲和剂：亲和剂是一种具有高亲和力的分子，用于捕获目标蛋白及其互作伙伴。

常见的亲和剂包括抗体、蛋白结构域和配体。

1.2亲和剂的固定：将选择的亲和剂固定在固相支持物上，如琼脂糖糖珠或磁珠。

固定亲和剂的选择应考虑其特异性、亲和力和稳定性。

1.3样品处理：将细胞提取物或组织溶液与亲和剂固相进行孵育，以使目标蛋白及其互作伙伴与亲和剂结合。

1.4洗脱和分析：通过洗脱步骤去除非特异性结合的蛋白质，并将目标蛋白及其互作伙伴从亲和剂上洗脱。

洗脱后的样品可以进行质谱分析、免疫印迹等方法进一步鉴定和定量。

2.生物学意义：Pull down实验在生物学研究中具有重要的意义。

通过该实验，我们可以获得以下信息：2.1互作伙伴的识别：通过pull down实验，我们可以鉴定特定蛋白质的互作伙伴，揭示蛋白质相互作用网络，有助于理解细胞信号传递和调控的机制。

2.2功能分析：通过确定互作伙伴，我们可以推断目标蛋白的功能和调控途径。

例如，某个蛋白质的互作伙伴可能是其底物、调控因子或抑制剂。

2.3蛋白质复合物的研究：pull down实验可用于研究蛋白质复合物的组成和结构。

通过确定复合物成员及其相互作用方式，我们可以深入了解复杂的蛋白质互作网络。

Pull down实验是一项强大的实验技术，用于揭示蛋白质之间的相互作用和功能。

通过该实验，我们可以更好地理解生物体内的分子相互作用机制，并为药物研发和疾病治疗提供重要的基础。

Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性

百泰派克生物科技
GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋
白互作分析
GST融合蛋白Pull-down技术也称GST pull-down或GST pull-down融合蛋白沉降
技术，是在GST融合蛋白以及Pull Down技术的基础上发展起来的研究体外蛋白质与蛋白质相互作用的技术，实质上是一种利用谷胱甘肽S-转移酶（GST）作为亲和
标签进行的Pull-down实验。

该技术利用基因重组技术得到GST标记的融合蛋白，再利用GST对谷胱甘肽（GSH）偶联磁珠的亲和性将带GST标记的融合蛋白与谷胱甘肽偶联磁珠结合，当与融合蛋白有相互作用的靶蛋白通过载有该磁珠的层析柱或与该磁珠混合时，靶蛋白就会与融合蛋白产生吸附而从蛋白混合液中分离出来，通过纯化洗脱就可以得到与融合蛋白相互作用的靶蛋白。

被GST拉下的靶蛋白利用质谱技术进行进一步分析，即GST pull-down结合质谱分析技术，可以实现靶蛋白的定性鉴定和确认，该蛋白可以是已知的也可以是未知的，因此，可以用于验证两种已知蛋白之间可能存在的相互作用以及寻找能与已知的融合蛋白发生相互作用的未知蛋白分子。

百泰派克生物科技基于先进MALDI-TOF质谱系统与LC-MS/MS质谱系统提供专业准
确的GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋白互作分析服务技术包裹研究体外强烈或者稳定的蛋白质间相互作用，鉴定两种已知的感兴趣蛋白质可能存在的直接相互作用，寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白，还可用于表征蛋白相互作用的条件，欢迎免费咨询。

进阶实验：探索蛋白Pull Down在蛋白组学研究中的应用蛋白质是生命体中最基本的分子，它们在细胞中扮演着重要的角色。

蛋白质的功能和相互作用是生命体系中许多生物学过程的基础。

因此，研究蛋白质的相互作用对于理解生物学过程和疾病的发生机制至关重要。

在这方面，蛋白Pull Down实验是一种常用的技术，它可以用于研究蛋白质之间的相互作用。

本文将介绍蛋白Pull Down实验的原理、步骤和在蛋白组学研究中的应用。

图1。

一、蛋白Pull Down实验的原理蛋白Pull Down实验是一种用于研究蛋白质之间相互作用的技术。

该技术基于亲和层析的原理，利用亲和剂将目标蛋白质结合到固相材料上，然后用该材料从混合物中富集与目标蛋白质相互作用的蛋白质。

最终，富集的蛋白质可以通过质谱分析等方法进行鉴定和定量。

蛋白Pull Down实验可以用于研究多种蛋白质之间的相互作用，包括蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA等。

该技术的优点在于它可以在原位研究蛋白质之间的相互作用，而不需要对蛋白质进行任何修饰或标记。

二、蛋白Pull Down实验的步骤蛋白Pull Down实验通常包括以下步骤：1.制备亲和剂：选择适当的亲和剂，将其结合到固相材料上。

常用的亲和剂包括抗体、蛋白质结合域和核酸结合域等。

2.样品制备：将样品加入到亲和剂结合的固相材料中，使其与亲和剂结合。

3.洗涤：用缓冲液洗涤固相材料，去除非特异性结合的蛋白质。

4.富集：用洗涤缓冲液洗涤固相材料，去除非特异性结合的蛋白质。

5.分析：将富集的蛋白质进行鉴定和定量，常用的方法包括质谱分析、Western blotting等。

三、蛋白Pull Down实验在蛋白组学研究中的应用蛋白组学是研究蛋白质组成、结构和功能的一门学科。

蛋白Pull Down实验是蛋白组学研究中常用的技术之一。

它可以用于研究蛋白质之间的相互作用，从而揭示蛋白质网络的结构和功能。

在蛋白组学研究中，蛋白Pull Down实验可以用于以下方面的应用：1.蛋白质相互作用网络的构建：蛋白Pull Down实验可以帮助研究人员鉴定蛋白质之间的相互作用关系，从而构建蛋白质相互作用网络。

pulldown实验原理Pulldown实验是一种常用的分子生物学实验技术，用于研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用。

该实验原理基于核酸的亲和性纯化技术。

在Pulldown实验中，我们需要准备两种重要的试剂：目的蛋白和亲和填料。

目的蛋白是我们想要研究的蛋白质，而亲和填料则是用于显示目的蛋白与核酸相互作用的亲和性表位。

通常，亲和填料有两种类型：固定填料和亲和标记填料。

固定填料是通过共价键结合到固定材料上，如琼脂糖珠。

而亲和标记填料则是具有荧光或放射性同位素等标记，以便于后续的蛋白质分析。

Pulldown实验的步骤如下：1.准备目的蛋白：我们首先需要克隆目的蛋白的基因，并将其表达在适当的表达系统中，如大肠杆菌。

通过分析蛋白质序列，我们可以知道目的蛋白背后的结构和功能。

2.准备亲和填料：根据目的蛋白的特性，选择适当的亲和填料。

例如，如果目的蛋白是DNA结合蛋白，我们可以使用DNA纯化填料，如聚腺酸。

如果目的蛋白是RNA结合蛋白，我们可以使用RNA纯化填料。

3.将目的蛋白和亲和填料结合：将目的蛋白与亲和填料一起孵育，以使它们发生特异性的相互作用。

这可以通过混合目的蛋白和亲和填料，在适当的缓冲液中进行几个小时的孵育来完成。

4.固定亲和复合物：使用试剂将亲和复合物固定在固定剂上，如琼脂糖珠。

这可以通过将珠子加入到反应中，然后对混合物进行旋转和洗涤来完成。

5.洗涤亲和复合物：通过多次洗涤琼脂糖珠，去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。

这可以通过多次旋转珠子和加入适当的洗涤缓冲液来完成。

6. 蛋白质分析：现在我们已经得到了特异性的目的蛋白-亲和填料复合物。

我们可以通过热变性、SDS-、Western blotting等方法对复合物进行分析和检测。

这些分析方法可以帮助我们确定目的蛋白质与DNA或RNA的相互作用。

通过Pulldown实验，我们可以研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用，从而深入了解生物分子的功能和结构。

蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。

是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。

Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。

用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。

这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。

最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。

其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。

实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、200mM NaCl、1mM EDTA（pH8.0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。

（蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7ug/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF））实验方法：方法一：1、预清除细胞裂解液：将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4℃混合孵育2h。

离心机12,000g在4℃离心2min。

将上清转移至新的离心管中。

2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。

在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。

gst-pull down 鉴定蛋白纯化结果
GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。

其鉴定蛋白纯化结果的原理如下：
- 利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合；
- 融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合；
- 将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定时间；
- 洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳。

通过观察电泳结果，可以分析出蛋白间的互作关系，从而鉴定蛋白纯化结果。

1.1.2 (His)-B融合蛋白的纯化
Western Blot
5、加入适量体积Elution Buffer，不必吹打，晃动洗脱蛋白。 3000 rpm/min，4℃离心5min，吸净上清，His-B融合蛋白即在 上清中；
6、如果用于检测，取10微升样品，加入10微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min；
2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220 rpm， 30℃培养至OD600=0.4-0.6;
3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，20℃，200 rpm培养10~16小时）;
4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
体外蛋白的结合?1将结合有gsta融合蛋白的sepharose4b悬浮在适量体积缓冲液中加入悬浮在适量体积缓冲液中加入2030微升含有b蛋白的溶液原核表达或真核表达产物同时采用结合有蛋白的溶液原核表达或真核表达产物同时采用结合有gst蛋白的sepharose作为阴性对照
GST pull-down 实验技术
主讲：段志强
Western Blot
GST pull-down原理 GST pull-down实验流程

蛋白相互作用Ｐulｌ—Ｄｏwn实验实验原理：Pｕlｌ—Down技术就是通过蛋白相互作用来研究细胞通路得有力工具。

就是确定两种或更多蛋白之间相互作用得体外方法。

Pｕll—Dｏwn实验可用来检测已知得蛋白相互作用条件,并且可用来筛选未知得蛋白相互作用。

用作诱饵得蛋白就是重组蛋白，会含有一个用于纯化得亲与标签。

这个融合标签就就是用于Ｐull—Dｏｗn实验得基础.最常见得标签为谷胱甘肽S－转移酶（GＳＴ）与多组氨酸(6×His）。

其分别使用固相化得谷胱甘肽与固相化得金属螯合物亲与配体（如Ｎi2+与Ｃo2＋）。

实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶(镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、实验材料：表达得含标签得纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：ＢindinｇBuffer/Wａｓhing Buffeｒ：４、2mM Na2ＨPO4、2ｍM KH2PＯ4、140mM ＮaＣl、10mM ＫClSDＳloaｄing Ｂｕfｆｅr：50mＭTｒｉs—Ｃl（ｐH6、８）、２％ＳＤS、0、1％溴酚蓝、1０％甘油、１0mM DTT裂解缓冲液:20mM Tris-Cｌ（pH8、０）、200mM NａCl、1mM EＤTA(pH8、0)、0、５％Noniｄｅt P－４0 使用前加入加入蛋白酶抑制剂.(蛋白酶抑制剂:2ug/uｌ抑肽酶（aprｏｔinin）、1ug／ul白胃素(ｌeupeptin）、0、７ug／ml胃酶抑素(ｐeｐｓｔatｉn）、25ug/ml苯甲磺酰氟(ＰMSF））实验方法:方法一：1、预清除细胞裂解液:将细胞裂解液与50ul得５0%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液与25ug ＧSＴ在4℃混合孵育2h。

离心机１2，00０ｇ在4℃离心２min.将上清转移至新得离心管中.2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及5０ｕl谷胱甘肽琼脂糖球珠得微量离心管.在一管中加约10ug得GST蛋白,另一管中加约1０ug得GSＴ融合探针蛋白.两个反应中加入得探针与对照蛋白质得量应该就是等摩尔得.将离心管在4℃翻转混合孵育2h。

百泰派克生物科技
pull down蛋白质谱
Pull Down是一种利用体外亲和纯化方法确定两种或多种蛋白质之间的物理相互作
用的方法，既可用于确认由其他研究技术（例如，共免疫沉淀）预测的蛋白质-蛋
白质相互作用的存在，也可作为鉴定以前未知的蛋白质-蛋白质相互作用的初始筛
选测定法。

理解蛋白质结构和功能的第一步是确定哪些蛋白质相互作用，从而确定相关的细胞生理途径。

Pull Down已经成为通过对感兴趣的蛋白质-蛋白质相互作
用研究细胞途径的宝贵工具。

Pull Down将相互作用的蛋白从蛋白混合物中提取出来，需要进一步借助其他技术
进行定性或定量鉴定，Pull Down蛋白质谱就是利用质谱技术对Pull Down拉下的
蛋白进行后续鉴定，以验证预测的蛋白相互作用或发现新的与目的蛋白相互作用的蛋白质。

质谱技术通过分析待测物裂解离子的质荷比实现物质的鉴定，是蛋白质鉴定的强有力技术，且其灵敏度和分辨率以及准确性都具有明显优势，是Pull Down
后进行靶蛋白鉴定的首选技术。

百泰派克生物科技使用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，利用进口的GST pull-down 试剂盒，提供Pull down靶蛋白质谱鉴定一
站式技术服务。

您只需要将您的需求和样品寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括样品前处理、pull down、质谱分析、质谱原始数据分析，欢迎免费咨询。

pull down 蛋白表达摘要：1.介绍Pull-down 蛋白表达技术2.Pull-down 蛋白表达技术的原理3.Pull-down 蛋白表达技术的操作步骤4.Pull-down 蛋白表达技术的应用领域5.Pull-down 蛋白表达技术的优势与局限性正文：Pull-down 蛋白表达技术是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验技术。

该技术主要通过将一个已知蛋白质（也称为诱饵蛋白）与一个目标蛋白质（也称为捕获蛋白）共表达，然后通过一系列的操作，将目标蛋白质从混合的蛋白质组中分离出来，从而实现对蛋白质之间相互作用的研究。

Pull-down 蛋白表达技术的原理主要是利用蛋白质之间的特异性相互作用，通过共表达诱饵蛋白和捕获蛋白，使得它们在细胞内形成复合物。

然后，通过一系列的操作，如细胞裂解、蛋白提取、免疫沉淀等，将目标蛋白质从混合的蛋白质组中分离出来。

这样，就可以研究蛋白质之间的相互作用，以及它们在生物体内的功能和作用机制。

Pull-down 蛋白表达技术的操作步骤主要包括以下几个方面：首先，需要选择合适的诱饵蛋白和捕获蛋白，并将它们进行共表达。

其次，需要进行细胞裂解和蛋白提取，将蛋白质从细胞中分离出来。

然后，通过免疫沉淀等方法，将目标蛋白质从混合的蛋白质组中分离出来。

最后，对分离出来的目标蛋白质进行鉴定和分析，以研究蛋白质之间的相互作用。

Pull-down 蛋白表达技术广泛应用于蛋白质组学、生物化学、分子生物学等领域，主要用于研究蛋白质之间的相互作用，以及它们在生物体内的功能和作用机制。

通过应用Pull-down 蛋白表达技术，研究人员可以深入了解蛋白质之间的相互作用，为研究蛋白质的功能和作用机制提供重要的实验依据。

尽管Pull-down 蛋白表达技术具有很多优势，例如操作简单、效果明显等，但它也存在一些局限性。

Pull-down assay是一种用于研究蛋白质相互作用的常见实验方法。

它通过利用亲和层析原理，实现对蛋白质间相互作用的检测与分析。

本文将结合最新的研究成果，共享关于pull-down assay结果的相关内容，希望对读者有所帮助。

一、实验设计我们在进行pull-down assay实验时，首先需要选择目标蛋白和其潜在的相互作用蛋白。

在实验设计阶段，我们需要明确每个蛋白的结构特点和功能，以便正确选择亲和层析柱和免疫印迹检测等实验条件。

二、试剂和仪器准备在pull-down assay实验中，常用的试剂包括亲和层析柱、抗体、洗涤缓冲液、蛋白抽提缓冲液等。

我们还需要准备免疫印迹检测所需的试剂和仪器设备，如SDS-PAGE凝胶、蛋白转印膜、蛋白标记物、辅助试剂等。

三、实验操作步骤1. 蛋白抽提和结合我们需要从细胞或组织中提取目标蛋白，并将其与亲和层析柱结合。

在结合过程中，需注意控制蛋白的浓度和结合时间，确保结合效果达到最佳状态。

2. 洗涤和洗脱将样品通过亲和层析柱后，需要进行洗涤步骤以去除非特异性结合的蛋白。

之后，再用洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱下来，为后续的免疫印迹检测做准备。

3. 免疫印迹检测将洗脱后的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转印到膜上。

进行抗体的孵育和显色显影步骤。

最终获得目标蛋白在膜上的免疫荧光信号，用于分析蛋白相互作用的结果。

四、实验结果分析分析pull-down assay的结果时，我们需要关注蛋白的结合度和特异性。

通过浓度比较、Western blot和共沉淀等方法，可以定量和定性地评估蛋白相互作用的强弱和可靠性。

还需对实验条件和操作过程进行控制实验，以排除假阳性或假阴性的可能影响。

五、应用和展望根据pull-down assay的实验结果，我们可以进一步探究蛋白相互作用在细胞信号传导、疾病发生等生物学过程中的作用机制。

结合生物信息学和基因工程技术，可以设计新型蛋白互作实验方法或改良现有的实验流程，为生命科学领域的研究和应用提供更多的可能性。

PullDown实验详细步骤及详细方法实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间互相作用。

用于验证两个蛋白的互相作用，或者挑选与蛋白互相作用的未知蛋白。

实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST〔Glutathione S transferase〕交融，交融蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH〔Glutathione〕亲和结合。

因此，当与交融蛋白有互相作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而别离。

试剂：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF 〔Amersco〕，Cocktaier〔Merck 539134〕，Immobilized Glutathione 〔PIERCE 15160〕实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与GST交融的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS及PBS+1%Triton-100PBS (1L)NaCl： 8gKCl： 0.2gNa2HPO4： 1.44gKH2PO4： 0.24g参加800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L 即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃〔以下流程仅供研究原核蛋白A和真核过表达蛋白B互相作用〕1：原核交融蛋白A的获得1.1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜1.3：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，参加适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间〔诱导条件需要根据不同的蛋白做调整〕，6000g，10分钟，4℃离心搜集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液参加10-20ml细菌裂解液〔PBS+1%Triton-100+PMSF〕，吹打混匀1.5：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。

gstpulldown实验技术汇报人：2023-12-25•实验简介•材料准备•实验操作目录•结果分析•实验结论01实验简介验证已知的蛋白质相互作用gstpulldown实验可以用于验证已知的蛋白质相互作用，例如验证某个蛋白质是否与特定的结合蛋白相互作用。

发现新的蛋白质相互作用通过gstpulldown实验可以发现新的蛋白质相互作用，从而为研究新的生物学过程和疾病机制提供线索。

确定蛋白质之间的相互作用通过gstpulldown实验可以检测到与特定蛋白质结合的其他蛋白质，从而确定蛋白质之间的相互作用。

蛋白质相互作用gstpulldown实验利用GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白作为诱饵，与细胞或组织提取物中的目标蛋白质进行结合，从而检测到与诱饵蛋白结合的目标蛋白。

分离和纯化通过将GST融合蛋白与谷胱甘肽结合的琼脂糖珠结合，可以分离和纯化与目标蛋白结合的复合物。

检测目标蛋白通过Western blot等技术对分离和纯化的复合物进行检测，从而确定与诱饵蛋白结合的目标蛋白。

实验步骤准备GST融合蛋白和谷胱甘肽结合的琼脂糖珠将GST融合蛋白与琼脂糖珠结合，形成用于捕获目标蛋白的诱饵。

细胞或组织提取从感兴趣的细胞或组织中提取蛋白质混合物。

孵育将细胞或组织提取物与GST融合蛋白结合的琼脂糖珠孵育，使目标蛋白与诱饵蛋白结合。

洗脱和检测洗脱与诱饵蛋白结合的目标蛋白，并利用Western blot等技术进行检测和分析。

02材料准备GST琼脂糖珠磷酸化激酶洗涤液抗体01020304用于绑定目的蛋白，是实验的关键试剂。

用于磷酸化目的蛋白，确保实验的准确性。

用于清洗实验中使用的各种仪器和试剂。

用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。

离心机用于分离和纯化目的蛋白。

摇床用于孵育实验中的各种反应。

超声波破碎仪用于破碎细胞，释放细胞内的目的蛋白。

凝胶电泳仪和电泳槽用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。

所需样本细胞或组织样本实验所需的生物样本，需确保其质量和活性。