水产品生物活性肽的研究进展
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水产品生物活性肽的研究进展
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摘 要 水产品种类繁多，所含氨基酸比例与人体氨基酸组成接近。与陆生动植物蛋白来源的生物活性肽相比，水产品生物活性肽具有自身优势，这引起了研究人员的广泛关注，成为近年来食品领域的研究热点。该文概括了水产品生物活性肽的基本概念、研究现状，制备方法及构效关系，并以鱼类、贝类、甲壳类动物为例，综合阐述了水产品抗氧化肽、降血压肽、抗菌肽等生物活性肽的研究进展。最后，对水产品生物活性肽当前发展中的共性问题进行了总结与展望，为水产品生物活性肽进一步开发利用提供参考。
关键词 水产品；生物活性肽；功能活性；制备；研究进展
生物活性肽是以蛋白质为原料，经过水解及分离纯化后得到的具有特殊生物活性的蛋白水解物。生物活性肽相比于蛋白质水解产物氨基酸而言，更容易被人体吸收利用。生物活性肽能够调节机体生命活动，具有一定的药用特性和营养特性，在日益关注健康与饮食的今天，越来越受到人们的重视。但是在亲本蛋白序列中，肽是无活性的，必须释放才能发挥其作用，目前主要通过直接提取法或酶水解法获得。
国内外研究的活性肽主要来源于陆生动植物，如研究最早也是最深入的陆生动物乳、肉、蛋活性肽，以及植物来源的大豆肽、大米活性肽、玉米活性肽[1]。水产品生长环境独特，是结构多样的生物活性肽的丰富来源，近年来引起学者的极大兴趣。 1 水产品生物活性肽概述
水产品生物由于其极端的生长环境，相较于陆生动植物蛋白来源于的蛋白质，显示了出独特的优势与特性。譬如，藻类生物为了防止严重的氧化损伤，可以产生抗氧化肽而提供自我保护[2]；水产品生物毒性较强的多肽类，通常作用于离子通道，具有特定的生理活性，如神经保护肽、镇痛肽、抗病毒肽等[3]；研究显示，大多数水产品加工副产物的蛋白水解产物中Gly、Pro、Val、Tyr和Glu的含量更高[4]。水产品生物活性肽的优势与特性见表1。
表1 水产品生物活性肽的优势与特性
Table 1 Advantages and characteristics of aquatic product bioactive peptides
目前，尽管已经报道了大量鱼类来源的生物活性肽，但是其他水产品生物，例如甲壳类、软体动物来源的生物活性肽尚未被大量研究。而以水产品鱼、虾、贝、甲壳类为主的抗菌、降血压、抗癌活性肽也未进行过系统的概述。
2 水产品生物活性肽的制备、分离纯化和结构鉴定方法
2.1 水产品生物活性肽的制备方法
通常从生物体中获得生物活性肽主要有以下3种途径：(1)通过提取直接从生物体内分离得到天然活性肽类；(2)通过体外水解蛋白质降解获得具有生理功能的活性肽；(3)人工合成法制备生物活性肽，酶合成、化学合成或重组DNA技术。 目前在水产多肽的制备中酶法水解是一个热门技术，尤其在食品与药物中，因为该过程安全、可控，反应条件温和。同时，蛋白质类物质在酶的催化下，降解产生的小肽，不会与体内氨基酸吸收产生竞争，因此可以用制备得到的多肽模拟人体蛋白的体外降解。
2.2 水产品生物活性肽的分离纯化和结构鉴定方法
水解产物本身也可以用作生物活性化合物的商业来源。但是，从水产生物中提取的多肽，通常含量较低，而经分离纯化后的肽其生物活性较高。因此，分离纯化程度是水产活性肽研究的关键环节。目前，水产品生物活性肽已通过多种技术进行了研究，包括超滤、凝胶过滤、离子交换色谱和反相高效液相色谱技术[12]。
纯化后的水产品生物活性肽一般需要深入进行结构鉴定的研究。通常采用质谱技术、凝胶过滤色谱、电喷雾串联质谱、高效液相色谱分离或蛋白质测序阐明其一级结构用于检测分子质量、氨基酸序列或氨基酸组成。
3 水产品生物活性肽的研究进展
3.1 抗氧化活性肽
区别于植物体中通过抑制线粒体损伤或抑制亚麻酸氧化体系的脂质过氧化和畜禽体中抑制必需脂肪酸的过氧化而具备的抗氧化功能，水产品中的抗氧化活性是由于疏水性氨基酸或小分子肽的抗氧化作用。目前，具有抗氧化能力的小分子活性肽已成为当前的研究热点之一[13]。
3.1.1 源于鱼类 鱼类资源丰富易捕捞，是制备抗氧化肽最常见的水产资源。目前鱼类抗氧化肽的制备多来源于低值鱼及其下脚料。SAMPATH等[14]采用连续色谱分离技术从竹荚鱼和黄花鱼的皮肤蛋白水解物中纯化出2种具有抗氧化特性的肽。并利用电子喷雾电离双质谱法鉴定其肽序列分别为Asn-His-Arg-Tyr-Asp-Arg和Gly-Asn-Arg-Gly-Phe-Ala-Cys-Arg-His-Ala。结果表明与天然抗氧化剂α-生育酚相比，这2种肽均显示出更高的抗多不饱和脂肪酸过氧化活性，可有效地用作食品添加剂和药物。
3.1.2 源于贝类
贝类蛋白在水产品功能活性肽的研究中占比相对较多，但起步较晚。目前，酶法水解贝类多肽研究较多，主要集中在对扇贝、牡蛎和文蛤等重要贝类资源的利用。WANG等[15]采用凝胶过滤色谱法和反相高效液相色谱技术分离纯化牡蛎水解物的抗氧化活性肽，采用新技术纳米ESI-MS/MS分析氨基酸序列，得到2种新型抗氧化肽，Pro-Val-Met-Gly-Asp和Gln-His-Gly-Val，这2种肽在其序列中分别包含组氨酸和蛋氨酸，与当前其他抗氧化肽没有任何显著同源性，有助于中国工业更好地利用廉价的生物活性材料。
3.1.3 源于甲壳类
甲壳类动物不同于其他动物，外壳坚硬、体积较大，从虾蟹壳中制备抗氧化肽，原料数量大。黄湛媛等[16]为实现竹节虾的高值化利用，采用超声辅助酶解工艺对其虾头副产物进行酶解，利用超高压液相色谱串联质谱技术对肽结构进行表征，结果显示相对分子质量<3 kDa的组分具有显著的抗氧化活性，采用超高压液相色谱串联质谱联用技术对抗氧化肽的结构进行鉴定为Gly-Asn-Gly-Leu-Pro。
3.1.4 源于藻类
藻类被视为天然的生物反应器，是目前已知食品中蛋白质含量和质量最高的，是天然抗氧化肽的重要来源[17]。
ZHANG等[18]采用不同蛋白酶从藻类中制备抗氧化肽，结果显示α-胰凝乳蛋白酶的水解产物具有最高的抗氧化活性，通过超滤、凝胶排阻色谱和反相高效液相色谱进行分离、纯化后，再通过超高效液相色谱-串联质谱(ultra performance
liquid chromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)鉴定抗氧化肽的序列为Glu-Leu-Trp-Lys-Thr-Phe，结果证实，Glu-Leu-Trp-Lys-Thr-Phe可以显着清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基，自由基清除率为50%时所需样品的浓度(EC50:concentration for 50% of maximal effect，EC50 )为1.514 mg/mL。SHEIH等[19]采用胃蛋白酶酶解从藻类蛋白废料中获得抗氧化肽，通过反相高效液相色谱对目标肽段进行进一步的分离纯化，用质谱仪鉴定其氨基酸序列为Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe，半抑制浓度(50% inhibiting
concentration， IC50)为(256.4±1.2) μmol/L，研究显示，廉价的藻类蛋白废料可能是生产抗氧化肽的新选择。
3.1.5 源于水产品加工副产物
中国水产资源丰厚，总鱼虾贝类的捕捞量居全球前列，然而近海岸的水产品加工废弃物及低值蛋白质资源浪费严重，高值化利用低值水产资源越来越成为水产领域研究的热点。HSU[20]，使用定向酶(orientase，OR)和蛋白酶(protease
XXIII，PR) 这2种商业酶对金枪鱼黑肌肉副产物进行酶解制备抗氧化肽。然后，对蛋白质水解物进行Sephadex G-25凝胶过滤层析并利用两步高效液相色谱法进一步分离肽级分。结果表明，使用2种蛋白酶酶解后分子质量为390～1 400
Da的肽级分显示出最高的抗氧化活性，来自OR和PR水解产物的2种抗氧化肽的氨基酸序列为Leu-Pro-Thr-Ser-Glu-Ala-Ala-Lys-Tyr和Pro-Met-Asp-Tyr-Met-Val-Thr。
抗氧化肽除了来自于水产品的下脚料外，还来自于部分副产物的胶原蛋白中。WU等[21]采用酶法水解鲑鱼皮肤胶原蛋白，超滤后，通过尺寸排阻色谱法进一步纯化，并使用质谱鉴定抗氧化肽级分。结果表明，从超滤级分中鉴定出一种新序列肽Pro-Met-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Tyr-His-Tyr，是一种小分子质量的抗氧化肽，通过抗氧化能力指数(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)分析显示该肽具有抗氧化活性[(2.51±0.14)mmol TE/g]。同时，研究结果表明，超滤级分中的较大肽段(> 3 kDa)可被鉴定为潜在的冷冻保护剂。
3.2 降血压活性肽
世界各国高血压平均发病率为10%～20%，在我国目前，大约有25%的成年人患有此病，预计到2025 年这一比例将高达29%[22]。从水产品中分离纯化得到的食源性降血压肽，来源于生物体本身，相对于人工合成的降压药而言，具有对人体组织温和、安全、亲和力强，药效持久，无副作用等优点。因此从水产品中分离纯化降血压肽更加符合当代人的消费理念，具有较好的发展前景。 酶解水产品制备降血压肽，最早是从带鱼和沙丁鱼开始的，在接下来的数十年间，越来越倾向于向水产品中开发探索血管紧张素转换酶抑制成分，发现虾、螃蟹、藻类、贝类、罗非鱼等水产品的酶解物中，都存在此物质。
3.2.1 源于鱼类
水产生物中的降血压肽，最早是从鱼贝类中提取的，目前更多的是集中于对其降血压机理的研究。部分研究表明血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制肽的活性与其结构具有一定的关系，已经报道活性肽在N-末端具有脂肪族氨基酸如Val、Met和Ile，以及诸如Pro、Phe的芳香族氨基酸，将具有较强的抑制作用[23]。此外，大多数抑制ACE的肽至少有1个脯氨酸残基。吴靖娜等[24]利用复合蛋白酶酶解制备罗非鱼鱼皮胶降血压肽，为测定高ACE抑制率的氨基酸组分，通过超滤膜对不同分子质量组分截留纯化，从而比较不同组分ACE抑制率。结果表明，ACE抑制活性最强的组分集中在相对分子质量小于2 000 Da以下，对该组分发挥作用的氨基酸主要是Gly和Pro。
3.2.2 源于贝类
某些海洋贝类肽能够抑制ACE活性，这些活性多肽通常是加密在亲本蛋白的一级结构中，只有当其被释放出来后才表现出来。牡蛎因其高价值高产量等特点，一直是贝类生物活性肽研究的热点。
WANG等[25]选用胃蛋白酶酶解牡蛎蛋白，从牡蛎蛋白中释放出ACE抑制肽，并采用 Sephadex LH-20凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱进行分离，制备出具有序列Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe的九肽，通过给予动物口服实验，证明其ACE抑制活性的有效性。LIU等[26]采用酶法从珍珠牡蛎肉蛋白中制
