H7亚型和N9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立王楷宬;王素春;朱琳;仲焕香;黄保续【摘要】为满足禽流感病毒高通量快速检测的需要,建立了一种能够检测各亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评估,使用该方法与农业行业标准NY/T772-2013中的禽流感病毒RT-PCR方法同时进行临床样品检测.结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10-4ng/μL,与传统的RT-PCR方法阳性符合率为100％.结果表明,本方法能实现对禽流感病毒的安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量检测,从而弥补了现有传统检测技术的不足.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2019(036)004【总页数】6页(P64-69)【关键词】禽流感病毒;实时荧光定量RT-PCR;检测【作者】王楷宬;王素春;朱琳;仲焕香;黄保续【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;南京农业大学,江苏南京210095;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032【正文语种】中文【中图分类】S852.65禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）为单股负链RNA病毒，由 8个独立的RNA节段组成。

该病毒的显著生物学特征之一是亚型众多、变异频繁。

迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据病毒粒子表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性差异，将其分为18种HA亚型（H1～H18）和11种 NA 亚型（N1～N11）[1-3]。

禽流感分布很广，世界各地均有分离出该病病原的报道。

其病原致病性有高致病性和低致病性之分。

禽流感的发生给养禽业造成严重危害。

据联合国粮农组织（FAO）报告，2003—2004年禽流感在越南暴发导致的损失预计为该国GDP的0.3%～1.8%[4]。

专利名称：用于检测高致病性H7N9禽流感病毒的RT-LAMP 引物及方法
专利类型：发明专利
发明人：杨素,黄海超,陈轩,赵福振,沙才华,邵建宏
申请号：CN201910823822.2
申请日：20190902
公开号：CN110551850A
公开日：
20191210
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种用于检测高致病性H7N9禽流感病毒(HP‑H7N9)的RT‑LAMP引物及方法。

本发明建立的HP‑H7N9 RT‑LAMP检测方法，可特异性检测HP‑H7N9，而与低致病性H7N9流感病毒(LP‑H7N9)、H7N3流感病毒、H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒(Re‑6疫苗株)、H5亚型禽流感病毒(Re‑8疫苗株)、H7亚型禽流感病毒(Re‑1疫苗株)、H9亚型禽流感病毒、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)等不发生交叉反应；可检测到最低浓度为5.94×10copies/μL的阳性质粒；耗时仅为1.5～2h；检测成本较低；是HP‑H7N9快速检测的良好方法。

申请人：拱北海关技术中心
地址：519000 广东省珠海市银桦路501号
国籍：CN
代理机构：广州嘉权专利商标事务所有限公司
代理人：郑莹
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禽流感病毒 H5、H7和 H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立屈素洁;莫胜兰;邹联斌;胡杰;张步娴;梁媛;粟艳琼;施开创;李军【摘要】To develop a rapid multiplex RT-PCR assay for detection ofH5,H7,H9 subtype AIV,specific primers were designed with Primer 5.0 software according to the conserved region of the H5,H7,H9 sub-type AIV hemagglutinin gene.The results of this one step-multiplex RT-PCR demonstrated that the specif-ic bands of 380 bp,501 bp and 732 bp were observed simultaneously for RNA isolated from H5,H7 and H9 subtype AIV.And the reaction conditions were optimized to develop one step-multiplex RT-PCR assay for detection of H5,H7,H9 subtype AIV.The method has high specificity and sensitivity.The minimal amount of detection was10-4 copies/μL RNA of H5,10-4 copies/μL RNA of H7 and 10-2 copies/μL RNA of H9 subtype AIV,respectively.There was no cross-reaction with other avian pathogens after amplifica-tion.The molecular diagnose method was preliminarily established to detect H5,H7 and H9 subtypes of a-vian influenza viruses rapidly,sensitively and specifically.%为了建立能同时检测 H5、H7和 H9亚型禽流感病毒（AIV）的方法，参考 GenBank中 H5、H7和 H9亚型AIV的 HA基因序列的保守区域，利用Primer 5．0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和 H9亚型的特异性引物，预期特异扩增 H5 AIV片段大小为380 bp、H7 AIV为501 bp、H9 AIV为732 bp。

禽流感病毒RT-LAMP检测技术的建立彭宜;谢芝勋;刘加波;庞耀珊;邓显文;谢志勤;谢丽基;范晴;罗思思【摘要】根据GenBank中禽流感病毒(AIV)M基因序列,设计针对所有亚型AIV 的通用检测引物,并对反应条件进行优化,建立了检测AIV的逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)可视化检测方法.结果表明,建立的检测方法对禽流感病毒总RNA最小检出限为10 fg,灵敏度为RT-PCR的1 000倍,能特异地检测出所有不同的HA 亚型禽流感病毒,对其他禽呼吸道病原体无扩增反应；本方法快速,在常规水浴锅或金属恒温槽中50 min就可完成,反应结束后不需开盖即可直接用肉眼根据反应液的颜色变化对结果进行判定.本研究建立的禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法具有操作简便、仪器设备要求简单、灵敏、快速、特异等优点,适合在基层进行AIV的快速早期筛检.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)012【总页数】4页(P43-46)【关键词】逆转录-环介导等温扩增;禽流感病毒;检测【作者】彭宜;谢芝勋;刘加波;庞耀珊;邓显文;谢志勤;谢丽基;范晴;罗思思【作者单位】广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S852.657禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（AIV）引起的禽流行性感冒的简称［1］。

根据AIV表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）抗原性不同，AIV可分为16个HA亚型和10个NA亚型［2－3］。

禽流感据其临床症状又可分为高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（Mildly pathogenic avian influenza，MPAI）。

HPAI由H5、H7亚型AIV引起，以高发病率和高病死率为特征。

MPAI可由所有的HA亚型（H1－H16）AIV引起，通常引起较温和的临床症状［4－5］。

禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法的建立乔明明;孙明;冯向辉;王静;王传彬;才学鹏;陈西钊【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2016(037)001【摘要】为建立一种简便、快速、灵敏、准确的禽流感病毒N9亚型检测方法,根据GenBank中收录的禽流感病毒N9亚型高度保守的基因序列设计引物,通过优化反应条件建立禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法,并对该方法进行灵敏度、敏感性、特异性试验和临床样品检测.建立了禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法,用该方法检测时,H7N9、H10N9均呈阳性,而非N9亚型的禽流感病毒及新城疫病毒等其他禽传染病病毒均呈阴性,能检测到1/32血凝单位的H7N9禽流感病毒.建立了禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法,具有操作简便、灵敏度高、特异性强的特点,值得推广应用.【总页数】4页(P25-28)【作者】乔明明;孙明;冯向辉;王静;王传彬;才学鹏;陈西钊【作者单位】北京世纪元亨动物防疫技术有限公司,北京100085;北京世纪元亨动物防疫技术有限公司,北京100085;北京世纪元亨动物防疫技术有限公司,北京100085;北京世纪元亨动物防疫技术有限公司,北京100085;中国动物疫病预防控制中心,北京100125;中国动物疫病预防控制中心,北京100125;北京世纪元亨动物防疫技术有限公司,北京100085;中国动物疫病预防控制中心,北京100125【正文语种】中文【中图分类】S855.3【相关文献】1.H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立 [J], 王云鹤;陈化兰;包红梅;孙佳善;李雁冰;徐晓龙;王子龙;施建忠;曾显营;王秀荣2.H5亚型和N6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立 [J], 何莹;谢芝勋;罗思思;李孟;谢志勤;谢丽基;黄莉;邓显文;黄娇玲3.鉴别禽流感病毒H5、H7、H9亚型及N1-N9亚型RT-PCR方法的建立 [J], 陈静;杨谨瑜;严红亚;李珂;常志顺;信爱国4.H10亚型和N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立 [J], 罗思思;曾婷婷;张民秀;谢芝勋;谢志勤;谢丽基;邓显文;范晴;黄娇玲;张艳芳;王盛5.H4亚型和N2亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立 [J], 罗思思; 张艳芳; 范晴; 谢志勤; 邓显文; 谢芝勋; 李孟; 黄娇玲; 李丹; 谢丽基; 张民秀; 曾婷婷; 王盛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

禽流感（avian influenza ，AI ）是由正粘病毒科、流感病毒属A 型流感病毒引起的禽类（家禽或野禽，以及部分哺乳动物）传染病[1]。

禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疫病。

尤其是高致病性禽流感，是OIE 规定的法定报告A 类动物疫病[2]。

禽流感病毒在流行的过程中不断变异，跨越宿主屏障，H5N1亚型禽流感病毒和H7N9亚型禽流感病毒屡次暴发疫情，给养禽业和人类的生命安全带来巨大的威胁。

H9亚型禽流感病毒并未被规定为高致病性禽流感，往往被人们所忽视，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。

此外，有研究显示H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产生新型禽流感病毒[3,4]。

目前国内外检测禽流感病毒最常用和经典的方法是鸡胚病毒分离，并且是国际贸易中指定的检测方法，但该方法技术要求高、耗费时间长，在疫情暴发时不利于病原的快速诊断和疫情控制。

以分子生物学技术为基础的荧光PCR 方法已成为病原核酸检测的主要方法，目前市场的禽流感病毒检测手段多以单重RT-PCR 为主，不能区分具体亚型，但在平时疫情检测和实施扑灭措施时对这些病毒亚型进行快速检测和定型非常重要。

本研究基于Taq-Man-MGB 荧光RT-PCR 技术建立一种禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法，能够在一次反应中对样本中的病毒进行快速定型，满足准确、快速的检测需求。

1材料与方法1.1质粒样品携带禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型HA2靶基因序列片段重组质粒pUC57-AIV-H579，浓度为104copies/μL 。

1.2禽流感病毒核酸样品禽流感病毒H5亚型核酸样品15份、禽流感病毒H7亚型核酸样品15份、禽流感病毒H9亚型核酸样品15份，禽流感病毒阴性核酸样本30份，由扬州大学禽流感病毒专业实验室分离、鉴定、保存和提供。