小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体的构建及体外对树突状细胞的作用

中图分类号：Ｓ　８５２．４２　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７３－４６９６（２０１０）０９－０９５３－０６牛共刺激分子ＣＤ８０和ＣＤ８６实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立与应用韩猛立１，２，何延华１，黄　新１，宋天增１，２，薄新文１，钟发刚１＊（１．新疆生产建设兵团绵羊繁育生物技术重点实验室，新疆石河子　８３２０００；２．石河子大学动物科技学院，新疆石河子　８３２００３） 摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ中牛ＣＤ８０和ＣＤ８６基因的序列，在保守区设计并合成各自的特异引物，并以牛３－磷酸甘油脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）基因为内参，采用ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ染料以建立一种检测牛共刺激分子ＣＤ８０和ＣＤ８６的ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ实时荧光定量ＰＣＲ方法。

将ＣＤ８０基因和ＣＤ８６基因克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经ＰＣＲ及测序鉴定后得到阳性重组质粒，作为标准品模板建立ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ荧光定量ＰＣＲ标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。

结果表明，ＣＤ８０基因、ＣＤ８６基因和ＧＡＰＤＨ基因的Ｃｔ值与标准品稀释度在１×１０２～１×１０８　ｃｏｐｉｅｓ／μＬ范围均呈良好的线性关系，相关系数均大于０．９９１。

熔解曲线分析表明，产物为特异的单峰，特异性和重复性较好。

证实，所建立的牛共刺激分子ＣＤ８０和ＣＤ８６荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法适用于临床样品的检测。

关键词：ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ；实时荧光定量聚合酶链反应；牛；ＣＤ８０；ＣＤ８６Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ＣＤ８０ａｎｄ　ＣＤ８６ｇｅｎｅｓＨＡＮ　Ｍｅｎｇ－ｌｉ　１，２，ＨＥ　Ｙａｎ－ｈｕａ１，ＨＵＡＮＧ　Ｘｉｎ１，ＳＯＮＧ　Ｔｉａｎ－ｚｅｎｇ１，２，ＢＯ　Ｘｉｎ－ｗｅｎ１，ＺＨＯＮＧ　Ｆａ－ｇａｎｇ１（１．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｓｈｅｅｐ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　＆Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｃｏｒｐｓ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　８３２０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　８３２００３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｂｏｖｉｎｅ　ｃｏ－ｓｔｉｍｕ－ｌａｔｅｓ　ｇｅｎｅｓ　ＣＤ８０ａｎｄ　ＣＤ８６，ｔｈｒｅｅ　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｂｏｖｉｎｅ（ＢｏＣＤ８０，ＣＤ８６）ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｂｏｖｉｎｅ　ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＢｏＧＡＰ－ＤＨ）ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｎ　ｉｎｔｅｒｎａ１ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄ－ｕｃｔ　ｗａｓ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＭＤ１８－Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｑｕａｎ－ｔｉｔａｔｉｖｅ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ａｎｄ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ｃｕｒｖｅ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　Ｃｔｏｆ　ＢｏＣＤ８０，ＣＤ８６ｏｒ　ＢｏＧＡＰＤＨ　ｇｅｎｅｓ　ｈａｄ　ａｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ（ｒ２＞０．９９１）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　１×１０２　ｔｏ　１×１０８　ｃｏｐｉｅｓ／μＬ，ａｎｄ　ｔｈｅｍｅｌｔｉｎｇ　ｃｕｒｖｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｐｅａｋ　ａｎｄ　ｍｏｒｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ．Ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｓ－ｓａｙ　ｃｏｕｌｄ　ｑｕｉｃｋｌｙ　ｄｅｔｅｃｔ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ；ｃａｔｔｌｅ；ＣＤ８０；ＣＤ８６ 机体对病原体的特异性免疫应答机制十分复杂，涉及抗原递呈细胞对抗原的识别、淋巴细胞的功能及共刺激分子的第二信号等诸多因素［１］。

小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定一、本文概述本文旨在探讨小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定。

我们将详细介绍Zhangfei基因在小鼠体内的功能和作用，以及其在生物学研究中的重要性。

接着，我们将阐述过表达和shRNA干扰技术在基因功能研究中的应用，并解释为何选择慢病毒载体作为本研究的工具。

在构建过表达慢病毒载体方面，我们将采用基因克隆技术将小鼠Zhangfei基因插入慢病毒载体，以实现目的基因的高效表达。

同时，我们将对构建的过表达载体进行严格的鉴定，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。

在构建shRNA干扰慢病毒载体方面，我们将设计并合成针对小鼠Zhangfei基因的特异性shRNA序列，并将其插入慢病毒载体以干扰Zhangfei基因的表达。

我们将对构建的shRNA干扰载体进行同样的鉴定步骤，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。

我们将对构建的过表达和shRNA干扰慢病毒载体进行功能验证，以评估其在小鼠体内对Zhangfei基因表达的调控效果。

本研究的成果将为进一步揭示Zhangfei基因的功能和机制提供有力的工具，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。

二、材料与方法2 载体：慢病毒载体pLV-IRES-Puro和pLV-shRNA2购自Clontech 公司。

3 酶和试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、PCR 引物、PCR试剂等购自TaKaRa公司；胎牛血清（FBS）和DMEM培养基购自Gibco公司；脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；小鼠Zhangfei基因的cDNA序列通过PCR从小鼠cDNA文库中扩增得到。

4 仪器：PCR仪、凝胶电泳仪、超净工作台、离心机、细胞培养箱、荧光显微镜、倒置显微镜等。

小鼠骨髓源树突状细胞体外诱导培养及初步鉴定刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【摘要】To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells ( DC) from mouse bone marrow in vitro and observe their morphology, recombinant mouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor( GM-CSF) and interleukin-4( IL4) induction were used to induce mouse bone marrow cells to form dendritic cells in vitro. After 9 days , the percentage of the cultured DCs was more than 80％ with typical morphology of DCs under light microscope. The mature cells had clear marker on their surface. This meant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.%用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞,进行形态学变化观察,分析细胞表面分子,刺激T细胞增殖,探讨小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)体外诱导培养并进行初步鉴定.体外培养9d后BMDC可达80%以上m,光镜下可见典型的树突状细胞形态.清楚表达成熟期主要表面标志物,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖.获得了较高纯度的BMDC,避免了使用传统磁珠分离方法所带来的成本高,操作复杂,产出率低的弊端,为研究BMDC功能以及运用开展下游实验提供材料.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)002【总页数】4页(P25-27,31)【关键词】树突状细胞;体外诱导培养;初步鉴定【作者】刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【作者单位】儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地【正文语种】中文【中图分类】Q813.5Abstract:To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells(DC)from mouse bone marrow in vitro and observe theirmorphology,recombinantmouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor(G M-CSF)and interleukin-4(I L4)induction were used to inducemouse bonemarrow cells to for m dendritic cells in vitro.After9 days,the percentage of the culturedDCswasmore than 80%with typicalmorphology ofDCs under lightmicroscope.The mature cells had clearmarker on their surface.Thismeant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.Keywords:dendritic cells;culture in vitro;initial appraisal树突状细胞(dendritic cell,DC)是一种专职性抗原提呈细胞,在肿瘤、抗感染免疫、移植排斥等方面起着关键的引导和调节作用,并能显著激活初始型 T淋巴细胞并诱导其增殖,处于免疫应答过程的中心环节。