口腔生物医学２０１１年３月（第 鲞箜 塑！ 旦 ：∑ ： ． ！： Ｑ
［文章编号］ １６７４—８６０３（２０１ １）０ｌ＿００１７－０５
Ｅ２Ｆ一１基因ＲＮＡｉ慢 病毒载体的构建与鉴定
江 飞，袁 华，丁思阳，牛玉明，杜一飞，陈 宁
（南京医科大学口腔医学研究所・附属口腔医院口腔颌面外科，江苏南京２１００２９） ・ｌ７・
［摘要］ 目的：构建和鉴定靶向Ｅ２Ｆ一１基因的ＲＮＡ干扰慢病毒载体。方法：体外合成两对互补并编码靶向Ｅ２Ｆ一１基因的特异 性短发夹ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）序列和一个阴性对照组的寡核苷酸，克隆到ｐＬＫＯ．１一ＰＵＲＯ—Ｕ６（Ａｇｅ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉ）质粒 载体中．经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确，将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染２９３Ｔ细胞．包装产生病毒 颗粒。各组病毒载体转染Ｔｃａａｌ １３细胞后，运用Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ检测三组Ｅ２Ｆ一１ ｍＲＮＡ和蛋白的表达水平。结果： 经酶切和测序证明，ｐＬＫＯ．１一ＰＵＲＯ—Ｕ６一Ｅ２Ｆ一１ ｓｈＲＮＡ序列正确；转染后，各组慢病毒载体中，第一组质粒感染后的Ｔｃａ８１１３细胞 中Ｅ２Ｆ一１基因的核酸电泳条带明显减弱，Ｗｅｓｔｅｒｎ检测出Ｅ２Ｆ一１蛋白的表达降低。结论：靶向Ｅ２Ｆ一１基因的ｓｈＲＮＡ慢病毒载体 构建成功，并可特异性沉默Ｅ２Ｆ一１基因的表达，为研究Ｅ２Ｆ一１在口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。
［关键词］ Ｅ２Ｆ一１；ＲＮＡ干扰；口腔鳞癌；慢病毒载体 ［中图分类号］ Ｑ７８２ ［文献标识码］ Ａ ［ｄｏｉ］ １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４—８６０３．２０１１．０１．００４
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｅ２Ｆ一１ ｇｅｎｅ ＪＩＡＮＧ Ｆｅｉ，ＹＵＡＮ Ｈｕａ，Ｄ１ＮＧ Ｓｉ—ｙａｎｇ，Ｍｆ／ －ｒｕｉｎｇ，ＤＵ Ｙｉ ，ＣＨＥＮ Ｎｉｎｇ．（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＯｒａｌ ａｎｄ
４２９６ 实用医学杂志２０１０年第２６卷第２３期
ＰＴＥＮ基因重组慢病毒的构建
陈玲娜 蒋磊谷杭芝郑飞云
摘要 目的：构建ＰＴＥＮ基因重组慢病毒，转染真核细胞Ｉｓｈｉｋａｗａ并检测ＰＴＥＮ基因在真核细胞内的表 达。方法：分子克隆重组人ＰＴＥＮ基因与含有ＣＭＶ启动子和绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）的慢病毒载体ＰＬＩＧ。ＰＣＲ筛 选阳性克隆，测序鉴定。将重组子ＰＬＩＧ．ＰＴＥＮ和包装质粒共转染包装细胞２９３Ｔ细胞，包装产生慢病毒，感染 子宫内膜癌细胞株Ｉｓｈｉｋａｗａ，观察慢病毒表达载体所携带的ＧＦＰ基因在细胞内的表达．使用ＲＴ．ＰＣＲ和 ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测ＰＴＥＮ基因在细胞内的表达水平。结果：ＰＣＲ和测序证实，成功克隆慢病毒载体ＰＬＩＧ—ＰＴＥＮ． 包装慢病毒，感染真核细胞Ｉｓｈｉｋａｗａ后４８ ｈ，观察到绿色荧光的广泛表达并检测出宿主细胞内表达的ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ成功表达ＰＴＥＮ蛋白。结论：本实验成功地构建了人ＰＴＥＮ基因慢病毒载体，湃观察到ＰＴＥＮ基因在真 核细胞中的成功表达。 关键词慢病毒属；ＰＴＥＮ； Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞
ＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ）基因．即“与张力蛋白和辅助蛋 白同源、第１０号染色体丢失的磷酸酶基因”．定位
于１０ｑ２３．３染色体。具有９个外显子和８个内含
子，ｃＤＮＡ序列包含由１ ２０９个核苷酸组成的开放 式阅读框架编码４０３个氨基酸组成的蛋白质。ＰＴＥＮ
蛋白有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，是至今发现 的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。在生长因子
的细胞信号传递中起着复杂而重要的作用 ］。 肿瘤基因治疗近年来有很大的发展．尤其是随
着慢病毒载体的发现和发展．为肿瘤基因治疗提供
了一类新型载体。慢病毒载体基于ＨＩＶ改造产生， 相对于以往所用的载体如腺病毒、腺相关病毒、逆
慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。
2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。
3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。
4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源基因的表达效果。通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载体进行验证。
总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗和生命科学研究具有重要意义。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体是一种常用于基因转染和基因治疗研究的工具，其构建原理主要包括载体选择、基因插入、包装和转染等几个关键步骤。下面将分别对这些步骤进行详细介绍。
首先，载体选择是慢病毒构建的第一步。常用的慢病毒载体包括pLenti、pSico、pRetro等，这些载体通常具有较高的转染效率和稳定性。在选择载体时，需要考虑载体的大小、复制能力、转染效率以及转染细胞类型等因素，以确保最终构建的慢病毒载体能够满足实验需求。
其次，基因插入是慢病毒构建的关键步骤之一。一般来说，可以利用限制性内切酶切割载体，然后将待插入的基因片段与载体连接，形成重组载体。在进行基因插入时，需要注意选择合适的限制性内切酶，控制酶切的时间和温度，以确保基因能够正确插入到载体中。
接下来是包装步骤。包装是指将重组载体导入到包装细胞中，通过包装细胞的辅助，使其产生慢病毒颗粒。常用的包装细胞包括293T细胞、HEK293细胞等。在包装过程中，需要利用辅助载体，如pMD2.G和psPAX2等，通过三质体共转染的方式，使包装细胞产生慢病毒颗粒。
最后是转染步骤。转染是将包装好的慢病毒颗粒导入到目标细胞中，实现基因的转染。在进行转染时，需要根据目标细胞的特性选择合适的转染方法，如离体转染、体内转染等，以确保慢病毒能够有效地转染目标细胞，并表达目标基因。
总的来说，慢病毒载体构建的原理涉及到载体选择、基因插入、包装和转染等关键步骤。通过合理的实验设计和操作，可以构建出稳定、高效的慢病毒载体，为基因转染和基因治疗研究提供有力的工具支持。
