西洋参抗心脏肥大的网络药理学分析和实验验证研究邱雨美1,李冰涛2,欧阳长生3,谢梦蝶1,李洪铭1,涂珺2,尚广彬2,汤喜兰1,4摘要目的:通过网络药理学探讨西洋参多成分㊁多靶点㊁多通路的抗心脏肥大作用机制,并选取关键靶点进行细胞实验验证㊂方法:通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)㊁中医药百科全书(ETCM)㊁有机小分子生物活性数据库(PubChem)㊁多靶点定量构效关系的靶点预测平台数据库(Targetnet)㊁小分子药物靶点预测在线平台(Swiss Target Prediction)等数据库及参考文献筛选西洋参活性成分及作用靶点㊂通过人类孟德尔遗传数据库(OMIM)㊁药物靶标数据库(TTD)及基因名片数据库(GeneCards)筛选心脏肥大相关靶点㊂将药物的作用靶点与疾病靶点进行交集,获得药物-疾病共同靶点,利用STRING数据库构建PPI网络图,并借助Cytoscape3.8.0软件进行可视化分析,采用注释㊁可视化和综合发现(DAVID)数据库对重要靶点进行基因本体(GO)功能与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析㊂进一步采用异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大模型,观察西洋参抗心肌细胞肥大作用,逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测关键靶点的基因表达㊂结果:从西洋参中筛选出42个活性成分,能够作用于41个心脏肥大相关靶点,其中血管内皮生长因子A(VEGFA)㊁丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)㊁表皮生长因子受体(EGFR)㊁肿瘤坏死因子(TNF)㊁丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)等21个靶点是关键靶点,主要涉及一氧化氮合成过程的正调控㊁脂多糖介导的信号通路㊁肽基-丝氨酸磷酸化的正调控,参与调节癌症蛋白多糖㊁血管内皮生长因子(VEGF)信号通路㊁缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路等㊂进一步细胞实验结果表明,西洋参100.0μg/mL可抑制异丙肾上腺素10μmol/L诱导的心肌细胞肥大(P<0.05)㊂在异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大模型中,VEGFA㊁AKT1㊁EGFR㊁TNF㊁MAPK1mRNA表达上调(P<0.05),西洋参可明显抑制上述关键靶点基因表达上调(P<0.05)㊂结论:西洋参抗心脏肥大的作用机制可能与下调VEGFA㊁AKT1㊁EGFR㊁TNF㊁MAPK1等多个靶点的基因表达有关㊂关键词心脏肥大;西洋参;网络药理学;实验验证;作用机制d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2023.07.011Network Pharmacological Analysis and Experimental Verification of Panax Quinquefolius for Cardiac HypertrophyQIU Yumei,LI Bingtao,OUYANG Changsheng,XIE Mengdie,LI Hongming,TU Jun,SHANG Guangbin,TANG XilanSchool of Pharmacy,Jiangxi Science&Technology Normal University,Nanchang330013,Jiangxi,China Corresponding Author TANG Xilan,E-mail:*********************Abstract Objective:To explore the mechanism of Panax quinquefolius in cardiac hypertrophy by network pharmacology,and to verify the key targets in cardiomyocytes hypertrophy model in vitro.Methods:The traditional Chinese medicine system pharmacology database(TCMSP),the Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine(ETCM),PubChem,Targetnet,Swiss Target Prediction databases, and references were used to obtain the active components and targets of Panax quinquefolius.The targets related to cardiac hypertrophy were searched through Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM),Therapeutic Target Database(TTD),and the human gene database(GeneCards).The common targets were obtained by intersecting drug targets with disease targets.In order to screen the key common targets,STRING database and Cytoscape software were used to analyze the protein-protein interaction of common targets.DAVID database was used to conduct gene ontology(GO)function and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) enrichment analysis on the common targets to obtain the relevant biological processes and signal pathways.The H9c2cardiomyocytes hypertrophy model induced by isoproterenol was further used to observe the anti-cardiac hypertrophy effect of Panax quinquefolius, and real-time quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR)was performed to detect the gene expression of key targets.Results: Forty-two active components were screened from Panax quinquefolius,which could act on41targets related to cardiac hypertrophy. Among them,21targets,including vascular endothelial growth factor A(VEGFA),serine/threonine protein kinase1(AKT1),epidermal growth factor receptor(EGFR),tumor necrosis factor(TNF),and mitogen activated protein kinase1(MAPK1)were the key targets.They were mainly involved in nitric oxide synthesis,lipopolysaccharide-mediated signaling pathway,myocardial contraction,cell proliferation and migration,and other biological processes,as well as the regulation of cancer proteoglycan,vascular endothelial growth factor (VEGF)signaling pathway and hypoxia-induced-factor-1signaling pathway(HIF-1),etc.Cell experimental results showed that Panax quinquefolius100.0μg/mL could inhibite10μmol/L of isoproterenol induced cardiomyocytes hypertrophy(P<0.05).Panax quinquefolius inhibited isoproterenol induced significant upregulations of genes including VEGFA,AKT1,EGFR,TNF,and MAPK1(P<0.05). Conclusion:The anti-cardiac hypertrophy mechanism of Panax quinquefolius may be related to the gene expression of multiple targets including VEGFA,AKT1,EGFR,TNF,and MAPK1.Keywords cardiac hypertrophy;Panax quinquefolius;network pharmacology;experimental verification;mechanism基金项目国家自然科学基金项目(No.81960732);江西省自然科学基金项目(No.20181BAB215041);江西科技师范大学学位与研究生教育教学改革项目(No.KSDYJG-2019-06)作者单位 1.江西科技师范大学药学院(南昌330013);2.江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心;3.江西省人民医院;4.江西省药物分子设计与评价重点实验室(南昌330013)通讯作者汤喜兰,E-mail:*********************引用信息邱雨美,李冰涛,欧阳长生,等.西洋参抗心脏肥大的网络药理学分析和实验验证研究[J].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(7):1224-1232.研究显示,2019年全球心血管疾病患病人数为5.23亿例,死亡人数为1860万例[1]㊂我国心血管疾病现患人数为3.3亿例,因心血管疾病死亡占城乡居民总死亡原因的首位,受城镇化进程及人口老龄化加速的影响,我国心血管疾病的患病率及死亡率仍处于上升阶段[2]㊂临床上多种心血管疾病如高血压㊁冠心病及心肌炎等都会引起心脏肥大㊂心脏肥大早期仍可维持正常的心脏功能,但持续的心脏肥大会导致心力衰竭㊁心律失常及猝死等严重后果[3]㊂西洋参(Panax quinquefolius)为五加科人参属植物,主产于加拿大安大略和魁北克㊁美国威斯康辛等地,已在我国吉林和山东等地引种栽培[4]㊂西洋参味甘㊁微苦,性凉,入心㊁肺㊁肾经,具有补气养阴㊁清热生津的功效,用于治疗气虚阴亏㊁虚热烦倦㊁咳喘痰血㊁内热消渴㊁口燥咽干等症[5]㊂西洋参主要含有人参皂苷㊁多糖㊁挥发油㊁有机酸㊁甾醇㊁氨基酸及蛋白质类等成分[6],具有保护心脏[7]㊁抗氧化[8]㊁抗肿瘤[9]㊁降血糖[10]及增强免疫力[11]等作用㊂研究表明,西洋参对于冠状动脉结扎㊁异丙肾上腺素及血管紧张素Ⅱ等多种因素诱导的大鼠心脏肥大㊁心力衰竭模型具有良好的保护作用[12-14],但西洋参抗心脏肥大的作用机制尚未明确㊂因此,本研究通过网络药理学方法分析西洋参抗心脏肥大的作用靶点及机制,进一步在大鼠H9c2心肌细胞肥大模型上对作用靶点进行验证,以期为西洋参用于心血管疾病的防治提供参考㊂1资料与方法1.1西洋参活性成分及药物靶点的筛选利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http:// )收集西洋参的主要化学成分,以 西洋参 为关键词,后对其包含的所有化合物根据吸收㊁分布㊁代谢和排泄(ADME)相关参数进行潜在活性成分筛选,参数设置为:口服生物利用度(OB)ȡ30%,类药性(DL)ȡ0.18㊂运用中医药百科全书(ETCM,http:// /ETCM/)和查找已发表的文献进一步补充西洋参的活性成分㊂将成分输入有机小分子生物活性数据库(PubChem,),根据类药五原则(Lipinski原则,氢键供体数ɤ5个㊁氢键受体数ɤ10个㊁相对分子量ɤ500㊁脂水分配系数ɤ5㊁化合物中可旋转键的数量不超过10个),选择符合2项规则以上的成分,获取Canonical SMILES号,并通过基于多靶点定量构效关系的靶点预测平台数据库(Targetnet,/)和小分子药物靶点预测在线平台(Swiss Target Prediction,http:// www.swisstargetprediction.ch/)以显著性水平(Prob)>0为原则筛选西洋参的作用靶点;利用蛋白质数据库Uniprot(https:///)查询每个蛋白靶点对应的基因名,确定物种来源为 Human 并建立数据库,用于后续分析㊂1.2心脏肥大疾病靶点的筛选通过人类孟德尔遗传数据库(OMIM,)㊁药物靶标数据库(TTD,.sg/group/cjttd)㊁基因名片数据库(GeneCards,/),以 cardiomyocyte hypertrophy 为关键词,收集已知验证的与心脏肥大相关的人类基因,删去重复项,取并集,获得心脏肥大相关靶点㊂1.3西洋参抗心脏肥大潜在靶点的获取将西洋参成分靶点与心脏肥大疾病靶点导入Venny2.1.0(b.csic.es/tools/venny/index.html),提取同时出现在药物靶点与疾病靶点中的共同靶点,即为西洋参治疗心脏肥大的潜在作用靶点㊂1.4西洋参抗心脏肥大潜在靶点相互作用网络的构建打开STRING数据库(https:///),进入页面首先选择 multiple proteins 条目,输入获得的交集靶点名称,物种限定为 Homo sapiens ,最低相互作用阈值设为中等 Medium confidence(0.400) ,隐藏游离节点,其余参数保持默认值进行检索,下载蛋白-蛋白相互作用(PPI)结果(tsv格式文件),而后将其导入Cytoscape3.8.0软件进行可视化分析,通常根据度中心性Degree值,计算其平均数,以大于平均数的靶点在网络中为重要靶点,大于平均数2倍的为关键靶点,获得西洋参治疗心脏肥大的PPI网络图㊂1.5生物信息学基因本体(GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析使用注释㊁可视化和综合发现数据库(DAVID,https://david. /home.jsp)对上述筛选得到的重要靶点进行生物功能及分子信号通路的富集分析㊂其中,从生物过程(biological process,BP)㊁细胞组分(cell component, CC)和分子功能(molecular function,MF)3个水平进行GO富集分析,选择BP校正P值最小的前15个条目进行可视化;并使用基迪奥生物信息云平台(Omicshare在线平台,https:///)将KEGG富集程度较高的前20条通路绘制成气泡图㊂1.6体外实验验证1.6.1细胞株㊁药物和试剂大鼠H9c2细胞株购自协和医科大学细胞实验中心;异丙肾上腺素(中国食品药品检定研究院,批号:Z21N10X103254,纯度ȡ99.2%); DMEM高糖培养基(美国Gibco公司,批号:8121192);胎牛血清(美国Gemini公司,批号:A15H74K);磷酸盐缓冲液(PBS)(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号: GP21010070226);0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司,批号:2120732);噻唑蓝(MTT)试剂(广州赛国生物科技有限公司,批号:EZ3455C328);DEPC处理水(上海生工生物工程技术服务有限公司,批号: G430KA5395);RNA提取试剂盒㊁反转录试剂及实时荧光定量PCR(qPCR)试剂[Takara宝生物工程(大连)有限公司,批号分别为:AJG1902A㊁AL12354A㊁AK81975A]㊂1.6.2仪器MI52-N倒置显微镜(广州明美光电技术有限公司),Spectra Max Plus384全波长酶标仪(美国Molecular Devices公司),TGL20M台式高速冷冻离心机(盐城凯特实验仪器有限公司),CFX96TM Real-Time PCR仪(美国Bio-rad公司)㊂1.6.3细胞培养与细胞活力检测将H9c2心肌细胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养㊂将生长状态良好的细胞以每孔5ˑ103个接种于96孔板中,培养24h后加入不同浓度的西洋参,根据加入西洋参浓度的不同分为12.5μg/mL西洋参组㊁25.0μg/mL西洋参组㊁50.0μg/mL西洋参组㊁100.0μg/mL 西洋参组㊁200.0μg/mL西洋参组,将加入含0.1%二甲基亚砜(DMSO)的培养基作为正常组㊂药物作用24h 后进行MTT法检测,在酶标仪492nm波长处检测各孔吸光度(OD),计算细胞增殖抑制率(IC%)=(正常组OD-西洋参各浓度组OD)/正常组ODˑ100%,观察西洋参对心肌细胞活力的影响㊂1.6.4心肌细胞表面积检测采用异丙肾上腺素10μmol/L复制H9c2心肌细胞肥大模型,以心肌细胞表面积增大和心脏肥大相关胚胎基因心房钠尿肽(ANP)㊁β-肌球蛋白重链(β-MHC)㊁α-骨骼肌肌动蛋白(α-SKA)表达上调表明模型制作成功㊂将5ˑ103个处于对数生长期的心肌细胞接种至35mm培养皿中,接种24h后将细胞分为正常组(加入与其他各组等体积的溶媒0.2%DMSO)㊁模型组(加入异丙肾上腺素10μmol/L)㊁西洋参干预组(预先1h加入西洋参100.0μg/mL,而后加入异丙肾上腺素10μmol/L)㊁西洋参单独组(加入西洋参100.0μg/mL)㊂药物作用24h后,采用明美显微数码测量分析系统拍照并运用ImageJ 软件测量心肌细胞面积㊂1.6.5逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)将1ˑ105个心肌细胞接种于35mm的培养皿中,接种24h后,实验分组和加药同1.6.4㊂药物作用24h后,按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA并定量㊂取1μg RNA逆转录为cDNA后进行扩增反应,扩增条件:95ħ预变性30s,95ħ变性10s,60ħ退火30s,72ħ延伸30s,共40个循环㊂以18S rRNA为内参基因,采用10倍稀释制作内参基因和目的基因的标准曲线,稀释范围为10-5~1,根据双标准曲线法计算心脏肥大相关胚胎基因ANP㊁β-MHC㊁α-SKA及关键靶点基因血管内皮生长因子A(VEGFA)㊁丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)㊁表皮生长因子受体(EGFR)㊁肿瘤坏死因子(TNF)㊁丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的相对表达水平㊂引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列见表1㊂表1qRT-PCR引物序列基因名正向引物反向引物产物长度(bp) ANP5'-TCTCCATCACCAAGGGCTTC-3'5'-TGACCTCATCTTCTACCGGC-3'159β-MHC5'-GAGTTCGGGCGAGTCAAAGA-3'5'-AGCCTCTCGGTCATCTCCTT-3'215α-SKA5'-GAAGGACCTGTACGCCAACA-3'5'-TCCACACTGAGTACTTGCGC-3'152 VEGFA5'-GACCCTGGCTTTACTGCTGT-3'5'-CAGGGCTTCATCATTGCAGC-3'244 AKT15'-GAGAACCGTGTCCTGCAGAA-3'5'-ACACAATCTCCGCACCGTAG-3'184 EGFR5'-TTCTTTCACCCGCACTCCTC-3'5'-TGTTGCTTTGTTCTGCCACG-3'162 TNF5'-ACGTCGTAGCAAACCACCAA-3'5'-GCAGCCTTGTCCCTTGAAGA-3'164 MAPK15'-TGCTTTCTCTCCCGCACAAA-3'5'-GTCGTCCAGCTCCATGTCAA-3'221 18S rRNA5'-GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA-3'5'-TGAGCCAGTTCAGTGTAGCG-3'2131.7统计学处理采用GraphPad Prism8.0软件进行数据分析㊂符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1西洋参潜在活性化合物及其作用靶点通过TCMSP平台及ETCM共检索到西洋参活性成分45个,去除无明确对应靶点的化学成分共获得有效活性成分42个(见表2),去除重复项得到西洋参作用靶点共558个㊂表2西洋参活性成分信息序号成分名称OB(%)DL分子量脂水分配系数氢键供体数(个)氢键受体数(个)可旋转键数(个)X1PQ-236.740.19857.10 4.92138 X2beta-sitosterol36.910.75414.709.3116 X3ginsenoside rh236.320.56622.90 5.6687 X4papaverine64.040.38339.40 3.9056 X5daturilin50.370.77X6(S)-1-methyl-4-(6-methylhepta-1,5-dien-2-Yl) cyclohex-1-ene 204.35 5.2004X7daucosterol_qt36.910.75X8linoleic acid280.40 6.81214 X9caprylic acid144.21 3.0126 X10caproic acid116.16 1.9124 X11enanthic acid130.18 2.5125 X12nonanoic acid158.24 3.5127 X13pulegone152.23 2.8010X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 X35 X36 X37 X38 X39 X40 X41 X42isoeugenoloctanolcalareneginsenoyne Epanaxydollinarionoside A1-phenylhexanesitoglusidepentadecanoic acidGy-XⅦoleanolic aciddencichinetryptophanginsenoside Rh1hexanoic acidheptanoic acid8-methyldecanoic acidtetradecanoic acidstigmastenolstigmast-5-en-3-olhexadecanoic acidoctadecanoic acidoctadecenoic acid9,12,15-octadecatrienalmargaric acidpalmitic acidnonadecanoic acidmethyl oleatmethyl palmitate164.20130.23204.35258.35260.40374.50162.27576.80242.40493.60456.70176.13204.22638.90116.16130.18186.29228.37414.70414.70256.42284.50282.50262.40270.50256.42298.50296.50270.502.63.04.75.04.50.25.57.75.83.67.5-4.1-1.14.31.92.54.45.310.79.36.47.48.15.86.96.48.07.67.9111541224371111111111112122762436392222112221222222699659137143745812661416151315141716152.2西洋参治疗心脏肥大的潜在作用靶点经过数据库检索,删除重复项靶点获得心脏肥大疾病靶点809个,通过Venny2.1.0软件获取西洋参和心脏肥大的作用靶点交集,其中共同作用靶点41个,约占集合总数的3.1%,获得西洋参和心脏肥大的Venny图,详见图1㊂图1西洋参活性成分靶点与心脏肥大相关靶点Venny图2.3西洋参抗心脏肥大潜在靶点相互作用网络的构建将获得的交集靶点输入STRING数据库构建PPI 网络图,并借助Cytoscape3.8.0进行可视化,删除游离项(见图2)㊂图中节点为靶点,边为靶点之间的联系;节点的颜色及大小反映节点的Degree值,颜色越深㊁节点越大则其Degree值越大,边的粗细反映连接程度,边越粗,连接越紧密㊂在西洋参抗心脏肥大作用PPI网络中,有21个靶点的Degree值大于平均值,其中VEGFA(28)㊁AKT1(26)㊁EGFR(25)㊁TNF(25)㊁MAPK1(24)是Degree值大于平均数2倍的靶点,为关键靶点,可能在西洋参治疗心脏肥大的过程中发挥重要作用㊂图2西洋参治疗心脏肥大潜在靶点的PPI网络图2.4GO功能富集分析与KEGG通路富集分析利用DAVID在线平台对PPI网络中大于平均Degree值的21个关键靶点进行富集分析㊂GO分析共获得247个条目,其中BP分类主要包括一氧化氮合成过程的正调控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)㊁脂多糖介导的信号通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)㊁肽基-丝氨酸磷酸化的正调控(positive regulation of peptidyl-serine phosphorylation)等193个条目;CC分类主要包括细胞膜质(plasma membrane)㊁细胞表面(cell surface)㊁蛋白质复合物(protein complex)等26个条目;MF分类主要包括酶结合(enzyme binding)㊁一氧化氮合酶调节活性(nitric-oxide synthase regulator activity)㊁支架蛋白结合(scaffold protein binding)等28个条目㊂根据错误发现率(FDR值)由小到大排序,筛选出BP结果中前15条绘图(见图3)㊂KEGG富集分析共获得89条信号通路,80条信号通路的阈值P<0.05,选取前20条信号通路,借助Omicshare平台绘制西洋参作用于心脏肥大的可视化气泡图(见图4)㊂西洋参抗心脏肥大主要与癌症蛋白多糖(proteoglycans in cancer)㊁血管内皮生长因子信号通路(VEGF signaling pathway)㊁缺氧诱导因子-1信号通路(HIF-1signaling pathway)等有关㊂上述结果提示西洋参主要活性成分的作用靶点涉及的生物学过程的多样化,并分布于不同的代谢通路㊂图3西洋参治疗心脏肥大GO 生物过程富集分析图4西洋参治疗心脏肥大的KEGG富集分析2.5细胞实验验证2.5.1不同浓度西洋参对H9c2心肌细胞活力的影响12.5μg/mL西洋参组㊁25.0μg/mL西洋参组㊁50.0μg/mL西洋参组㊁100.0μg/mL西洋参组心肌细胞抑制率与正常组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),而200μg/mL西洋参组与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)㊂故本研究选用100.0μg/mL的西洋参用于评价对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的影响㊂详见表3㊂表3不同浓度西洋参对H9c2心肌细胞活力的影响(xʃs)组别样本量抑制率(%)正常组50.000ʃ1.348 12.5μg/mL西洋参组50.811ʃ1.321 25.0μg/mL西洋参组50.125ʃ2.025 50.0μg/mL西洋参组50.603ʃ1.274 100.0μg/mL西洋参组50.295ʃ1.590 200.0μg/mL西洋参组510.108ʃ3.155①与正常组比较,①P<0.05㊂2.5.2西洋参对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的影响与正常组比较,模型组心肌细胞表面积增加,ANP㊁β-MHC㊁α-SKA mRNA表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂与模型组比较,西洋参干预组心肌细胞表面积降低,ANP㊁β-MHC㊁α-SKA mRNA表达均下调,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂与正常组比较,西洋参单独组心肌细胞表面积及ANP㊁β-MHC㊁α-SKA mRNA表达,差异均无统计学意义(P>0.05)㊂详见图5㊁图6㊂与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05㊂图5西洋参对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞表面积的影响(n=6)与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05㊂图6西洋参对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大基因表达的影响(A为ANP mRNA相对表达量,B为β-MHC mRNA相对表达量,C为α-SKA mRNA相对表达量,n=6)2.5.3西洋参对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞VEGFA㊁AKT1㊁EGFR㊁TNF㊁MAPK1基因表达的影响网络药理学富集分析筛选显示VEGFA㊁AKT1㊁EGFR㊁TNF㊁MAPK1可能是西洋参干预心脏肥大的关键靶点㊂qRT-PCR验证实验结果表明,与正常组比较,模型组心肌细胞VEGFA㊁AKT1㊁EGFR㊁TNF㊁MAPK1mRNA表达上调,差异均有统计学意义(P< 0.05),与模型组比较,西洋参干预组心肌细胞VEGFA㊁AKT1㊁EGFR㊁TNF㊁MAPK1mRNA表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂详见图7㊁图8㊂与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05㊂图7西洋参对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞VEGFA㊁AKT1㊁EGFR基因表达的影响(A为VEGFA mRNA相对表达量,B为AKT1mRNA相对表达量,C为EGFR mRNA相对表达量,n=5)与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05㊂图8西洋参对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞TNF、MAPK1基因表达的影响(A为TNF mRNA相对表达量,B为MAPK1mRNA相对表达量,n=5)3讨论心脏肥大是心肌组织为适应多种病理刺激如血流动力学超负荷㊁循环激素增加等因素而产生的适应性反应,是多种心血管疾病如高血压㊁冠心病等的常见并发症,其病理改变表现为心肌细胞体积增大㊁心脏胚胎基因重编程和一些心脏发育期的转录因子重新激活㊁心脏收缩和舒张功能降低㊁胶原纤维沉积及心脏重构等[3,15]㊂西洋参以其多成分㊁多靶点㊁多途径的优势在心脏肥大等心血管疾病的防治研究和应用较为广泛㊂西洋参及其活性成分具有抑制心肌细胞凋亡㊁改善血液循环㊁抑制氧化应激和炎症反应等多方面的作用[16]㊂研究表明,西洋参提取物可通过阻断p115Rho 鸟嘌呤核苷酸交换因子-Ras同源基因家族成员A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(p115RhoGEF-RhoA/ ROCK)依赖的丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)激活而抑制瘦素诱导心肌细胞肥大[17],可通过阻断蛋白激酶A(PKA)激活和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化而减轻异丙肾上腺素诱导的心脏肥大[13],还可通过调节脂肪酸和葡萄糖的氧化缓解血管紧张素Ⅱ诱导的心脏肥大[14]㊂本研究利用网络药理学的方法从TCMSP和ETCM数据库及相关文献中共筛选出42种西洋参活性成分,再与OMIM㊁TTD以及GeneCards数据库筛选出的心脏肥大相关靶点进行比对,获得西洋参抗心脏肥大靶点41个㊂进一步PPI网络分析表明, VEGFA㊁AKT1㊁EGFR㊁TNF和MAPK1可能是西洋参抗心脏肥大的关键靶点㊂VEGFA是血管生成的关键介质,其与心脏的关系是双向的,一方面,受炎症㊁机械应力㊁内皮素-1和转化生长因子-β等刺激因素的影响,心肌细胞分泌和释放VEGFA;另一方面,VEGFA 诱导心肌细胞激活,促进心肌组织的血管生成,增强心肌的收缩和存活[18]㊂研究表明,在异丙肾上腺素或主动脉弓缩窄术诱导的小鼠心脏肥大模型中,VEGFA表达上调[19-20]㊂AKT1为丝/苏氨酸蛋白激酶,参与调节心脏生长㊁增殖㊁迁移和代谢,与心脏肥大密切相关[21]㊂研究表明,心脏中长期AKT1的激活可降低心肌线粒体的氧化能力而导致心脏肥大[22]㊂AKT1在血管紧张素Ⅱ灌注诱导的心脏肥大模型和高血压心肌纤维化模型中均表达上调[23-24]㊂EGFR是受体型蛋白酪氨酸激酶,广泛表达于心脏和血管组织中,EGFR通路参与细胞增殖㊁分化和周期调控等生物过程,与心血管疾病的发生发展密切相关㊂研究表明,EGFR激活可促进内脂素㊁血管紧张Ⅱ等诱导的心肌肥大[25-26],抑制EGFR活性和EGFR依赖的细胞内信号通路可缓解心脏肥大[27-28]㊂TNF-α介导的核转录因子-κB(NF-κB)激活参与了心脏肥大,人参皂苷Rg1抑制TNF-α/NF-κB 信号通路可缓解主动脉弓缩窄术诱导的大鼠心脏肥大[29]㊂MAPK1参与多种炎性因子的信号转导,调控细胞增殖㊁分化和凋亡㊂研究发现,在主动脉弓缩窄术或异丙肾上腺素诱导小鼠心脏肥大时,心肌细胞外信号调节激酶2(ERK2)蛋白磷酸化水平增加[30]㊂为进一步探讨西洋参抗心脏肥大的作用机制,本研究对西洋参抗心脏肥大关键靶点进行GO和KEGG 富集分析㊂GO功能富集分析显示西洋参抗心脏肥大的作用机制涉及CC的细胞膜质㊁细胞表面和蛋白质复合物,BP主要与一氧化氮合成过程的正调控㊁脂多糖介导的信号通路以及肽基-丝氨酸磷酸化的正调控相关,MF主要与酶结合㊁一氧化氮合酶调节活性以及支架蛋白结合相关㊂KEGG通路富集分析表明,西洋参抗心脏肥大主要与癌症蛋白多糖㊁血管内皮生长因子信号通路㊁缺氧诱导因子-1信号通路等有关㊂在网络药理学分析的基础上,本研究选择大鼠H9c2心肌细胞为研究对象,观察了西洋参抗心肌细胞肥大作用,并对关键靶点VEGFA㊁AKT1㊁EGFR㊁TNF 和MAPK1的基因表达进行了验证㊂异丙肾上腺素属于儿茶酚胺类物质,可兴奋心肌细胞的β受体,诱导心肌细胞肥大㊁心脏胚胎基因重新激活表达[15]㊂本研究结果显示,西洋参100.0μg/mL可抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞面积增加及心脏胚胎基因ANP㊁β-MHC与α-SKA mRNA的表达上调㊂进一步的qRT-PCR 实验表明,西洋参100.0μg/mL抑制异丙肾上腺素诱导的VEGFA㊁AKT1㊁EGFR㊁TNF㊁MAPK1mRNA表达上调,这与网络药理学分析结果相一致㊂本研究通过网络药理学对西洋参抗心脏肥大的作用靶点及通路进行了分析,而后通过体外实验验证了西洋参抗心脏肥大作用,并对其抗心脏肥大的关键靶点进行了验证和探讨,为深入研究西洋参防治心血管疾病的药理机制和临床应用提供参考㊂参考文献:[1]ROTH G A,MENSAH G A,JOHNSON C O,et al.Global burden ofcardiovascular diseases and risk factors,1990-2019:update fromthe GBD2019study[J].Journal of the American College ofCardiology,2020,76(25):2982-3021.[2]中国心血管健康与疾病报告2020概要[J].中国循环杂志,2021,36(6):521-545.[3]OLDFIELD C J,DUHAMEL T A,DHALLA N S.Mechanisms for thetransition from physiological to pathological cardiac hypertrophy[J].Canadian Journal of Physiology and Pharmacology,2020,98(2):74-84.[4]KARMAZYN M,GAN X T.Treatment of the cardiac hypertrophicresponse and heart failure with ginseng,ginsenosides,andginseng-related products[J].Canadian Journal of Physiology andPharmacology,2017,95(10):1170-1176.[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社,2020:136-137.[6]李乐,余慧,付书正,等.西洋参果化学成分及其生物活性研究进展[J].中南药学,2021,19(5):931-936.[7]GAN X 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![一种用于治疗心脑血管疾病的山楂叶总黄酮粉针剂及其制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/05c69617c8d376eeafaa31d8.png)
