蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验报告一、实验目的1、掌握双缩脲试剂法测定蛋白质含量的原理和方法。
2、学会使用分光光度计进行比色测定。
3、熟悉标准曲线的绘制和应用，能够通过标准曲线计算样品中蛋白质的含量。
二、实验原理双缩脲试剂是由硫酸铜和酒石酸钾钠在碱性条件下生成的淡蓝色的络合物。
当含有两个或两个以上肽键的化合物与双缩脲试剂反应时，会形成紫色的络合物。
蛋白质分子中含有多个肽键，因此在碱性条件下能与双缩脲试剂反应产生紫色复合物。
颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，在一定范围内符合朗伯比尔定律，可通过比色法测定其吸光度，进而计算出蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1、材料（1）标准蛋白质溶液：称取结晶牛血清白蛋白（BSA） 10mg，用蒸馏水溶解并定容至 100ml，配制成100μg/ml 的标准蛋白质溶液。
（2）待测蛋白质溶液：＿____（3）双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O） 15g 和酒石酸钾钠60g，分别用蒸馏水溶解，然后混合，加入 300ml 10%氢氧化钠溶液，并用蒸馏水定容至 1000ml，摇匀，避光保存。
2、仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）移液器（4）容量瓶（100ml、50ml）（5）试管及试管架四、实验步骤1、标准曲线的绘制（1）取 6 支干净的试管，按下表加入试剂：｜管号｜ 1 ｜ 2 ｜ 3 ｜ 4 ｜ 5 ｜ 6 ｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜标准蛋白质溶液（ml）｜ 0 ｜ 02 ｜ 04 ｜ 06 ｜ 08 ｜ 10 ｜｜蒸馏水（ml）｜ 10 ｜ 08 ｜ 06 ｜ 04 ｜ 02 ｜ 0 ｜｜蛋白质含量（μg）｜ 0 ｜ 20 ｜ 40 ｜ 60 ｜ 80 ｜ 100 ｜（2）向各管中加入 4ml 双缩脲试剂，摇匀，在室温（20-25℃）下放置 30 分钟。
（3）以第 1 管为空白对照，在 540nm 波长处用分光光度计测定各管的吸光度（A）值。
（4）以蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度（A）值为纵坐标，绘制标准曲线。
实验三双缩脲法测定蛋白质含量目的1．掌握双缩脲法测定蛋白质的具体操作和原理；2．了解蛋白质测定在生命科学中的应用。
原理双缩脲反应是指双缩脲在硷性溶液中能与Cu2+络合生成紫红色物质。
双缩脲可由脲缩合而成。
蛋白质分子的肽链结构在硷性中也能与Cu2+络合生成紫红色络合物，因其反应机制相似，就把蛋白质的这一反应称为蛋白质的双缩脲反应。
由于参与反应的是蛋白质的肽链结构，与组成蛋白质分于肽链氨基酸残基的侧链功能基关系较小。
因此，不同蛋白质的双缩脲反应基本相似。
利用双缩脲反应生成的有色物质作蛋白质的比色测定受蛋白质种类的影响较小。
这是本法的优点之一。
此外试剂和操作的简单也是其优点。
缺点是灵敏度较低，能测出的蛋白质浓度约须在0.5mg／ml。
本实验用双缩脲法测定血清的总蛋白质浓度。
如结合盐析法(饱和硫酸钠)分离白蛋白和球蛋白还可用于血清白蛋白和球蛋白浓度及其比值(A／G)的测定。
器材1．试管及试智架2．0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器)3．1ml、2ml、5ml刻度吸管4．721型分光光度计试剂1．0.9％NaCl2．双缩脲试剂称取CuSO45H2O结晶(AR级试剂)1.5g,酒石酸钾钠(AR级试剂)6.0g溶于500ml水中，添加10％NaOH 300ml及KI1.0g．混匀后加水稀释至1000ml。
本试剂可长期保存。
3．牛血清白蛋白标准液此溶液可用于替代标准血清。
称取试剂级冻干牛血清白蛋白300mg置lOOml容量瓶中，用0.9％NaCl溶解后稀释至刻度，避免振摇起泡，置4℃冰箱保存。
此标准液浓度为300mg／m1。
4．被检血清样本操怍1. 取试管1支，以0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器)吸取被检血清0.200ml(吸管外壁须用滤纸片拭净)。
慢慢放入试管底部。
最后一点液体应吹出，靠落在试管壁上。
2．加入0.9%NaCl 3.80ml,充分混匀但不要振摇起泡。
3．另取试管二支，标上号码，其一用吸管加入操作2所准备的血清样本稀释液1.00ml 另一管加入牛血清白蛋白标准液1.00ml。
实验一双缩脲法测定血清蛋白质含量【实验名称】:双缩脲法测定血清蛋白质含量09救援一班第三大组李岚宇 2009222336室温:20? (一)实验目的: 1.掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。
2.学习掌握分光光度计的使用。
3.掌握标准曲线的制作。
4.学习分光光度法测定的原理和方法。
(二)实验原理:血清中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。
此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲(HN-OC-NH-CO-NH)22在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。
这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。
(三)实验材料与仪器:1.仪器和材料: 分光光度计、7支试管、1毫升刻度吸管3支、移液器、坐标纸。
2.试剂:6mol/L的NaOH、双缩脲试剂、9g/L的NaCl溶液、蛋白质标准液(10g/L)、待测血清样本。
(四)实验步骤和结论:1.取7支试管，编号，按照图1操作并记录。
标准管试剂管号空白管测定管 1 2 3 4 5 蛋白质标准液 - 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 - 待测血清样本 - - - - - - 1.0 氯化钠溶液 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 - - 双锁脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 λ光吸收值 0 0.085 0.181 0.261 0.354 0.438 0.317 各管浓度 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 1.4表 12.在坐标纸上以各管蛋白质含量为横坐标，光吸收值(两管平均值)为纵坐标，绘制标准曲线。
表23、由标准曲线查出待测的血清样本的蛋白质浓度，由表1得出测定管的蛋白质的λ光吸收值为0.317，由表2得出测定管的蛋白质的浓度为1.4g/L4、按照光吸收法计算公式计算，从标准管中选一管与测定管光吸收值接近者，按公式CA测标C,测AA标测计算待测血清样本的蛋白质浓度，从上可选 = 0.317 ACC标标测=0.354 ,=1.6 g/L; 则得到:=1.432 g/L【注意事项】 : 1.本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须清洁，整齐、干燥。
