多肽的电泳分离

一、实验目的1. 学习活性多肽的提取方法。

2. 了解活性多肽的生物学活性及其作用。

3. 掌握活性多肽的鉴定与分析技术。

二、实验原理活性多肽是一类具有生物活性的小分子肽，由2个或2个以上氨基酸通过肽键相互连接而成。

它们在生物体内起着重要的生理调节作用，如免疫调节、细胞信号传导、生长调节等。

本实验通过提取活性多肽，对其生物学活性进行分析，探讨其在医学、食品、生物工程等领域的应用前景。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜淡水鱼、生物酶、硫酸铵、盐酸、丙酮等。

2. 实验仪器：离心机、紫外可见分光光度计、pH计、电热恒温水浴锅、分析天平等。

四、实验方法1. 活性多肽的提取（1）取新鲜淡水鱼，去内脏、去皮，切成小块。

（2）将鱼块放入酶解液中，在50℃、pH 7.0条件下酶解4小时。

（3）酶解完成后，将混合液离心（3000 r/min，20 min）取上清液。

（4）用硫酸铵对上清液进行盐析，沉淀后用丙酮洗涤，去除杂质。

（5）将沉淀物溶于适量水中，调节pH至7.0，离心（3000 r/min，20 min）取上清液，即为活性多肽溶液。

2. 活性多肽的鉴定与分析（1）紫外可见分光光度法测定活性多肽浓度。

（2）采用SDS-PAGE电泳法对活性多肽进行分离鉴定。

（3）通过体外实验检测活性多肽的生物学活性，如免疫调节、细胞信号传导、生长调节等。

五、实验结果与分析1. 活性多肽的提取通过酶解、盐析、丙酮洗涤等步骤，成功提取出活性多肽溶液。

2. 活性多肽的鉴定与分析（1）紫外可见分光光度法测定活性多肽浓度为0.5 mg/mL。

（2）SDS-PAGE电泳结果显示，活性多肽分子量分布在500-3000 Da之间。

（3）体外实验结果表明，活性多肽具有免疫调节、细胞信号传导、生长调节等生物学活性。

六、实验结论1. 成功提取出淡水鱼活性多肽，并通过紫外可见分光光度法、SDS-PAGE电泳法对其进行了鉴定。

2. 活性多肽具有免疫调节、细胞信号传导、生长调节等生物学活性，为活性多肽在医学、食品、生物工程等领域的应用提供了理论依据。

SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是，分离胶；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。

在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。

由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。

当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关
(Gel concentration selection and separation material molecular weight)
二、电泳的原理
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（native－PAGE）

生物大分子在聚丙烯酰胺凝胶中泳动时，有电荷效应与分 子筛效应。不同的核酸或蛋白质，它们的分子量大小及构 型不同，所带净电荷的多少不同。电泳时的泳动率就不同 ，从而分出不同的区带。在电泳分离后能保持蛋白质和酶 等生物大分子的生物活性。
(Application of electrophoresis)
琼脂糖凝胶电泳由于其所分级分离的生物大分 子比聚丙烯酰胺凝胶电泳大，因此适合于分离核酸 （DNA和RNA）和蛋白。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
(Polyacrylamide gel electrophorsis, PAGE)
一、聚丙烯酰胺凝胶的特点
而在电泳中表现出不同的迁移率，这就是电荷效应。
EB显带（EB banding）
电泳后 EB染色
EB加入凝 胶中电泳
经EB染色后，电泳结果在波长为 254 nm的紫外灯下观察。
[注意] 在分子量相当的情况下，DNA的 电泳迁移率依次为： 超螺旋环状DNA>线状DNA>缺口环状 DNA
三、电泳的应用
(Poly propylene ethylene amines gel characteristics)
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交
联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N
，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵( 简称AP)或核黄素(VB2)的作用下聚合交联成三维网 状结构的凝胶。该凝胶具有刚性的凝胶孔，凝胶孔 径的大小主要决定于丙烯酰胺的浓度。

高效液相色谱在多肽分离分析中的应用李文龙;张慧;汤琦;高利龙;丛海林;于冰【摘要】多肽的高生物活性和低毒副作用使其成为近来国内外生命科学研究的热点,因此多肽的分离与分析也愈发的关键.高效液相色谱(HPLC)以其极高的分离效率和良好的选择性已经成为实验室和工业分离分析生物大分子最常用和有效的方法.本文主要介绍了HPLC以及一些新型色谱在多肽分析分离中的应用.%Polypeptide has become the focus of life science research at home and abroad because of its high bioactivity and low toxicity. High performance liquid chromatography(HPLC)with high separation efficiency and good selectivity has become the commonly used and the most effective method in laboratory and industrial separation and analysis of biological macromolecules. T his review mainly summarized the ap-plication of HPLC and some new chromatography techniques in the separation and analysis of polypep-tides.【期刊名称】《分析仪器》【年(卷),期】2018(000)001【总页数】5页(P63-67)【关键词】高效液相色谱;多肽;分离;分析【作者】李文龙;张慧;汤琦;高利龙;丛海林;于冰【作者单位】青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;纤维新材料与现代纺织国家重点实验室培育基地,青岛大学材料科学与工程学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;纤维新材料与现代纺织国家重点实验室培育基地,青岛大学材料科学与工程学院,青岛266071【正文语种】中文随着生物化学技术的不断发展，多肽因其独特而又高效的吸收机制和非常强的生物活性，而成为生化专家们所关注和研究的热门材料。

常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。
(2) 非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同 的pH的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状 电泳，等电聚焦电泳等。
界面电泳 ：在没有惰性支持物的液体接界面上 进行的电泳。
缺点：对流较严重，组分不能完全分离，检测困难ห้องสมุดไป่ตู้
区带电泳： 是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶 物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动 的电泳方法。 避免对流的干扰。
平卧式电泳槽装置示意图
三、操作步骤
1. 准备
醋酸纤维素薄膜的预处理：将薄膜小心放入盛有 缓冲液的培养皿内，使其漂浮在液面；用镊子轻压， 使其全部浸入缓冲液内。待膜完全浸透（约半小时） 后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓 冲液，同时分辨出光滑面和粗糙面。 标记：在粗糙面上用铅笔距薄膜条一端 1.5cm 处 划线即为点样线并作好标记，同时标上学号和正负 极。
( Micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC）
胶束电动色谱：是以胶束为假固定相的一种电动色 谱法，是电泳技术与色谱技术的结合，因在毛细管 中进行，又称为胶束电动毛细管色谱。
1. 胶束的形成和特性
表面活性剂：由亲水基和疏水基组成。疏水部分为 直链或支链烷烃；亲水部分由阳离子、阴离子、两 性离子基团组成。
迷你垂直型电泳槽
DNA序列分析电泳槽
中型双垂直电泳槽
实验室常见的电泳装置
（ 核水 酸平 电电 泳泳 ） （ 蛋 白垂 质直 电 电泳 泳 ）
血清醋酸纤维素薄膜电泳
第二节 常用电泳技术和电泳方法
二、电泳方法简介 （一）纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方 法。是最早使用的区带电泳。

Ana lys ing Peptides of L ow W e ights M olecular w ith SD S-polyacrylam ide Gel Electrophores is
Yang L ianp ing Kong X ianp ing Y i Xueru i
(Fo rle Ho sp ital Guangzhou 510602)
[ 18 ]Dw ived i P P, Gibb s M D , Saw l D J et al. A pp l M icrob io l B io techno l, 1996, 45: 86～ 93 [ 19 ]Begu in P ,M illet J , A ubert J P. FEM S M icrob io l L ett, 1992, 100: 523～ 528. [ 20 ] R ao M , W eb ster D A. B io techno l L ett, 1995, 17: 589～ 592. [ 21 ]M o rean A , Gu tierrz S, V elasco J et al. B iochem J , 1994, 302: 291～ 295. [ 22 ] R ao M , Khad ikar S, Bam d ivadekar K R et al. B iochem J , 1996, 316: 771～ 775.
SD S 电泳技术首先在 1976 年由 Shap iro 建 立, 1969 年 由 W eber 和 O sbom 进 一 步 完 善[ 1 ]。它是生化工作者常用的分析技术之一。但 对一些小分子多肽的电泳分析时, 电泳、固定、 染色、脱色过程中极易扩散丢失, 因此常无着色 带显示, 亦有报道用尿素2SD S2PA GE 系统来 测定小肽分子量[2]。 经试验, 结果也不理想, 即 使采用银染色法小于 8kD a 的标准品也无着色 带显示。作者经实践, 提高凝胶浓度和交联度将 分离胶制成 20% T , 6% C , 和 15% T , 3% C 的梯 度胶, 2kD 小分子肽均可见着色带, 同时以单组 分标准分子量作参照, 其结果增加了待检物结 果的可信性。其方法详细报导如下, 以利同行参 考应用。

电泳的基本原理电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。

许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。

电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

电泳过程必须在一种支持介质中进行。

Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。

于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。

最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。

在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。

这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。

但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。

凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。

最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。

蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。

电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。

电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。

电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。

垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。

电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm 14 cm，厚度为1mm～2 mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。

制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。

制胶工具
预制胶
SDS-PAGE
根据样品分离目的不同，主要有 两 种处理方法:还原SDS处理、非还 原SDS处理。
1 2
还原SDS处理: 在上样buffer中加入β-巯基乙醇 （ β-巯基乙 醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂 ） ，蛋白质构象被解离 ，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子。
非还原SDS处理:
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分 离重复性好；
(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；
3
CE
毛细管电泳
染色
在蛋白质染色方法中，目前以考马斯亮蓝 染色最为常用，考马斯亮蓝灵敏度每条带 0.1-1ug；还有灵敏度较高的银染。
处理方式
WB
蛋白质印迹法（免疫印迹试验） 通过特异 性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白质分子样 品进行着色。
SDS-PAGE
SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用 聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接 关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关; 制胶缓冲液: 选择Tris-HCl系统，浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8 ，TEMED与AP: AP 催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四 甲基乙二胺，催凝剂，加速AP催化作用; 十二烷基磺酸钠(SDS): 阴离子去污 剂，作用有四: 去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏 水作用、去除多肽折叠。
我们毕业啦
其实是答辩的标题地方

色谱技术在多肽分离中的应用1.多肽概况肽是α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。

多肽也简称为肽，是20世纪被发现的。

多肽有生物活性多肽和人工合成多肽两种。

生物提取的多肽具有很强的活性，所以叫做活性肽！只有活性的肽才能对人体产生很好的效果!但是人工合成的多肽有很多是没有活性的，是需要筛选的，只有活性肽才能被人体安全使用。

多肽是α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。

由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。

通常由10-100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。

它们的分子量低于10000Da（Dalton道尔顿），能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。

也有文献把由2-10个氨基酸组成的肽称为寡肽（小分子肽）；10-50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。

多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。

多肽类药物是我国药物研究中的一个活跃的领域，多肽类物质广泛存在于自然界中的，如何从天然动物、植物、微生物中分离活性多肽物质，随着分子生物学的发展、基因工程技术、多肽合成技术的兴起,并出现一些新的方法[1]。

2. 多肽分离方法多肽物质本质上属于低分子蛋白，它的分离方法与蛋白质的分离方法相似，常用的提取分离方法，包括化学萃取法(如醇提、丙酮法)、水泡法、冻融法、酶解法、沉淀法、超滤法、离心法、逆流分溶法、层析法、电泳法等。

但根据不同的实验材料不同采用不同的方法，实际应用中常常是几种方法的组合使用。

2.1液相色谱分离法2.1.1高效液相色谱分离多肽高效液相色谱分离多肽是近年来常用的方法之一，其具有分离效果好，速度快，回收率高的特点。

根据分离过程中的物理、化学原理不同分为反向高效液相色谱，离子交换色谱、凝胶过滤色谱等。

冀峰[2]等使用岛津氨基酸柱后衍生系统锂型分析柱建立了24种氨基酸的高效液相色谱柱后衍生分析方法，成功测定了某两种市售样品牛奶中的皮革水解蛋白含量。

常规电泳分离技术（凝胶电泳）学生：陈瑶学号：10101550121 内容摘要：关键词：电泳分离技术的原理、特点、分类、凝胶电泳的应用范围、应用实例。

一、概念在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。

凝胶电泳：以凝胶(如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等)为支撑物的区带电泳。

1.主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（1）琼脂糖——筛分作用小，适于大分子物质（2）聚丙烯酰胺——分离效果好，分辨率高，适于小分子物质二、常规电泳分析的原理1.基本原理：在确定的条件下，在电解质溶液中，带电粒子在单位电场强度作用下，带电分子由于各自的电荷和形状大小不同,因而在电泳过程中具有不同的迁移速度,形成了依次排列的不同区带而被分开。

2.这里结合有支持的区带电泳讨论带电的样品颗粒，在饱和缓冲溶液的支持物中，在电场中的运动状态：用Q表示样品颗粒本身所带的电量，用E表示电场强度，V为样品颗粒的移动速度，K表示摩擦系数。

则这时颗粒在电场中所受到拉力（泳动力）为QE，KV彼岸时相反方向的摩擦力，当两种力相等时，可用下式表示：QE=KV ①移动等式①得：V=QE/K ②从②可以得出，颗粒在电场中的移动速度与它的带电量及电场强度的乘积成正比，与摩擦系数成反比。

即颗粒本身携带的电荷越多、电场强度越大，颗粒移动的越快；反之越慢。

再变动一下等式②，即把电场强度移到等式的左边来，得：V/E=Q/K ③式③中的V/E的含义为：在单位电场强度下，颗粒的移动速度，此处称为该颗粒的电泳迁移率，用µ表示，即：µ=V/E=Q/K ④式④中移动速度V用d/t表示，d单位是cm，t的单位是s，即每秒钟移动多少厘米（cm/s）。

电场强度E用V/L表示，V的单位是V，L的单位是cm，L是指电泳支持物的有效长度。

即支持物每厘米长的电位降为电场强度(V/cm)。

例如，在作血清蛋白质的电泳时，支持物醋酸纤维薄膜的有效长度为8cm.电场给予的支持物两端的电压为160V，该电泳的电场强度即为160V、8cm=20V/cm.即支持物每厘米长的电位降为20V。

双向电泳的概念和原理双向电泳是一种分子生物学技术，早期于1980年被开发出来，目的在于研究从蛋白质到核酸的分子形式。

它成功地用电场来完成蛋白质和核酸的迁移。

它可以生物学物质之间进行重要的调查和研究，它对生物分子的结构和功能提供了有用的信息。

双向电泳是一种电泳技术，它可以将分子物质从一个电极移动到另一个电极，将它们分开，从而可以生物学实验过程中的分子物质进行调查和研究。

它的基本原理是利用电场的力来引导电荷密度的分子经过一个单独的电极，从而将它们分开。

由于电泳法中的电场有一定的方向性和强度，因此，电荷密度不同的分子会由于电场的影响，在施加了强电场的电极之间移动。

双向电泳的核心部分是一个称为磁控电泳仪的仪器，它具有一对可旋转的电极，可以施加随时间变化的电场强度，它还具有调节电场强度的功能，以满足研究需求。

一般来说，双向电泳的原理是通过将悬浮液加入电极室中，再施加适量的电场，将电荷密度不同的分子分开，其中电荷密度较高的分子朝着电极移动，而电荷密度较低的分子则会朝着电极反向移动，以此进行分离。

另一方面，双向电泳中也可以使用不同类型的电极液体，如酸性液体和碱性液体。

当电极液体的酸碱性发生变化时，它会影响分子的移动方向，从而影响分子的分离效果。

双向电泳技术可以用于核酸和多肽的分离，也可以用于水溶液中的分子的分离。

双向电泳的应用非常广泛，它可以用于对各种生物分子的结构和功能关系的研究，为医学和生物科学的发展提供帮助。

双向电泳是一种新型技术，它具有高通量分析、低成本、易于操作等特点。

它可以在短时间内分析大量样品，而且相比传统的技术，它也更加准确、可靠。

双向电泳技术也正在广泛应用于基因组学、蛋白组学、工业过程中的分子序列定位、癌症诊断、药物毒性测定等方面。

因此，双向电泳技术的应用和神奇的效果在生物医学研究中已经被越来越广泛地认识和使用。

未来，双向电泳技术将会成为进行生物学研究所必不可少的工具，为研究生物分子的结构和功能提供新的方法。

2、薄层电泳 、
将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层 进行电泳的技术。 常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅 胶等 操作：
（1）缓冲液选择 （2）支持物处理 （3）薄层板制作 （4）加样 （5）电泳 （6）分析 离子强度较高的缓冲液 精制品 挖沟、混合样品、填埋 印染法
3、薄膜电泳(film electrophoresis) 薄膜电泳(film
带电物质在电场作用下，因其电荷性 带电物质在电场作用下，因其电荷性 电荷数量及分子量大小的不同而 质、电荷数量及分子量大小的不同而 泳动方向、 的不同， 产生的泳动方向 泳动速度的不同 产生的泳动方向、泳动速度的不同， 最终使混合物组分得以分离 的操作 单元称为电泳分离 电泳分离（ 单元称为电泳分离（electrophoresis separation 主要用于酶的纯度鉴定、酶分子量测定、 主要用于酶的纯度鉴定、酶分子量测定、 酶等电点测定及小批量酶的分离纯化。 酶等电点测定及小批量酶的分离纯化。
（2）两性电解质载体 ） 理想的两性电解质载体： 理想的两性电解质载体： a）在等电点处有足够的缓冲能力，保证 梯度稳 ） 等电点处有足够的缓冲能力，保证PH梯度稳 定。 b）在等电点处有足够的电导，允许一定的电流通 ） 等电点处有足够的电导， 过。 c）分子量要小，易于与被分离物质分开。 ）分子量要小，易于与被分离物质分开。 d）不与被分离物质发生反应或使之变性。 ）不与被分离物质发生反应或使之变性。
（5） 操作要点
pH梯度支持介质的制备 （自由电泳，凝胶支持系统） 聚焦电泳 分离组分的检测
（必要时可以在检测之前采用透析， 膜分离等方法除去两性电解质载体）
(3)等电聚焦操作关键是调配稳定的、连续的PH梯度。 等电聚焦操作关键是调配稳定的、连续的 梯度 梯度。 等电聚焦操作关键是调配稳定的 氨基酸混合物或 一般用氨基酸混合物 聚氨基羧酸（多氨基、 一般用氨基酸混合物或聚氨基羧酸（多氨基、多 梯度。 羧基）的缓冲溶液调配PH梯度 羧基）的缓冲溶液调配 梯度。 (4)PH梯度支持介质：聚丙烯酰胺凝胶最常用， (4)PH梯度支持介质：聚丙烯酰胺凝胶最常用，其次 梯度支持介质 最常用 是琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶。 琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶。

关键词：多肽蛋白质提取分离摘要：多肽是由多个氨基酸缩合形成的，蛋白质是由几十到几千个氨基酸分子借助肽键和二硫键相互连接的多肽链，随肽数目，氨基酸组成及排列顺序不同，蛋白质分子呈现三维空间结构，并且有生物活性。

采取何种分离方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。

对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。

这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。

㈠﹑多肽的提取与分离多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物学活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。

生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。

随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。

相1.高效液色谱（HPLC）HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其他化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。

因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。

如赵骏①等以酪蛋白为原料，采用微生物蛋白酶A水解，其酶解产物为血管紧张素转化酶（ACE）。

2.反相高效液相色谱（RP-HPLC）.用反相色谱法分离多肽和蛋白质的原理是基于蛋白质的疏水性，在不同介质条件下，使不同的蛋白质得以分离，具有快速高效和高回收的特点，在分离和制备多肽及蛋白质上有独特的优越性。

吴亚丽②等利用反相高效液相色谱法分析降血压肽AHP的最佳工艺条件。

3.疏水作用色谱(Hydrophobic interaction chromatography,HIC)HIC是利用多肽中含有疏水基团，可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的，其比RP-HPLC具有较少使多肽变性的特点。

多肽的分离纯化方法一、引言多肽是由氨基酸组成的生物大分子，其具有广泛的生物学功能和应用场景。

多肽的研究需要对其进行分离纯化，以获取高纯度的多肽样品。

本文将介绍多肽的分离纯化方法。

二、多肽的提取1. 细胞裂解法：将细胞裂解后，通过离心等方法去除细胞碎片和脂质等杂质，得到含有目标多肽的上清液。

2. 酸性水解法：将含有目标多肽的蛋白质样品加入酸性溶液中，在适当温度下进行水解反应，得到含有目标多肽的水解液。

三、分离方法1. 层析法：利用不同化学性质或大小形状等差异对混合物进行分离。

包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等。

2. 电泳法：利用电场作用下不同电荷或大小形状等差异对混合物进行分离。

包括SDS-PAGE、IEF等。

3. 薄层色谱法：将混合物均匀地涂在薄层色谱板上，通过不同的溶剂系统进行分离。

4. 超滤法：利用超滤膜对混合物进行筛选，根据分子量和形状等差异进行分离。

四、纯化方法1. 透析法：将混合物放入透析袋中，在适当条件下通过半透膜进行渗透扩散，去除杂质，得到目标多肽。

2. 再结晶法：通过溶液浓缩、结晶等步骤得到高纯度的多肽样品。

3. 活性剂法：利用表面活性剂或有机溶剂等对混合物进行解聚和去除杂质。

五、检测方法1. 比色法：利用多肽与某些化学试剂发生反应产生显色物质来检测多肽样品。

2. 质谱法：通过质谱仪对多肽样品进行检测，得到其分子量和组成信息。

3. 免疫学方法：利用特异性抗体对多肽样品进行检测。

六、结论多肽的分离纯化方法有很多种，选择合适的方法需要考虑到目标多肽的特性以及实验室条件等因素。

在分离纯化过程中，需要注意对样品的保护和操作的规范性，以获取高质量的多肽样品。

分离多肽时应注意什么在进行多肽的分离过程中，需要注意以下几个方面：1. 选择合适的分离方法：多肽的分离可以使用多种方法，包括电泳、层析、电化学等。

在选择方法时，需要考虑多肽的性质、目标纯度要求以及实验条件等因素。

例如，如果多肽具有特定的电荷性质，可以选择电泳方法进行分离。

2. 准备合适的样品：在进行分离之前，需要对多肽样品进行适当的处理。

这可能包括去除杂质，如盐类、蛋白质等。

可以使用离心、过滤等方法进行样品预处理，以获得目标多肽的高纯度。

3. 优化分离条件：分离方法的条件对于多肽的得率和纯度都有重要影响。

例如，在进行分子筛层析时，可以调整流速、溶剂组成、温度等参数，以使多肽在适宜的条件下保持稳定，同时实现较好的分离效果。

4. 选择合适的固定相：在层析过程中，固定相的选择对于多肽的分离至关重要。

根据多肽的性质，可以选择不同类型的固定相，如正相、反相、离子交换等。

合适的固定相可以提供较好的保留和分离效果。

5. 多肽保护和修饰：为了提高多肽的分离效果，可以对多肽进行保护和修饰。

例如，通过引入适当的保护基或修饰分子，可以改变多肽的极性、电荷、溶解性等性质，从而实现它们的更好分离。

6. 合理利用联用技术：多肽的联用技术如LC-MS、GC-MS等可以进一步提高多肽的分离和鉴定效果。

通过联用技术，可以实现对多肽的高灵敏度和高分辨率的分析，从而获得更准确的结果。

7. 尽可能减小样品损失：在分离过程中，尽可能减小多肽的损失是非常重要的。

这可以通过避免多肽在柱上吸附、降低背景噪声、优化柱洗脱条件等方式实现。

此外，还可以将分离剂回收和再利用，以减少成本和减小环境污染。

8. 进行分离效果的监控：在进行多肽的分离过程中，需要不断监测和评估分离效果。

可以使用UV检测器、荧光检测器等实时监测多肽的吸收和荧光信号，以确定分离的进程和效果，及时调整分离条件。

9. 多肽的分离常常是一个繁琐而耗时的过程，需要进行多次试验和优化。

因此，需要具备耐心和细致的工作态度，并尽可能利用先进的技术手段和方法，以提高分离的效率和质量。

多肽制备技术
多肽制备技术是一种通过化学合成或生物合成的方法合成多肽的技术。

以下是一些常用的多肽制备技术：
1. 化学合成：通过将氨基酸分子按特定的顺序连接起来来合成多肽。

常用的化学合成方法包括固相合成和液相合成。

- 固相合成：将第一个氨基酸固定在固相材料上，然后按照顺
序逐步加入氨基酸，通过反应来形成肽链。

合成完成后，将多肽从固相材料上解离下来。

- 液相合成：将氨基酸溶解在溶液中，按照顺序加入反应试剂，通过反应来形成肽链。

需要反应物的保护基团和反应条件的精确控制。

2. 生物合成：利用生物学方法，在细胞内或细胞外合成多肽。

- 基因工程：在基因水平上通过改变DNA序列来合成特定的
多肽。

通过重组DNA技术将目标基因插入到表达宿主中，使
其产生目标多肽。

- 发酵工艺：利用微生物（如大肠杆菌）或真菌（如酵母菌）
通过自身代谢合成目标多肽。

通过优化培养条件和菌株选择，提高多肽产量。

3. 纯化和分离：得到多肽后，需要进行纯化和分离以获得高纯度的产物。

常用的纯化方法包括色谱技术（如层析、透析和电
泳）、冷冻干燥和浓缩等。

总结起来，多肽制备技术主要包括化学合成和生物合成两大类，根据具体的需求选择合适的方法。

生物电泳作用
生物电泳(Bioelectrophoresis)是一种生物分子的移动方式，它
是利用带有正或负电荷的分子在电场中排列形成电泳图或离子迁移图。

生物电泳可以用来分离和检测微量的生物分子，如蛋白质、多肽、核酸、抗体、抗原和病毒等。

生物电泳是一种快速、有效的技术，广泛应用于分子生物学、细
胞生物学和免疫学的研究，特别是用于以下实验：
1. 分析生物大分子的组成：通过电泳来提取非结构性的生物分子，如
蛋白质、多肽、核酸、抗体等，可以提供有关分子的准确结构信息。

2. 分析生物大分子的活性：生物电泳技术可以用于分析不同类型
的生物大分子，如蛋白质、多肽、核酸、抗体等，以及它们之间的相
互作用。

3. 用于药物研究：生物电泳可以用来研究药物对抗原蛋白质或抗
体的影响，例如药物识别结构、亲和力、抑制作用等。

4. 检测体内微量物质：生物电泳技术可以用于检测体内微量物质，如小分子抗原、抗体、抗毒素介质、脂肪酸和胆固醇等物质的浓度和
周期性的变化。

5. 病毒检测：生物电泳技术可以用于检测病毒，有助于我们了解
病毒的感染情况以及传播趋势。

生物电泳技术的基本原理是，当在受电场的影响下，表面带有电
荷的生物分子沿着电流线方向移动时，分子在具有负电荷区域和正电
荷区域之间重新分散，导致原来分散的分子发生不同程度的移动，最
终形成电泳图或离子迁移图。