BAMBI基因敲除小鼠的繁育、基因型鉴定

Ｏｃｔ．２０１４．３４（５）　实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３８１　

ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４—５８１７．２０１４．０５．００７　

ＢＡＭＢＩ基因敲除小鼠的繁育、基因型鉴定　

罗　肖１，魏双羽．－２，贾如１，姚婷・，张燕茹－，师小博　，闰剑群１　

（１．西安交通大学医学部生理学与病理生理学系；教育部环境与疾病相关基因重点实验室，　

西安７１００６１；２．西安交通大学第一附属医院血液内科，西安７１００６１）　

【摘要］目的　探讨ＢＡＭＢＩ－，一小鼠的繁殖和鉴定方法，筛选出足够数量的ＢＡＭＢＩ－，－小鼠，为研究　ＢＡＭＢＩ基因在肥胖、能量代谢等方面的生理功能提供实验动物。方法将引进的２对ＢＡＭＢＶ小鼠　

扩繁后，以与背景品系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型（ｗＴ）回交的方式获得　坳，＋，＿小鼠，再将ＢＡＭＢＩ＋／－小鼠进　

行互交大量繁殖。提取幼鼠尾部组织ＤＮＡ，利用ＰＣＲ方法鉴定基因型；选取ＢＡＭＢＩ　小鼠取肩　胛部位棕色脂肪组织（ＢＡＴ），腹股沟部位皮下白色脂肪组织（ｓＷＡＴ），性腺周围白色脂肪组织　

（ｇＷＡＴ）和肝脏，利用实时ＰＣＲ方法检测ＢＡＭＢＩｍＲＮＡ的表达量。结果ＢＡＭＢＩ＋／－小鼠互交扩　

繁，短期能获得大量小鼠；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型（ｗＴ）、ＢＡＭＢＩ＋／－和ＢＡＭＢＩ－／－各表型结果基本符合孟德　尔遗传规律；ＢＡＭＢＩ　小鼠敲除效率理想。结论ＢＡＭＢＩ＋／。小鼠互交是繁育ＢＡＭＢＩ　小鼠的较好　

方法；ＰＣＲ方法能够准确鉴定ＢＡＭＢＩ／。小鼠。　［关键词］ＢＡＭＢＩ；基因敲除；基因型鉴定；ＰＣＲ　

［中图分类号］Ｑ９５—３３　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１６７４．５８１７（２０１４）０５—０３８１—０５　

ＢＡＭＢＩ（ＢＭＰ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｉｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）基因编码产物为一个由２６０个氨基酸组成的　跨膜糖蛋白，由于其胞外结构域与转化生长因子　

（ＴＧＦ．ｐ）和骨形成蛋白（ＢＭＰ）等配体的Ｉ型受体胞外　结构域相似但缺失胞内信号转导结构域，因而也称　为伪受体ｆｌ＿　。ＢＡＭＢＩ在各组织之间广泛表达，并　

且在物种之间遗传进化中高度保守『２１　】。近年研究　

发现，ＢＡＭＢＩ基因参与调控胚胎发育及多种组织　器官的肿瘤形成，并参与调控多种与脂肪细胞形成　

有关的自分泌／旁分泌细胞因子［ｓＪ们。然而目前对　于ＢＡＭＢＩ的研究大多在各种ＢＡＭＢＩ基因缺失的细　

胞中进行，虽然具有很好的效果，但是在模拟体　

内环境方面仍有不足［１１】。因此本课题组从美国纽约　Ｍｏｕｎｔ　Ｓｉｎａｉ医学中心Ｄｅｔｌｅｆ　Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒｆｆ教授处引进　

［收稿日期】２０１４—０３—１９　［基金项目】国家自然科学基金项目资助（编号：３１２００８８６）；中　央高校基本科研业务费专项资金资助　【作者简介］罗￣（１９８２．），女，博士，生理学讲师，　Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｌｕｏ＠ｍａｉｌ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃａ　［通讯作者】闰剑群，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｑｙａｎ８　１０＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ　２对具有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ遗传背景的ＢＡＭＢＩ敲除小鼠，　

经基因型鉴定成功培育较大量的ＢＡＭＢＩ基因敲除　小鼠，为深入研究ＢＡＭＢＩ在生理功能中的重要作　

用及机理提供实验动物。　

１材料与方法　

１．１实验动物　美国纽约ＭＯｕｎｔ　Ｓｉｎａｉ医学中心Ｄｅｔｌｅｆ　

Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒｆｆ教授惠赠２对ＢＡＭＢＩ基因敲除小鼠　

（ＢＡＭＢＩ—Ｉ一）。该小鼠背景品系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠（ｗＴ），　饲养于西安交通大学实验动物中心［ＳＣ文Ｋ（陕）　；　”　２０１２－００３】。　．．　１．２小鼠的饲养和繁殖　’　

按照ＳＰＦ级动物饲养标准进行饲养。室内温　

度控制在２０￣２５℃，相对湿度５０％～６０　，光　照为每日１２　ｈ，小鼠饲料、饮水、垫料均经高温　

高压灭菌处理。小鼠自由饮水，并饲喂标准日粮　［北京科澳协力饲料有限公司，ＳＣＸＫ（京）２００９—　００１２１。饲养过程中，密切观察小　鼠生长情况，每　

周换２次垫料，每日补充饲料及饮水。因引进的　３８２　实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｏｃｔ．２０１４．３４（５）　

小鼠数量有限，采用了２雄２雌同窝的方式进行繁　殖，二个月后子代纯合子９只，与引进的背景品　

系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（８周龄）按照雌雄２：１配对合笼繁殖（回　

交）；其子代按雌雄２：１配对合笼繁殖（互交）。在　幼仔２　１日龄左右离乳，并打耳号，剪鼠尾。　

１．３小鼠的基因型鉴定　１．３．１　小鼠尾部基因组ＤＮＡ的提取　剪小鼠尾　

０．５—１　ｃｍ置入１．５　ｍｌ　Ｅｐｐｅｎｄｏｌｆ管中，参照北京天　根生物技术有限公司生产的组织基因组ＤＮＡ提取试　剂盒说明书抽提ＤＮＡ。　

１．３．２　ＰＣＲ反应及琼脂糖凝胶电泳基因型鉴定ＰＣＲ　所用引物序列如表１。　

ＰＣＲ反应体系：下列反应物构成２０　ｌ的反应　体系。Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０　ｇｍｏｌ／Ｌ）０．５　ｇｌ，Ｒｅｖｅｒｓｅ　

Ｐｒｉｍｅｒ（１０　ｐｍｏｌＦＬ）０．５　ｇｌ，ＴＡＫＡＲＡ　ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ（２Ｘ）　１０　ｌ，模板ＤＮＡ　１　ｇｌ，加ｄｄＨ２Ｏ　８　ｌ，共２Ｏ　ｌ。　采用ＰＣＲ扩增仪进行循环扩增：预变性９４℃　

４　ｍｉｎ；变性９４℃３０　Ｓ；退火６２℃３０　Ｓ；延伸　

７２℃４０　Ｓ；共４０个循环，最后再延伸７２℃１０ｍｉｎ，　之后４℃保存。　

电泳鉴定：取ＰＣＲ反应终产物５　ｕｌ在１．５％的　琼脂糖凝胶电泳。鼠尾琼脂糖凝胶电泳基因型片段　

为：野生型（＋，＋）２１５　ｂｐ；纯合子（一／．）３１６　ｂｐ；杂合子　（＋／．）２１５　ｂｐ和３１６　ｂｐ，根据条带大小可以鉴别出　

各个基因型小鼠。　

１．４保种　为了确保ＢＡＭＢＩ＋，一小鼠具有良好的繁殖能力，　

保种群每隔３—５代用雄性ＢＡＭＢＩ＋／一小鼠与野生型　

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性小鼠回交１次。　１．５组织样本采集　随机选取８周龄ＢＡＭＢＩ野生型（ＷＴ）￣ＩＩ敲除　

（ＫＯ）ｄ，鼠各５只（雌雄不限），断颈处死，取肩胛部　位棕色脂肪组织（ＢＡＴ），腹股沟部位皮下白色脂肪　

组织（ｓＷＡＴ），性腺周围白色脂肪组织（ｇＷＡＴ）￣Ｈ肝　

脏（１ｉｖｅｒ），立即在液氮中冷冻，一８０℃储存备用。　１．６　总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ第一链的合成　

按照Ｔｒｉｚｏｌ总ＲＮＡ提取试剂盒（ＴＡＫＡＲＡ）说明　书提取不同类型脂肪组织及肝脏总ＲＮＡ，提取完　

成后，Ｎａｎｏｄｒｏｐ检测ＲＮＡ的纯度及浓度，并利用　

Ｔｈｅｒｍｏ反转录试剂盒合成ｃＤＮＡ。　１．７实时定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）　

２０山ＰＣＲ反应体系（Ｂｉｏ—Ｒａｄ　ｉＱ５）：ｄｄＨ２０　４　ｇｌ、　

ｃＤＮＡ模板２山、２　ｇｍｏｌ／Ｌ上游引物２　、２　ｇｍｏｌ／Ｌ　下游引物２　ｇｌ、ＳＹＢＲ　ｇｒｅｅｎ（ＴＡＫＡＲＡ）１０　ｐｌ。反　

应条件：９５℃预变性５　Ｓ，每个循环６０℃２０　Ｓ。　实验数据利用Ｒｏｔｏｒ　Ｇｅｎｅ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　

６．０分析，标准Ｃｔ值设置为０．０３５，以ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ　

为内参基因，目的基因的值＝２　（ｃｔ　ＲｅｆＧｅｎｅ＂Ｃｔｏｏ　）。为　了排除ＢＡＭＢＩ基因序列从潜在的启动位点转录，　

本实验设计了两对不同的实时定量ＰＣＲ引物（一对　引物序列跨越外显子１和２；一对引物序列跨越外　

显子２和３）（表１）。　１．８数据统计分析　

采用ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　５．０软件，Ｏｎｅ．ｗａｙ　

ＡＮＯＶＡ结合Ｔｕｋｅｙ’Ｓ　ｐｏｓｔ—ｈｏｃ检验分析三组以上数　据之间的差异显著性。数据表示为　±　，Ｐ≤０．０５　

为差异有统计学意义。

　３８４　实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｏｃｔ．２０１４．３４（５）　

ＢＡＭＢＩ－，－小鼠，并按照ＳＰＦ级动物饲养标准进行繁　育。在种群扩繁以后，选用ＰＣＲ法鉴定基因型，　

较Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ方法更为简单直观【ｌ３，１４］。本实验中　设计的两对特异性引物，一对位于原有的功能基因　

上，一对位于替代基因上，两对引物共用上游序列。　

通过至少２次独立扩增，得到明确的鉴定结果。　为了验证ＰＣＲ的可靠性，本实验采集了不同　

基因型小鼠不同类型的脂肪组织及肝脏（与肥胖和能　

量代谢密切相关的组织和器官），利用实时定量ＰＣＲ　的方法检测了ＢＡＭＢＩ　ｍＲＮＡ的表达量。由于　

ＢＡＭＢＩ基因序列存在３个外显子区域，为了避免从　潜在的第二个启动位点转录ＢＡＭＢＩ基因，本实验　

分别设计了跨越外显子１和２区域和外显子２和３区　域的两对特异性引物。结果显示，ＰＣＲ方法鉴定　

基因型结果可靠，这为后期实验研究奠定了基础。　

在饲养过程中发现，ＢＡＭＢＩ’Ｉ’小鼠在生长发　育及表型特征上与ＷＴ小鼠相比无明显差异，但在　

繁殖效率上较ｗＴ略微偏低。有时出现雌鼠产仔率　

低的情况，有时出现母鼠食仔现象，这可能与受到　惊吓或内分泌紊乱有关，具体原因有待进一步研究。　

本研究通过引进ＢＡＭＢＩ－，．小鼠，采用与遗传背　景为Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ种系的野生型小鼠回交及其子代互交　

方式成功地大量繁育，经过ＰＣＲ基因型鉴定和实时　

定量ＰＣＲ检测，在短期内获得了足够数量鲋　Ｉ　。　小鼠，为探索ＢＡＭＢＩ基因的生物学功能提供了充　

足的动物模型。　

参考文献　

［１】Ｇａｗａｎｔｋａ　Ｖ，Ｐｏｌｌｅｔ　Ｎ，Ｄｅｌｉｕｓ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｉｎ　Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔｈｗａｙｓ，ｐｒｅ—　ｄｉｃｔｓ　ｇｅｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａ　ｇｌｏｂａｌ　ｖｉｅｗ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｍｅｃｈ　Ｄｅｖ，１９９８，７７（２）：９５—１４１．　【２】Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋ　Ｄ，Ｃｈｅｎ　ＹＧ，Ｄｏｓｃｈ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　１’ＧＦ．　ｂｅｔａ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐｓｅｕｄｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ＢＡＭＢＩ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，　１９９９，４０１（６７５２）：４８０—４８５．　［３］Ｋｎｉｇｈｔ　Ｃ，Ｓｉｍｍｏｎｓ　Ｄ，Ｇｕ　ＴＴ，ｅｔ　ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　Ｎｍａ／ＢＡＭＢＩ　ｄｕｒｉｎｇ　ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｄｅｎｔ　Ｒｅｓ，２００１，８０（１０）：１８９５—１９０２．　［４】Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ　Ｌ，Ｐｌｕｍ　Ｍ，Ｄｉｌｄｒｏｐ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｂａｍｂｉ　ｉｓ　ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｂｍｐ一４　ｄｕｒｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｍｅｃｈ　Ｄｅｖ，　２００１，１００（２）：３２７—３３０．　［５】Ｌｏｖｅｌａｎｄ　ＫＬ，Ｂａｋｋｅｒ　Ｍ，Ｍｅｅｈａｎ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆＢａｍｂｉ　ｉｓ　ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ　ｉｎ　ｊｕｖｅｎｉｌｅ　ａｎｄ　ａｄｕｌｔ　ｒａｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ａｎｄ　ｉｓ　ｒｅｇｕ－　ｌａｔｅｄ　ｉｎ　ｍａｌｅ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００３，１４４（９）：　４１８０—４１８６．　［６】ＴｓａｎｇＭ，ＫｉｍＲ，ｄｅＣａｅｓｔｅｃｋｅｒＭＰ，ｅｔａ１．Ｚｅｂｒａｆｉｓｈｎｎｌａｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ＴＧＦ　ｂｅｔａ　ｆａｍｉｌｙ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓｉｓ，２０００，２８　（２）：４７—５７．　［７］Ｄｅｇｅｎ　ＷＧ，Ｗｅｔｅｒｍａｎ　ＭＡ，Ｖａｎ　Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ　ＪＪ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｎｍａ，ａ　ｎｏｖｅｌ　ｇｅｎｅ，ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，１９９６，６５（４）：４６０—４６５．　［８】ＳａｓａｋｉＴ，ＳａｓａｈｉｒａＴ，ＳｈｉｍｕｒａＨ，ｅｔａ１．ＥｆｆｅｃｔｏｆＮｍａｏｎｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｂｙ　ＴＧＦ—ｂｅｔａａ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｆｉｎｅｓ　【Ｊ】＿Ｏｎｃｏｌ　Ｒｅｐ，２００４，１１（６）：１２１９－１２２３．　［９］Ｓｅｋｉｙａ　Ｔ，Ａｄａｃｈｉ　Ｓ，Ｋｏｈｕ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＢＭＰ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｉｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ—ｂｏｕｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢＡＭＢＩ），ａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ａｓ　ａ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｅｔａ—ｃａｔｅｎｉｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００４，２７９（８）：６８４０－６８４６．　【１０］Ｆｒｉｔｚｍａｎｎ　Ｊ，Ｍｏｒｋｅｌ　Ｍ，Ｂｅｓｓｅｒ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｔｈａｔ　ｉｎｃｌｕｄｅｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｂｅｔａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＢＡＭＢＩ　ｐｒｅｄｉｃｔｓ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ］．　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００９，１３７（１）：１６５—１７５．　［１　１］Ｌｕｏ　Ｘ，Ｈｕｔｌｅｙ　ＬＪ，Ｗｅｂｓｔｅｒ　ＪＡ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢＭＰ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ—Ｂｏｕｎｄ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｒＢＡＭＢＩ）ａｓ　ａ　Ｐｏｔｅｎｔ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ／Ｐａｒａｃｒｉｎｅ　Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　Ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１２，　６１（１）：１２４—１３６．　［１２】Ｇｏｎｚａｌｅｓ　ＣＢ，Ｓｉｍｍｏｎｓ　Ｄ，Ｍａｃｄｏｕｇａｌｌ　ＭＲＮ．Ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ　Ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　ＴＧＦ｛ｂｅｔａ｝ａｎｄ　Ｎｍａ／ＢＡＭＢＩ　ｉｎ　０ｄｏｎｔｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ】．　Ｊ　Ｄｅｎｔ　Ｒｅｓ，２０１０，８９（６）：５９７—６０２．　［１３］朱加银，陈锡文，赵惠玲，等．腺苷Ａ２ａ受体基因敲除小鼠　不同繁育方法比较［Ｊ］．实验动物与比较医学，２００８，２８（３）：　１８８．１８９．　［１４】钱云，叶步青，耿建国，等．ＤＮＡ检测技术在基因剔除小鼠　保种中的初步应用【Ｊ】．实验动物与比较医学，２００９，２９（２）：