实验七亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴定目的蛋白质(GST、SDS-PAGE)

蛋白SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定一、原理：（1）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDS - PAGE。

用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass, Mr）测定。

SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。

SDS 破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。

因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。

蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

（2）分离效应：PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuous electrophoresis）：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuous electrophoresis）：采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系连续PAGE：电荷效应；分子筛效应不连续PAGE：电荷效应；分子筛效应；浓缩效应不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

①浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。

②电荷效应：分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。

1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法。

2. 掌握利用亲和层析法进行蛋白质共纯化的技术。

3. 通过实验验证蛋白质共纯化的效果。

二、实验原理蛋白质共纯化是指从混合蛋白质样品中同时分离和纯化两种或两种以上的目的蛋白。

亲和层析法是蛋白质共纯化常用的技术之一，其原理是利用蛋白质与特定配体的亲和力，通过柱层析将目的蛋白从混合样品中分离出来。

三、实验材料1. 试剂：亲和层析柱、亲和配体、洗脱液、样品缓冲液、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝染色液等。

2. 仪器：离心机、层析柱、凝胶成像仪等。

四、实验方法1. 准备亲和层析柱：将亲和配体固定在层析柱上，制成亲和层析柱。

2. 样品处理：将混合蛋白质样品加入亲和层析柱，进行预平衡。

3. 亲和层析：将样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。

4. 洗脱：用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。

5. 检测：将洗脱液进行SDS-PAGE分析，观察目的蛋白的纯度。

6. 收集目的蛋白：将SDS-PAGE凝胶上的目的蛋白条带切割下来，进行后续处理。

五、实验结果与分析1. 亲和层析柱制备成功，亲和配体固定在层析柱上。

2. 样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。

3. 用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。

4. SDS-PAGE分析结果显示，洗脱液中含有目的蛋白，且纯度较高。

通过亲和层析法进行蛋白质共纯化实验，成功分离和纯化了两种目的蛋白，验证了实验方法的有效性。

七、实验注意事项1. 亲和层析柱制备过程中，要注意配体的固定量和固定效果。

2. 样品处理过程中，要确保样品溶液的浓度适宜，避免样品过浓或过稀。

3. 亲和层析过程中，要注意控制洗脱液的pH值和离子强度，以保证目的蛋白的稳定性。

4. 实验过程中，要注意层析柱的清洗和保存，避免污染。

5. 实验结束后，要对实验数据进行整理和分析，总结实验结果。

SDS-PAGE检测蛋白质纯度1．电泳的基本原理许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。

由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。

2．影响电泳的主要因素2.1 电泳介质的pH当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处于等电状态，即不向正极或负极移动。

当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。

因此，任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响，即决定两性物质的带电状态及其量，为了保持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH8．6的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。

2.2 缓冲液的离子强度离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。

如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层)使电脉速度减慢。

所以常用离子强度为0.02-0.2之间。

2.3 电场强度电场强度和电泳速度成正比关系。

电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。

如纸电泳的滤纸长15cm，两端电压（电势差）为150V，则电场强度为150/15=10V/cm，电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。

电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离。

2.4 电渗作用在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。

如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。

由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响，如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。

如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二者相加。

sdspage实验报告SDS-PAGE实验报告引言：SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。

通过SDS（十二烷基硫酸钠）的作用，可以使蛋白质在电泳过程中带有负电荷，从而使其按照分子量大小在凝胶上进行分离。

本实验旨在通过SDS-PAGE技术分离和分析不同来源的蛋白质样品，探究其分子量和纯度。

材料与方法：1. 样品制备：从不同来源（如细菌、植物、动物）获得蛋白质样品，并进行样品的提取和纯化。

2. SDS-PAGE凝胶制备：根据所需分离范围选择合适的凝胶浓度，并制备上胶液和下胶液。

3. 样品处理：将样品与样品缓冲液混合，并加入还原剂和SDS。

4. 电泳条件：将样品加载到凝胶孔中，进行电泳操作。

设置适当的电压和时间。

5. 凝胶染色：将电泳后的凝胶进行染色，以可视化蛋白质带。

结果与讨论：通过SDS-PAGE技术，我们成功地分离和分析了不同来源的蛋白质样品。

在电泳过程中，蛋白质样品在电场作用下向阳极迁移，其迁移速率与其分子量成反比。

因此，我们可以根据蛋白质在凝胶上的迁移距离来推测其分子量。

观察到的凝胶图像显示出多个蛋白质带，每个带代表一个具有特定分子量的蛋白质。

通过与已知分子量标准品进行比较，我们可以推断出样品中蛋白质的分子量范围。

同时，通过比较不同来源的样品，我们可以观察到它们之间的差异。

在某些情况下，我们可能观察到一些额外的带，这可能是由于蛋白质的不同修饰或附加物所致。

例如，糖基化的蛋白质可能会在凝胶上显示出多个带，每个带代表不同程度的糖基化。

此外，我们还可以通过观察蛋白质带的强度来推断其纯度。

如果某个蛋白质带非常明亮且没有其他杂质带的干扰，那么可以认为该蛋白质具有较高的纯度。

相反，如果某个带非常弱或有其他带的干扰，那么可能表示该样品中存在其他蛋白质或杂质。

结论：通过SDS-PAGE技术，我们成功地分离和分析了不同来源的蛋白质样品。

通过观察蛋白质带的位置、分子量范围和强度，我们可以推断蛋白质的分子量和纯度。

SDS-PAGE蛋白质纯度分析十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是较常用的一种蛋白纯化分析技术。

SDS-PAGE可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离。

如果蛋白质样品中含有多个蛋白质或者纯化蛋白样品中含有其他杂蛋白，经过SDS-PAGE分离后不同的蛋白质会被分离成多个蛋白条带。

如果纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，则只显现一条蛋白条带。

由此SDS-PAGE技术可以对蛋白质样品的纯度进行分析。

SDS-PAGE分析原理SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移速度仅由蛋白质分子量决定，不同的蛋白质由于分子量的差异经过SDS-PAGE电泳后分离，再经由蛋白质染色对蛋白质分离结果进行分析。

蛋白质SDS-PAGE分析流程1. 蛋白质浓度检测2. 样品处理: 在蛋白样品中加入等量含有B-巯基乙醇的2x loading buffer，煮沸10分钟3. 电泳准备: 配置合适浓度的SDS分离胶，安装电泳槽，注入1x 电泳液4. 蛋白质样品上样：根据蛋白质浓度，取适量处理过的蛋白样品依次加入电泳孔槽内，另外取适量蛋白标准marker加入其他空余孔槽内。

5. 开始电泳: 接通电源，将电压调至120v，保持恒定电压。

6. 电泳结束剥离胶: 当溴酚蓝迁移至凝胶底部，停止电泳；将蛋白胶取出，并切去浓缩胶和分离胶底部的溴酚蓝胶条。

7. 染色: 使用R250染色液对蛋白胶染色1小时8. 脱色: 使用脱色液对染色的蛋白胶脱色至背景干净，蛋白条带清晰可见9. 拍照分析中/英文项目报告在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告，报告包括：1. 实验步骤（中英文）。

蛋白质sdspage电泳实验报告蛋白质SDS-PAGE电泳实验报告引言：蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它们在细胞的结构和功能中起着重要的作用。

为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们开发了许多技术和方法。

其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析方法，它通过电泳的方式将蛋白质按照其分子量大小进行分离和定量。

实验目的：本实验旨在通过SDS-PAGE电泳技术对不同来源的蛋白质进行分析，了解其分子量和纯度，并探讨其应用于蛋白质研究中的意义。

实验步骤：1. 样品制备：收集不同来源的蛋白质样品，如乳清蛋白、鸡蛋清蛋白等。

将样品加入SDS-PAGE样品缓冲液中，加热至100摄氏度，使蛋白质完全变性。

2. 准备电泳胶：根据实验需要，配制相应浓度的聚丙烯酰胺凝胶，加入TEMED和过硫酸铵使其聚合。

3. 装载样品：将变性后的蛋白质样品注入电泳胶槽中，注意不要产生气泡。

4. 电泳：将电泳胶槽连接至电源，设置合适的电压和时间，进行电泳分离。

5. 凝胶染色：将电泳胶取出，用凝胶染色剂染色，使蛋白质带可见。

6. 图像分析：使用分子量标准品作为参照，通过图像分析软件测量蛋白质带的迁移距离，计算其分子量。

实验结果：通过SDS-PAGE电泳实验，我们成功地将不同来源的蛋白质样品分离出来，并得到了清晰的蛋白质带。

根据分子量标准品的迁移距离，我们计算出了各个蛋白质样品的分子量。

讨论：1. 分子量测定：通过SDS-PAGE电泳实验，我们可以准确地测定蛋白质的分子量。

这对于研究蛋白质的结构和功能非常重要，因为不同分子量的蛋白质可能具有不同的生物活性和相互作用方式。

2. 纯度分析：通过观察电泳胶上的蛋白质带的清晰度和数量，我们可以初步评估样品的纯度。

纯度高的样品通常只有一个清晰的蛋白质带，而纯度低的样品则可能有多个模糊的带。

因此，SDS-PAGE电泳可以帮助我们选择纯度较高的蛋白质样品进行后续实验。

3. 应用前景：SDS-PAGE电泳技术在生物医学研究中有着广泛的应用前景。

百泰派克生物科技
sds-page测定蛋白质纯度
SDS-PAGE是一种根据分子量分离蛋白质的凝胶电泳分析技术。

当蛋白质通过凝胶
基质电泳分离时，较小分子量的蛋白质受到来自凝胶基质的阻力更小，电泳时迁移速度更快。

影响蛋白质在凝胶基质中的迁移速率的其他因素还包括蛋白质的结构和电荷，在SDS-PAGE中，十二烷基硫酸钠（SDS，又称十二烷基硫酸钠）和聚丙烯酰胺凝胶的使用很大程度上消除了结构和电荷的影响，蛋白质的分离完全基于多肽链的长度。

蛋白质经SDS-PAGE电泳后按分子量大小分离开来，如果蛋白样品只含有一种蛋白质，那么其电泳后只会显现一个唯一的蛋白条带；但如果一个蛋白样品中含有多种大小不同的蛋白，那么电泳后不同的蛋白质会被分离成大小不同的蛋白条带。

于是，可以据此利用SDS-PAGE的分离作用进行蛋白纯度的鉴定，不仅可以分析一个未知
蛋白样品的纯度，还可以验证蛋白样品纯化后的效果。

百泰派克生物科技使用Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra凝胶系统，提供基于1D和
2D的 SDS-PAGE分析服务技术包裹，用于多种蛋白质组学分析，包括蛋白质样品纯度分析、分子量测定、蛋白质鉴定、二硫键鉴定以及蛋白质定量等，欢迎免费咨询。

sdspage实验报告SDS-PAGE实验报告实验目的：1. 掌握SDS-PAGE方法；2. 分离已知蛋白质混合物；实验原理：1. SDS-PAGE为电泳中最为常见的方法之一，全称为聚丙烯酰胺凝胶电泳，适用于蛋白质的分子量鉴定和分离。

2. SDS能够使蛋白质中的氢键断裂，从而蛋白质以线性方式伸展，且SDS与蛋白质的比例为1:1。

加入样品后，将样品加热，则蛋白质将失去“生态”本身性质。

3. 在SDS-PAGE系统中，电泳时各个组分在电泳区水平移动速度基于分子量大小的不同准则。

通常，较大的蛋白质分子运动速度较慢，而较小的蛋白质分子运动速度较快。

电泳结束后，蛋白质将大小分开并可以被染色。

实验操作：1. 加入样品并加热至90℃；2. 将样品移入聚丙烯酰胺凝胶中；3. 加入电解溶液并进行电泳分离；4. 取出凝胶并染色。

实验结果：在SDS-PAGE凝胶中，样品中的蛋白质已经被分离，并得到个单独的带。

通过与标准品分子量相比，可以确定分离得到的蛋白质的分子量。

实验结论：1. 随着电场强度的增加，蛋白质分子迁移距离会增加。

2. 蛋白质分子迁移速度与其分子量成反比例关系。

3. SDS-PAGE可以实现对复杂混合物的蛋白质分析和鉴定，同时对单一蛋白质的分析和鉴定也有较高的分离分辨率。

实验体会：通过本次实验我对SDS-PAGE更进一步的了解，以及掌握了实验中的各项操作步骤，操作难度不大。

在实验中，正确的实验技能能使我们更好的完成实验，并得到较好的实验结果。

参考文献：1. 杨宾, 刘其峰. 生命科学实验技术手册[M]. 北京:北京师范大学出版社, 2012.2. 韩芳.基因工程传代测序[M]. 农业出版社, 2006.。

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS测定蛋白质相对分子质量一、实验目的：通过SDS-技术测定蛋白质的相对分子质量。

二、实验原理：SDS-是一种常用的蛋白质电泳分离技术。

在该技术中，蛋白质样品与SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂混合后，加热可以使蛋白质完全还原并且与SDS结合，形成具有负电荷的复合物。

这些复合物在电场中按照其分子质量大小被分离。

蛋白质样品在SDS-中首先经过堆胶，即在样品中添加聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质被沿着凝胶的宽度扩散，形成连续的蛋白质稜。

然后，电泳阶段开始，电场通过凝胶，带动带电的蛋白质稜向阳极迁移。

三、实验步骤：1.准备SDS-电泳胶液：根据使用说明配制3种浓度的聚丙烯酰胺凝胶胶液，即5%堆胶胶液、12%分离胶液和4%扩散胶液。

2. 准备样品：取相应的蛋白质样品，如细胞裂解液，将其与试剂R （含有30%甘油和2%β-巯基乙醇酰胺）和Laemmli试剂混合，以加热破坏蛋白质的二级结构。

3.堆胶：将堆胶胶液慢慢注入电泳槽中，留出足够的空间来注入分离胶液。

4.加载样品：在样品孔中加入相应数量的样品、分子量标记和模板。

5.电泳：将电泳槽连接到电源，调节电压，使电流保持稳定。

首先进行堆胶阶段，然后切换到电泳阶段，直至蛋白质移动到凝胶底部。

6. 凝胶染色：取下凝胶，用凝胶染色剂对凝胶进行染色。

一般常用染色剂有银染和Coomassie蓝染。

四、实验结果：根据实验步骤描述的方法进行实验后，我们观察到在凝胶上出现了多条蛋白质条带，每条条带代表一个蛋白质。

条带的颜色越深，表示其含量越多。

通过与分子量标记的对照，可以确定蛋白质的相对分子质量。

五、实验讨论与分析：根据实验结果，我们可以推断蛋白质的相对分子质量。

相对分子质量可以通过标准曲线法来计算，即通过已知相对分子质量的蛋白质标准品的移动距离与其相对分子质量之间的线性关系来推断未知蛋白质的相对分子质量。

通过SDS-技术测定蛋白质相对分子质量具有许多优点：能够同时分离多个蛋白质；能够对蛋白质进行集中分析；精确测量蛋白质的相对分子质量以及群体分子质量等。

sdspage分离蛋白质实验报告SDS-PAGE分离蛋白质实验报告引言：蛋白质是生物体内最基本的组成部分之一，具有重要的生物学功能。

为了研究蛋白质的结构和功能，科学家们开发了许多方法来分离和纯化蛋白质。

其中，SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离技术，本实验旨在通过SDS-PAGE分离蛋白质，了解其原理和操作步骤。

材料与方法：1. 样品制备：将待分离的蛋白质样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并进行煮沸处理。

2. 凝胶制备：根据所需分离范围选择合适的凝胶浓度，制备缓冲液和凝胶溶液。

3. 凝胶装置组装：将上下电泳槽连接，安装电极，注入缓冲液。

4. 样品加载：将样品注入凝胶槽中，注意不要产生气泡。

5. 电泳：设置适当的电压和时间，进行电泳分离。

6. 凝胶染色：将凝胶浸泡在染色液中，使蛋白质带可见。

7. 图像获取与分析：使用凝胶成像系统获取凝胶图像，并进行分析。

结果与讨论：通过SDS-PAGE实验，我们成功地分离出了蛋白质样品，并获得了清晰的凝胶图像。

根据图像，我们可以观察到不同蛋白质在凝胶上形成了不同的带状条带，这些条带代表了不同的蛋白质分子量。

在SDS-PAGE实验中，SDS（十二烷基硫酸钠）的作用是使蛋白质样品中的蛋白质分子带有负电荷，使其具有相同的电荷密度。

这样，蛋白质在电场中迁移速度只与其分子量有关，而与电荷无关。

因此，我们可以通过测量蛋白质迁移距离与已知分子量的标准品的迁移距离之间的关系，来确定待测蛋白质的分子量。

在实验中，我们还需要注意一些操作细节。

首先，样品的制备过程中要彻底破坏细胞结构，使蛋白质充分释放。

其次，在加载样品时要小心，避免产生气泡，影响分离效果。

此外，电泳条件的选择也非常重要，过高或过低的电压都会影响分离效果。

通过SDS-PAGE实验，我们可以不仅可以分离蛋白质，还可以进一步研究蛋白质的结构和功能。

例如，我们可以通过Western blotting技术检测特定蛋白质的存在，并研究其在不同生理条件下的表达变化。

sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析技术，用于测定蛋白质的相对分子质量。

SDS-PAGE原理基于以下几个关键步骤：
1. 蛋白样品的准备：将待测蛋白样品与SDS（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质表面被负电荷包裹。

2. 样品加载和电泳过程：将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）中的孔洞中。

通常采用垂直电泳方式进行，将正电极和负电极连接至凝胶两端，通过电场使蛋白质向电泳方向迁移。

3. 分子分离：在电泳过程中，由于SDS的存在，样品中的蛋白质被完全解聚并带负电荷，使每个蛋白质分子的移动速率只与其相对分子质量成正比。

较小的蛋白质能够在凝胶中更快地迁移，较大的蛋白质则移动速率较慢。

4. 染色和可视化：电泳结束后，使用染色剂（如Coomassie蓝染色剂）将蛋白质染色，使其可见。

通过测量蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以估计蛋白质的相对分子质量。

总结：SDS-PAGE利用SDS使蛋白质解聚并带负电荷，在电泳过程中按照相对分子质量的大小分离蛋白质，通过染色和测量蛋白质的迁移距离来估计其相对分子质量。

3种进行基因工程表达目的蛋白质的分离纯化方法在基因工程研究中，蛋白质分离纯化是非常重要的一环。

下面将介绍三种常用的基因工程表达目的蛋白质分离纯化方法。

1. 亲和层析法：亲和层析法是一种常用的蛋白质纯化方法，基于特定配体与目标蛋白质之间的选择性结合。

通常，可以在目标蛋白质中引入一个标签序列，如融合标签或标签标记，使其与固定在纯化层析柱上的配体相互作用。

配体可以是金属离子、抗体、亲和剂或其他具有与目标蛋白质选择性相互作用的分子。

利用这种亲和层析柱进行分离纯化时，可以通过洗脱缓冲液中高浓度的竞争性配体或特定的环境条件来实现目标蛋白质的高效纯化。

2. 凝胶电泳法：凝胶电泳法是一种常用的蛋白质分离技术，根据蛋白质在电场中的迁移速率差异进行分离纯化。

通常，首先将表达目的蛋白质从细胞裂解物或培养基中提取出来，并用浓缩技术进行初步富集。

然后，将蛋白质样品加载到凝胶（如SDS-PAGE凝胶）中，通过应用电场分离蛋白质。

根据蛋白质的大小和电荷来进行分离，并用染色或质谱等方法进行检测和分析。

3. 逆流层析法：逆流层析法是一种有效的分离纯化方法，根据蛋白质在逆流梯度中的亲和性差异进行分离。

该方法可通过将纯化柱分为若干区域，每个区域都包含不同浓度的缓冲液，从而形成逆流梯度。

蛋白质溶液经过逆流层析柱时，蛋白质会在不同条件下与纯化柱表面相互作用，并在梯度中发生多次吸附和洗脱过程。

通过逆流层析的多次循环，可以逐步富集并纯化目标蛋白质。

综上所述，亲和层析法、凝胶电泳法和逆流层析法是基因工程表达目的蛋白质常用的分离纯化方法。

这些方法各具优势，可以根据目标蛋白质的性质和实验要求选择适合的方法，以获得高纯度的表达目的蛋白质。

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。

催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。

在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。

电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

百泰派克生物科技
sds-page鉴定目的蛋白质
SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种最常用的高分辨率分析分离
电泳技术。

电泳通过施加电场使带电分子在基质中移动，在这种技术中，影响带电分子迁移率的因素包括其本身的相对分子量、电荷以及结构等。

SDS-PAGE用阴离
子去污剂对待检测样品进行初始变性，赋予所有待测分子与其分子量成比例的负电荷，再结合聚丙烯酰胺凝胶可以消除结构以及电荷的影响，使待测物质仅根据其分子量的差异进行分离，常用于复杂DNA、RNA和蛋白质在内的大分子高分辨率分离
实验。

利用SDS-PAGE鉴定蛋白质时，既可以对单一蛋白质进行电泳分析也可以对蛋白混
合物进行鉴定。

样品中的蛋白质根据其相对分子质量大小进行迁移，在电泳结束后，不同分子质量的蛋白质分子被分离成不同的蛋白条带。

对于单一的蛋白质样品，可以用于其分子质量鉴定，同时还可验证其是否含有其他蛋白杂质；对于蛋白样品混合物来说，通过SDS-PAGE电泳可以分离混合样品中的不同组分，并对其相对分子
质量进行鉴定。

另外，根据电泳结束后蛋白条带的宽度可以粗略估计其含量的多少。

百泰派克生物科技使用Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra凝胶系统以及Thermo公司
最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪，结合nanoLC-MS/MS纳升色谱，提供基于SDS-PAGE和质谱的蛋白质鉴定服务技术包裹，可快速准确的鉴定各种蛋白样品
的相对分子量、纯度、结构、氨基酸组成及排列顺序等。

此外，百泰派克生物科技还可提供定制化的分析服务，满足不同的实验需求，欢迎免费咨询。

SDS-PAGE检测蛋白质纯度1．电泳的基本原理许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。

由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。

2．影响电泳的主要因素2.1 电泳介质的pH当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处于等电状态，即不向正极或负极移动。

当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。

因此，任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响，即决定两性物质的带电状态及其量，为了保持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH8．6的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。

2.2 缓冲液的离子强度离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。

如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层)使电脉速度减慢。

所以常用离子强度为0.02-0.2之间。

2.3 电场强度电场强度和电泳速度成正比关系。

电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。

如纸电泳的滤纸长15cm，两端电压（电势差）为150V，则电场强度为150/15=10V/cm，电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。

电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离。

2.4 电渗作用在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。

如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。

由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响，如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。

如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二者相加。

蛋⽩质的表达、纯化及检测-分⼦实验报告实验⽬的1.了解外源基因在⼤肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会⽤SDS-PAGE电泳法分离不同分⼦量的蛋⽩质3.学习通过亲和层析法纯化⽬的蛋⽩4.学会考马斯亮蓝染⾊法和蛋⽩质杂交法检测蛋⽩质实验原理1.外源基因在⼤肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac 操作⼦的启动⼦。

在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋⽩LacI与lac操作⼦结合，使外源基因不能表达；向培养基中加⼊诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋⽩变构失活，不能与lac操作⼦结合，外源基因就表达。

2.蛋⽩质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常⽤的定性分析蛋⽩质的电泳⽅式，特别是⽤于蛋⽩质纯度检测和测定蛋⽩质分⼦量。

其分离原理是根据蛋⽩质分⼦量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加⼊破坏了蛋⽩质的⼆级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋⽩质充分结合形成SDS-蛋⽩质复合物，稳定地存在于均⼀的溶液中，SDS与蛋⽩质结合后使SDS-蛋⽩质复合物上带有⼤量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从⽽使蛋⽩质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分⼦之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分⼦质量的⼤⼩，这样分离出的谱带也为蛋⽩质的亚基。

3.考马斯亮蓝法检测蛋⽩质：考马斯亮蓝是⼀种蛋⽩质染料，主要有R-250和G-250两种类型。

考马斯亮蓝可以和蛋⽩肽链中碱性氨基酸残基或芳⾹族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。

考马斯亮蓝R250多⽤于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋⽩质条带的染⾊；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝⾊，与蛋⽩质结合虽然⽐较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染⾊后为蓝⾊，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以⽤来对电泳条带染⾊。

4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按⼀定顺序连接在⼀起，融合阅读框架的表达产物是⼀个杂和蛋⽩。