微流控芯片技术的研究进展

微流控芯片的发展及制造工艺介绍微流控芯片的发展微全分析系统的概念是在1990年首欠由瑞士Ciba2Geigy 公司的Manz与Widmer提出的，当时主要强调了分析系统的“微”与“全”，及微管道网络的MEMS加工方法，而并未明确其外型特征。

次年Manz等即在平板微芯片上实现了毛细管电泳与流动。

微型全分析系统当前的发展前沿。

微流控分析系统从以毛细管电泳分离为核心分析技术发展到液液萃取、过滤、无膜扩散等多种分离手段。

其中多相层流分离微流控系统结构简单，有多种分离功能，具有广泛的应用前景。

已有多篇文献报道采用多相层流技术实现芯片上对试样的无膜过滤、无膜参析和萃取分离。

同时也有采用微加工有膜微渗析器完成质谱分析前试样前处理操作的报道。

流控分析系统从以电渗流为主要液流驱动手段发展到流体动力气压、重动、离心力、剪切力等多种手段。

直至今日，各国科学家在这一领域做出更加显着地成绩。

微流控技术作为当前分析科学的重要发展前沿，在研究与应用方面都取得了飞速的发展。

微流控芯片的原理微流控芯片采用类似半导体的微机电加工技术在芯片上构建微流路系统，将实验与分析过程转载到由彼此联系的路径和液相小室组成的芯片结构上，加载生物样品和反应液后，采用微机械泵。

电水力泵和电渗流等方法驱动芯片中缓冲液的流动，形成微流路，于芯片上进行一种或连续多种的反应。

激光诱导荧光、电化学和化学等多种检测系统以及与质谱等分析手段结合的很多检测手段已经被用在微流控芯片中，对样品进行快速、准确和高通量分析。

微流控芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统？微型反应器是芯片实验室中常用的用于生物化学反应的结构，如毛细管电泳、聚合酶链反应、酶反应和DNA 杂交反应的微型反应器等。

其中电压驱动的毛细管电泳（Capillary Electrophoresis ，CE）比较容易在微流控芯片上实现，因而成为其中发展最快的技术。

微流控芯片的设计与制备技术一、简介微流控芯片是一种集成了微型化的流体组件的芯片，可实现液体、气体和粒子在微尺度下的操控和操作。

这一技术广泛应用于生物医学、环境监测、化学分析等领域，在实现微型化、高通量和精准度方面具有显著优势。

本文将重点讲述微流控芯片的设计和制备技术。

二、微流控芯片的设计微流控芯片的设计涉及流体力学、微机电系统和材料科学等学科领域。

其基本设计原理是按照预定的流动路径和结构设计微通道和微腔室，并通过小孔、微泵和微阀等微流控元器件实现液体的操控和操作。

1、微流控芯片的结构设计微流控芯片的结构设计可分为两个层次，即微通道和微腔室的设计和单元操作单元的设计。

微通道和微腔室的设计需要考虑流体力学性质和结构复杂度，通道和腔室的形状、尺寸和流速等参数的选择直接影响到操作的效果。

单元操作单元的设计则需要考虑微流控元器件的种类及功能，包括小孔、微泵和微阀等多种元器件。

2、微流控芯片的模拟与仿真微流控芯片的设计过程中，需要对液体流动、气流流动和粒子运动等进行精确的模拟与仿真。

目前，常用的微流控芯片仿真软件包括COMSOL Multiphysics、ANSYS Fluent和LAMMPS等，它们可用于模拟和优化微流控芯片的设计方案。

三、微流控芯片的制备技术微流控芯片的制备技术包括芯片制备和微流控元器件的制备两个方面。

芯片制备主要涉及材料选择和制备工艺，微流控元器件的制备则包括小孔、微泵和微阀等多种器件。

1、芯片制备技术芯片制备的主要步骤包括模板制备、光刻、胶层、薄膜制备、微加工和封闭等。

微流控芯片的制备材料主要为玻璃、硅和聚合物等，制备工艺包括常用的热压和电子束激光微细孔加工等。

2、微流控元器件制备技术微流控元器件的制备技术主要有微泵、微阀和微孔加工技术等。

其中，微泵和微阀的制备是微流控芯片中的重要组成部分。

微泵的制备技术主要包括热膨胀、压电驱动、磁性驱动和电化学驱动等多种方式。

微阀的制备技术包括机械阀、压电阀和电化学阀等多种类型。

微流控技术在生物医学中的应用研究在当今生物医学领域，科技的飞速发展为疾病的诊断、治疗和研究带来了前所未有的机遇。

其中，微流控技术作为一项新兴的前沿技术，正逐渐展现出其巨大的应用潜力。

微流控技术是一种在微米尺度空间对流体进行操控的技术，它将生物、化学、医学等领域的分析过程集成到一块微小的芯片上，实现了对微量流体的精确控制和处理。

微流控技术在生物医学中的应用极为广泛，其中一个重要的应用领域是疾病诊断。

在传统的诊断方法中，样本采集、处理和分析往往需要多个步骤和大型仪器设备，不仅操作繁琐，而且耗时较长。

而微流控芯片能够将这些步骤集成在一个小小的芯片上，实现从样本进样、预处理到检测的一体化操作。

例如，在血液检测中，微流控芯片可以快速分离血液中的细胞和血浆，对特定的生物标志物进行高灵敏度和高特异性的检测。

对于癌症等疾病的早期诊断，微流控技术能够检测到极微量的肿瘤标志物，大大提高了诊断的准确性和及时性。

在药物研发方面，微流控技术也发挥着重要作用。

药物筛选是新药研发中的关键环节，传统的方法往往效率低下、成本高昂。

微流控芯片可以模拟人体器官的微环境，构建细胞培养的微体系，实现对药物的高通量筛选。

通过在芯片上培养细胞，并控制药物的浓度和作用时间，可以更准确地评估药物的疗效和毒性。

此外，微流控技术还能够用于药物的合成和控释，精确控制药物的释放速率和剂量，提高药物的治疗效果。

细胞研究是生物医学领域的重要课题之一，微流控技术为细胞研究提供了全新的手段。

通过微流控芯片，可以精确地控制细胞的生长环境，实现单个细胞的捕获、培养和分析。

这对于研究细胞的生理、病理过程以及细胞间的相互作用具有重要意义。

例如，在干细胞研究中，微流控技术可以模拟干细胞的微环境，促进干细胞的分化和增殖。

同时，还可以利用微流控技术对癌细胞的迁移和侵袭能力进行研究，为癌症的治疗提供新的思路和方法。

在免疫分析领域，微流控技术也有着出色的表现。

免疫反应是生物体抵御病原体入侵的重要机制，对免疫反应的检测对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。

微流控芯片电泳的研究进展于冰;任玉敏;丛海林;陈昭晶;张立新;马真真【摘要】The latest progress of electrophoresis on microfluidicchips(EMC)is reviewed in this article. The preparation mechanisms, surface modifications and properties of different materials in EMC are compared. The sampling, separation and detection systems of EMC with different structures, as well as their applications in analysis of fluorescent substance, metallic ion, sugar, medicine, nucleic acid, DNA, amino acid, polypeptide and protein, are summarized. The future development of EMC is also forecasted.%该文综述了微流控芯片电泳的制备、结构和应用,比较了不同材料微流控芯片电泳的制备机理、表面改性和性能特点,归纳和总结了不同结构微流控芯片电泳的进样、分离和检测系统以及不同类型微流控芯片电泳在荧光物质、金属离子、糖、药物、核酸、DNA、氨基酸、多肽和蛋白质分析中的应用,并对微流控芯片电泳的未来发展方向做了展望.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2011(030)009【总页数】7页(P1067-1073)【关键词】微流控芯片电泳;微流通道;表面修饰;微加工制备【作者】于冰;任玉敏;丛海林;陈昭晶;张立新;马真真【作者单位】青岛大学化学化工与环境学院,山东青岛266071;青岛大学纤维新材料与现代纺织国家重点实验室培育基地,山东青岛266071;青岛大学化学化工与环境学院,山东青岛266071;青岛大学化学化工与环境学院,山东青岛266071;青岛大学化学化工与环境学院,山东青岛266071;青岛大学化学化工与环境学院,山东青岛266071;青岛大学化学化工与环境学院,山东青岛266071【正文语种】中文【中图分类】TH832.5;G353.11微流控芯片电泳(EMC)技术产生于20世纪90年代，由Manz等［1］首先提出“微全分析系统”的概念。

光刻机对微流控芯片制造的应用研究微流控芯片作为一种小型化、高效化的芯片技术，广泛应用于生物医学、化学分析和微流体物理等领域。

而光刻机作为集成电路制造的重要工具，也逐渐在微流控芯片的制造中发挥着重要的角色。

本文旨在研究光刻机在微流控芯片制造中的应用，并探讨其对该领域的影响。

一、光刻技术在微流控芯片制造中的应用光刻技术是一种通过光照和化学反应将芯片上的图案转移到硅片上的方法。

在微流控芯片制造中，光刻技术主要应用于芯片上的流道和微结构的制作。

通过利用光刻机的高分辨率、高精度和高效率特点，可以实现微流控芯片上复杂结构的精确制备。

1. 光刻机在微流控芯片制造中的步骤光刻机制造微流控芯片的过程主要包括图案设计、准备硅片、曝光、显影和退火等步骤。

首先，根据微流控芯片的需要，设计出相应的图案，并将图案转换为光刻机可以识别的格式。

然后，将硅片进行表面处理，以保证图案的精确传输。

接下来，利用光刻机将图案投射到硅片上，并进行曝光处理。

曝光结束后，通过显影和退火等工艺步骤，去除未曝光区域的光刻胶和修饰硅片表面，最终得到所需的微流控芯片结构。

2. 光刻技术的优势及挑战与传统微加工方法相比，光刻技术在微流控芯片制造中具有许多优势。

首先，光刻技术可以实现高分辨率和高灵敏度的图案转移，使得微流控芯片上的微结构更加精确和细致。

其次，光刻机可以实现大面积、高通量的生产，提高微流控芯片的制造效率和产能。

此外，光刻技术还具有良好的可重复性和稳定性，保证了微流控芯片的一致性和可靠性。

然而，光刻技术在微流控芯片制造中也面临一些挑战。

首先，光刻胶的选择和配方需要根据不同的应用需求进行优化，以获得更好的曝光效果和更高的图案分辨率。

其次，曝光过程中的温度和湿度等环境因素需要进行严格控制，以确保曝光的稳定性和一致性。

此外，光刻机的显影和退火等工艺参数也需要精细调控，以保证微流控芯片结构的质量和可用性。

二、光刻技术对微流控芯片制造的影响光刻技术在微流控芯片制造中的应用，对芯片的性能和功能起着重要的影响。

玻璃基微流控芯片系统加工
玻璃基微流控芯片系统加工是一种具有潜在广泛应用前景的技术。

它不仅可以有效地
实现微流体分析，而且具有良好的隔离性，可以有效地提高工作室的生产效率，减少漏洞
和可维护性。

本文旨在总结玻璃基微流控芯片系统加工技术的发展、应用前景以及在微流
控领域的关键技术。

玻璃基微流控芯片系统加工技术目前已经进入到研发和技术落地的关键阶段。

在技术
发展方面，目前主要以IC原型工艺为主，已经取得了较大的进展。

其工作原理是通过自
动化设备控制，使用特定的化合物成形技术，将独特的分子相容材料固定在更细小的玻璃
基片上，形成可微型化的离子通道、电路和微流器件。

以此为基础，研发人员可以在半导
体芯片表面上形成极细小的微结构，并通过这些微结构实现高灵敏度的微液体和微气体的
分析功能。

应用前景要实现实际的应用，必须克服当前所存在的诸多问题，例如微流控芯片受到
外界环境的隔离性、抗干扰性和寿命等方面的影响。

此外，玻璃基微流控芯片系统加工技
术还将推动液体探测技术得到更大的发展，给药学、生物学研究和医学实验室的分析工作
带来更多的便利性。

未来，玻璃基微流控芯片系统加工技术还将成为微流控领域的关键技术，有望在医疗、生物和环境等领域实现广泛应用。

针对目前微流控技术在对材料选择、精准成形、可行性
实现和可靠性等方面所存在的问题，确保芯片具有更高灵敏度等优点，国内外专家将加强
化学、物理和微纳米材料相关技术的研发，以期在真空化、精确成形和小型化方面取得有
意义的进展。

MEMS技术在微流控芯片中的应用近年来，激光技术、微纳加工技术、生物传感技术等一系列新兴技术的迅速发展，推动微流控芯片技术不断取得新的进展。

微流控芯片是一种将微小液滴、细胞、粒子等进行微小操作的芯片，已经在药物筛选、病毒检测、细胞捕获和分离等多个领域得到应用。

其中，MEMS技术是微流控芯片中不可或缺的技术之一，本文将探讨MEMS技术在微流控芯片中的应用。

一、MEMS技术在微流控芯片中的基本原理MEMS（Micro-Electro-Mechanical System）技术是指采用微电子加工技术制造微小的机械、电子、光学和磁学元件或系统的技术。

在微流控芯片中，MEMS技术主要用于制造微型流体控制器件，如微型泵、微型阀门、微通道等。

通过MEMS制造的微流体控制器件，可以在微小尺度内实现精确灵活的流体操控和分析。

以微型泵为例，其原理是利用电压控制微小压电膜的膨胀和收缩，从而产生微流体引导和输送的效果。

而微型阀门则利用电极控制膜片的抬升和下压，从而实现流体的开关控制。

通过MEMS技术的微流体控制器件，可以实现精确的微小流体操作和分析，为微流控芯片的应用打下坚实的基础。

二、MEMS技术在微流控芯片中的应用领域1.生物学应用MEMS技术在生物学应用方面的威力凸显。

通过MEMS技术制造微型通道、微型泵和微型阀门，可以实现微小液滴、细胞、粒子等的分离、操控和检测。

同时，MEMS技术也可以制造微型生物芯片，实现分子检测、蛋白质分析、细胞分离等多项生物实验。

2.医学应用MEMS技术在医学应用中得到广泛应用。

微流控芯片可以显著提高药物筛选的效率，同时也能对药物对病原微生物生成的影响进行研究。

针对疾病诊断方面，可以通过微流控芯片进行肿瘤细胞检测、糖尿病病人血糖监测等，为临床医学提供更为精准的检测手段。

3.环境应用MEMS技术在环境应用领域的应用正在不断拓展。

利用微流控芯片制备环境检测芯片，可以实现对污染物的迅速监测和分析。

微流控系统的研究与应用微流控技术是指在微尺度下对流体进行控制和处理的一种技术。

随着微纳技术的进步，微流控技术在生物、医学、化学等领域得到了广泛的应用。

在这些领域中，微流控系统已成为研究和应用的重要手段。

一、微流控系统的基础原理微流控系统的基本结构是一个微通道网络。

通过微加工和微制造技术，将微流通道、微混合器、微泵、微阀门等器件集成在一起，实现对流体的精确操控。

在微流控系统中，流体运动的特点主要由两个因素决定：粘性和惯性。

当流体在微通道中流动时，流体会受到通道表面摩擦力的影响，因此流体呈现出高粘性的特点。

同时，由于流体速度较慢，但流动距离较长，惯性力作用相对微弱。

因此，微流控系统需要考虑这两个因素对流体运动的影响。

二、微流控系统的应用1. 生物医学领域微流控系统在生物医学领域的应用非常广泛，可以用于实验室的分析和诊断。

例如，利用微流控芯片可以对病毒、细菌等微生物进行快速检测和筛选。

此外，还可以利用微流控芯片进行细胞培养和细胞捕获，对肿瘤细胞等研究有重要意义。

2. 化学领域在化学合成中，微流控系统可以实现前处理、反应、分离等多个步骤的集成。

由于微流通道的表面积大，流体与固体之间接触的面积也大，因此可以提高反应的效率和产率，同时可以降低反应所需的溶剂用量。

3. 波动控制领域微流控系统还可以应用于波动控制领域。

由于微流通道在纵向和横向上都有微小的尺寸变化，使得流体在通道中流动时会受到反射、干涉等物理现象的影响，从而形成波动。

利用这个特性，可以实现光、声波的分离和过滤等功能。

三、微流控系统的研究进展1. 微流控芯片的设计和制造微流控芯片的设计和制造是微流控技术研究的重要内容。

微流控芯片的设计需要考虑不同的应用场景和流体特性，同时还要考虑器件的制造和组装难度。

在器件制造过程中，需要采用微加工和微制造技术，例如光刻、电化学加工、激光加工等方式来实现微流通道的制造和组装。

2. 微流控系统的流体力学模拟和优化微流控系统的流体力学模拟和优化是微流控技术研究的另一个重要方向。

微流控芯片制备工艺研究及应用一、前言微流控芯片是近年来发展较快的一种微流体控制技术，具有样品用量小、反应时间短、操作方便等优点，被广泛应用于化学分析、生物检测、药物筛选等领域。

本文旨在介绍微流控芯片的制备工艺及其应用。

二、微流控芯片制备工艺微流控芯片的制备过程可以分为两个环节，即模具制备和芯片加工。

1. 模具制备微流控芯片制备的第一步就是模具制备。

在制备模具时需要选择合适的材料，通常使用的是光刻胶、光刻硅及深刻蚀金属材料。

然后，采用光刻技术，通过曝光、显影等步骤，将芯片的设计图案转移到模具上，最后利用电极化学加工等工艺，制成微流控芯片的模具。

2. 芯片加工模具制备完成后，就需要进行芯片加工。

首先，需要选取合适的材料，如玻璃、硅片等。

然后，通过热压、蒸镀、离子注入等工艺，将模具上的结构转移到芯片上，形成芯片的微结构。

最后，对芯片进行清洗、封装等工艺，制成完整的微流控芯片。

三、微流控芯片应用微流控芯片的应用领域十分广泛，这里仅介绍其中几个重要的应用领域。

1. 化学分析微流控芯片可以实现对微小样品的检测和分析，对于化学分析领域来说具有极大的应用前景。

目前已有许多研究团队将微流控芯片应用于毒品检测、水质监测、重金属检测等领域，取得了良好的效果。

2. 生物检测微流控芯片与生物学的结合也是十分密切的。

利用微流控芯片可以很方便地进行基因检测、蛋白质检测、细胞分析等生物实验。

与传统实验相比，微流控芯片具有实验时间短、反应速度快等优点，而且不易受外界环境干扰。

3. 药物筛选微流控芯片在药物筛选方面也有着广泛的应用。

微流控芯片拥有微型反应器、组织模型等优势，可以快速筛选出特定药物，具有很高的筛选效率和准确度。

这对于新药研发具有极大的意义。

四、总结微流控芯片技术带来了分析、检测、筛选等领域的革新，具有广泛的应用前景。

在制备过程中需要注意模具制备的工艺以及材料选择问题，芯片的加工工艺也有多种选择。

在应用方面，微流控芯片可以广泛应用于化学分析、生物检测、药物筛选等领域，有着十分重要的意义。

微流控芯片技术及其应用微流控芯片技术是一种基于微纳米加工技术制造的微型芯片，能够精确控制微流体在芯片内部的流动。

该技术结合了微流体力学、微电子学和生物学等学科，广泛应用于药物筛选、基因分析、细胞分析和生物传感等领域。

本文将重点介绍微流控芯片技术的原理、制备方法以及其应用领域。

一、微流控芯片技术的原理与制备方法微流控芯片技术的核心是利用微纳米加工技术在芯片上制造一系列微小的通道和结构，以便精确控制微流体的流动。

其原理基于微流体力学，通过精确调控流体的压力、流速和流量，实现对微流体的精确控制。

微流控芯片通常由微流体通道、微阀门、微泵和微混合器等功能单元组成。

微流控芯片的制备方法主要有两种：玻璃基质制备和聚合物基质制备。

玻璃基质制备方法包括湿法刻蚀、热压刻蚀和激光加工等，适用于制备微流道尺寸较大的芯片。

聚合物基质制备方法则包括胶印、光刻和热熔连接等，适用于制备尺寸较小且需要高精度的芯片。

二、微流控芯片技术的应用领域1. 药物筛选：微流控芯片技术可以模拟人体的生理环境，实现对药物在体内代谢和毒性的评估。

通过微流控芯片，可以高通量地筛选出具有潜在药效的化合物，加快新药研发的速度。

2. 基因分析：微流控芯片技术可以实现对基因的高通量检测和分析。

通过在微流控芯片上构建合适的反应体系和探针，可以实现对DNA 序列、基因表达和基因突变等的快速检测和分析。

3. 细胞分析：微流控芯片技术可以实现对细胞的高通量单细胞分析。

通过在芯片上构建微小的细胞培养室和检测通道，可以实现对细胞的培养、分离、操控和检测等操作，为研究细胞的功能和行为提供了有力工具。

4. 生物传感：微流控芯片技术可以实现对生物分子的高灵敏检测。

通过在芯片上固定特定的生物分子（如抗体、酶和核酸等），可以实现对目标分子的选择性捕获和灵敏检测，广泛应用于生物传感、环境监测和临床诊断等领域。

5. 化学反应：微流控芯片技术可以实现对化学反应的高效控制和优化。

通过在芯片上构建微小的反应室和混合器，可以实现对反应底物的精确控制和混合，提高反应速率和产物纯度，广泛应用于有机合成、催化反应和分析化学等领域。

微流控芯片中的流体流动与改性行为研究引言微流控芯片是一种利用微细通道结构来控制和操纵微小液滴和流体流动的技术。

随着微纳技术的发展，微流控芯片在生物医学、化学分析、微流体系统等领域得到了广泛应用。

在微流控芯片中，流体流动行为的研究和改性行为的调控成为了研究人员关注的焦点。

微流控芯片中的流体流动微流控芯片中的流体流动是由于微通道内部的流体介质在微尺度下的运动。

微通道的尺寸通常在几微米到几毫米之间，与常规流体流动相比，具有比较显著的微观效应。

微通道流动的流体力学行为在微流控芯片中，流体流动的力学行为主要由黏性流动和惯性流动来描述。

•黏性流动：在微通道内，流体的黏性作用相较于惯性作用更为显著，黏性流动是流体在微通道中由于粘性力的作用而产生的流动行为。

•惯性流动：在高速流动或流体具有较大的惯性时，惯性力会对流动产生显著影响，此时流动行为可由惯性流动来描述。

微通道内流体的流动特性微流道中的流体流动具有以下几个特点：mina流动：在微通道内，流体呈现分层流动，即在通道截面内形成了多个分层流带，其中每一层流体的速度和流动方向都不同。

不同层流体之间通过黏性作用力保持着相对的平滑移动。

2.壁面效应：由于微通道的尺寸较小，相对于传统流道，壁面效应在微流道内更加显著，主要表现为流体在与壁面接触区域存在较大的速度梯度和剪切应力。

3.封闭效应：微通道中的流体流动是由于应力平衡导致的，更多的是由于封闭在微通道内的流体导致的，因此在微通道设计中需要考虑流体的稳定性和流体的隔离性。

微流控芯片中的流体改性行为在微流控芯片中，研究人员不仅关注流体的流动行为，还探索了一系列流体改性行为，以实现对流体的调控和控制。

微流控芯片中的流体混合微流控芯片的一个主要应用是实现不同液体的混合，从而实现对反应过程的控制和操纵。

通过设计合适的微通道结构和流体控制方法，可以实现快速、均匀的流体混合，提高反应效率和反应速度。

微流控芯片中的流体分离另一个重要的应用是实现流体的分离。

微流控技术的发展历史标题：微流控技术的发展历史及其应用进展引言微流控技术，作为一种新兴的交叉学科，起源于20世纪90年代，是将生物、化学、物理、工程等多种科学领域知识深度融合，通过精确控制微尺度流体在微米级别通道内的流动、反应和检测的一种先进技术。

它的诞生与发展对生命科学、临床医学、环境监测等领域产生了深远影响。

一、微流控技术的起源与发展历程1. 萌芽阶段（20世纪50-70年代）微流控技术的起源可以追溯到20世纪50年代至70年代，当时科学家们开始研究如何在微小空间内操纵和控制流体，这一时期的主要成果包括微泵、微阀以及用于液相色谱分析的微通道等基础元件的开发。

2. 形成与初步发展（20世纪80年代-90年代）进入80年代，随着半导体加工技术和MEMS（微电子机械系统）技术的进步，微流控芯片的概念被提出并得到初步实现。

1990年，Whitesides等人首次提出了“Lab-on-a-Chip”（LOC）的概念，标志着微流控技术正式步入快速发展轨道。

3. 快速发展阶段（21世纪至今）进入21世纪以来，微流控技术进入了高速发展的黄金时期。

此阶段的研究重点转向了复杂功能化微流控系统的构建，如集成式微反应器、细胞分选及操控系统、单分子检测平台等。

同时，该技术的应用范围也从最初的生物医学领域拓展到了环境监测、食品安全、材料科学等多个领域。

二、微流控技术的关键里程碑事件1. 微流控芯片的发明2. LOC概念的提出和实验室芯片的初步实现3. 数字微流控技术的出现，实现了对微流体的精准控制4. 单细胞分析和单分子检测技术在微流控平台上的突破5. 三维微流控系统的构建和生物3D打印技术的发展结论回顾微流控技术的发展历程，我们可以看到其从理论构想到实际应用的不断深化和扩展。

如今，微流控技术已经成为科研创新的重要工具，并有望在未来继续引领生物医学、纳米科技、精准医疗等领域取得新的突破。

随着更多跨学科研究成果的涌现和技术瓶颈的解决，微流控技术的前景将更加广阔且充满无限可能。

２０２１年９月Ｖｏｌ．３９Ｎｏ．９Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２０２１ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ９６８ ９８０庆贺张玉奎院士八十华诞专辑（Ｉ）㊃专论与综述ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０２１．０７００５收稿日期：２０２１⁃０７⁃０７∗通讯联系人．Ｔｅｌ：（０４１１）８４３７９０５９，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｈｑｉｎ＠ｄｉｃｐ．ａｃ．ｃｎ．基金项目：国家重点研发项目（２０１７ＹＦＢ０４０５４０４）；国家自然科学基金项目（２１６０７１５１，３１６７１０３８，８１８０３４９２）．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｔｅｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＫｅｙＲ＆ＤＰｒｏｇｒａｍｏｆＣｈｉｎａ（Ｎｏ．２０１７ＹＦＢ０４０５４０４）；ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（Ｎｏｓ．２１６０７１５１，３１６７１０３８，８１８０３４９２）．微流控技术在外泌体分离分析中的研究进展陈雯雯１，２，㊀甘忠桥１，２，㊀秦建华１，２∗（１．中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连１１６０２３；２．中国科学院大学，北京１０００４９）摘要：外泌体是一类由细胞分泌的含有脂质㊁蛋白㊁核酸等多种物质的纳米级囊泡，主要参与细胞间的物质交换及信息传导，与多种疾病的发生发展密切相关㊂对外泌体进行深入研究，理解其生物学功能，对疾病诊断与治疗具有重要意义㊂由于外泌体尺寸较小且密度和体液接近，想要对复杂生物样本中的外泌体进行分离与分析十分困难㊂传统的外泌体分离方法如超速离心㊁超滤等大都需要借助大型仪器设备，且耗时长㊁操作复杂㊂因此迫切需要开发高效㊁便捷的外泌体分离检测手段㊂微流控技术因其微型化㊁高通量㊁可集成等特点，为外泌体的分离分析提供了一个新的平台㊂该文主要对近年来微流控技术在外泌体分离分析相关领域的研究进展进行了综述㊂重点从外泌体物理特性和生化特性两个角度出发，介绍了微流控芯片技术用于外泌体分离领域的主要原理㊁策略和方法㊂此外，还介绍了微流控技术与荧光㊁电化学传感㊁表面等离子体共振等多模态检测方法结合，实现外泌体一体化分析的新进展㊂最后，该文分析了目前微流控技术用于外泌体分离检测存在的挑战，并对其发展趋势和前景进行了展望㊂随着微流控外泌体分离分析装置的不断微型化㊁集成化㊁自动化，微流控芯片技术将在外泌体分离㊁生化检测㊁机制研究等方面将发挥越来越重要的作用㊂关键词：外泌体；微流控技术；分离分析中图分类号：Ｏ６５８㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀文章编号：１０００⁃８７１３（２０２１）０９⁃０９６８⁃１３ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｅｘｏｓｏｍｅｓＣＨＥＮＷｅｎｗｅｎ１，２，ＧＡＮＺｈｏｎｇｑｉａｏ１，２，ＱＩＮＪｉａｎｈｕａ１，２∗（１．ＤａｌｉａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＰｈｙｓｉｃｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，１１６０２３，Ｃｈｉｎａ；ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｘｏｓｏｍｅｓａｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ⁃ｂｏｕｎｄｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓｔｈａｔａｒｅｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｍｏｓｔｔｙｐｅｓｏｆｃｅｌｌｓａｎｄｃｏｎｔａｉｎａｒａｎｇｅｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｌｉｐｉｄｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ，ｅｔｃ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇｅｖｉｄｅｎｃｅｓｓｈｏｗｔｈａｔｅｘｏｓｏｍｅｓｃａｎａｆｆｅｃｔｃｅｌｌｓ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔａｔｕｓｂｙｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｓｓａｇｅｓａｍｏｎｇｃｅｌｌｓ．Ａｓｓｕｃｈ，ｅｘｏｓｏｍｅｓａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｖａｒｉｏｕｓｐａｔｈｏ⁃ｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｓｔｕｄｙｉｎｇｅｘｏｓｏｍｅｓｉｓｏｆｇｒｅａｔｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｆｏｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｉｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｒｅｌｅｖａｎｃｅｔｏｄｉｓｅａｓｅｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｓｅｐａｒａｔｅａｎｄａｎａｌｙｚｅｅｘｏｓｏｍｅｓｄｕｅｔｏｔｈｅｉｒｓｍａｌｌｓｉｚｅ，ａｎｄｂｅｃａｕｓｅｔｈｅｉｒｄｅｎｓｉｔｙｉｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈａｔｏｆｂｏｄｉｌｙｆｌｕｉｄｓ．Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｎｄｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎａｒｅｔｉｍｅ⁃ｃｏｎｓｕｍｉｎｇａｎｄｒｅｑｕｉｒｅｅｘｐｅｎｓｉｖｅｅｑｕｉｐｍｅｎｔ．Ｏｔｈｅｒｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｅｘｏｓｏｍｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ⁃ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｓ，ａｒｅｅｘｐｅｎｓｉｖｅａｎｄｒｅｌｙｈｅａｖｉｌｙｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ⁃ｂａｓｅｄｍｅｔｈ⁃ｏｄｓｄｏｎｏｔｙｉｅｌｄａｃｃｅｐｔａｂｌｅｐｕｒｉｔｙｆｏｒｄｏｗｎｓｔｒｅａｍａｎａｌｙｓｉｓ，ｄｕｅｔｏｐｏｌｙｍｅｒｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｔｈｕｓ，ｕｒｇｅｎｔｄｅｍａｎｄｅｘｉｓｔｓｆｏｒａｐｏｒｔａｂｌｅ，ｓｉｍｐｌｅ，ａｆｆｏｒｄａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｘｏｓｏｍｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｆｅｒｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ㊀第９期陈雯雯，等：微流控技术在外泌体分离分析中的研究进展ｅｘｏｓｏｍｅｓ，ｗｉｔｈｓｅｖｅｒａｌｒｅｍａｒｋａｂｌｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｌｏｗｓａｍｐｌｅｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ，ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，ａｎｄｅａｓｙｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｃｕｒｒｅｎｔｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｔｒａｔ⁃ｅｇｉｅｓｆｏｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｉｎｏｕｒｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏｅｘｏｓｏｍｅｓｅｐａ⁃ｒａｔｉｏｎ，ｗｅｄｉｖｉｄｅｅｘｉｓｔｉｎｇｓｅｐａｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｉｎｔｏｔｗｏｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ．Ｃａｔｅｇｏｒｙｏｎｅｉｓｂａｓｅｄｏｎｅｘｏｓｏｍｅｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄｉｎｃｌｕｄｅｓｍｅｍｂｒａｎｅｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｎａｎｏ⁃ｃｏｌｕｍｎａｒｒａｙｓｏｒｔｉｎｇ，ａｎｄｐｈｙｓｉｃａｌｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｏｔｈｅｒｉｓｉｍｍｕｎｅｃａｐｔｕｒｅ，ｗｈｉｃｈｉｓｂａｓｅｄｏｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒ⁃ｉｓｔｉｃｓｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓ，ａｎｄｉｎｃｌｕｄｅｓｆｉｘｅｄｂａｓｅｉｍｍｕｎｅｃａｐｔｕｒｅａｎｄｕｎｆｉｘｅｄｂａｓｅｉｍｍｕｎｅｃａｐｔｕｒｅ．Ｉｎｏｕｒｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏｅｘｏｓｏｍｅａｎａｌｙｓｅｓ，ｓｏｍｅｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｍｅｔｈｏｄｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ，ｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｒｅｂｒｉｅｆｌｙｄｅｓｃｒｉｂｅｄ．Ｓｏｍｅｎｅｗｓｙｓｔｅｍｓ，ｗｈｉｃｈｃｏｍｂｉｎｅｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗｉｔｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｅｎｓｉｎｇ，ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ｏｒｏｔｈｅｒｍｕｌｔｉｍｏｄａｌａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓａｒｅｔｈｅｎｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎｄｅｔａｉｌ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｆａｃｅｄｂｙｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｉｍｐｒｏｖｉｎｇｅｘｏｓｏｍｅｐｕｒｉｔｙａｎｄｍａｋｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓｍｏｒｅｐｏｒｔａｂｌｅａｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓｆｏｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｓｉｎｔｈｉｓａｒｅａａｒｅａｌｓｏｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｗｉｔｈｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍｉｃｒｏ／ｎａｎｏ⁃ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ｎｅｗｍａｔｅｒｉａｌｓ，ａｎｄｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｅｘｏｓｏｍｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｓｗｉｌｌｂｅｃｏｍｅｓｍａｌｌｅｒ，ｍｏｒｅｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ，ａｎｄｍｏｒｅａｕｔｏｍａｔｅｄ．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗｉｌｌｐｌａｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｅｘｏｓｏｍｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓ．引用本文：陈雯雯，甘忠桥，秦建华．微流控技术在外泌体分离分析中的研究进展．色谱，２０２１，３９（９）：９６８－９８０．ＣＨＥＮＷｅｎｗｅｎ，ＧＡＮＺｈｏｎｇｑｉａｏ，ＱＩＮＪｉａｎｈｕａ．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｃｈｉ⁃ｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２０２１，３９（９）：９６８－９８０．图１㊀外泌体形成及组成示意图［１］Ｆｉｇ．１㊀Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓ［１］Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｘｏｓｏｍｅｓ；ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ㊀㊀外泌体是一类由细胞分泌的含有脂质㊁蛋白㊁核酸等多种物质的纳米级囊泡，其尺寸为３０ １５０ｎｍ［１－３］（见图１）㊂外泌体在人体中分布广泛，人体的外周血㊁尿液㊁乳汁㊁羊水等体液中均含有外泌体［４，５］㊂因外泌体可携带蛋白㊁运送ＲＮＡ，其在人体中的角色主要包括物质的传递以及信息的传导两个大方面［６，７］㊂据此，人们将外泌体分为两种类型，第一种为有免疫活性的外泌体，其主要在抗原呈递和共刺激中发挥作用，第二种则是含有数量可观的ＲＮＡ并可介导细胞间的遗传物质交流的外泌㊃９６９㊃色谱第３９卷体［８，９］㊂外泌体与细胞的作用方式主要包括通过受体与靶细胞相互作用，激活下游细胞内的信号，以及直接与细胞膜融合从而将外泌体的膜蛋白整合到细胞浆膜或者是通过内吞作用将其转运分子传递至靶细胞的胞浆内㊂随着研究的深入，人们发现外泌体在适应性免疫［１０，１１］㊁炎症过程㊁胚胎形成［１２］㊁肿瘤的发生与发展过程［１３，１４］中均发挥了重要的作用㊂以肿瘤为例，外泌体可以通过调节免疫功能，促进肿瘤血管新生以及肿瘤转移，或者直接作用于肿瘤细胞影响肿瘤进展［１５－１８］，因而外泌体获得了越来越多科学工作者的关注［１９］㊂㊀㊀外泌体尺寸较小且其密度和体液接近，想要精准地对外泌体进行分离与检测十分困难㊂在过去的十几年中，微流控芯片技术因其具有微型化㊁高通量㊁可集成及低消耗等特点，为外泌体的精准分离分析提供了一种潜在平台㊂本文主要介绍了微流控芯片技术在外泌体分离分析相关研究领域的进展，并对其发展前景予以展望㊂表１㊀不同外泌体分离方法的比较Ｔａｂｌｅ１㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅｐａｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓＳｅｐａｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓＳａｍｐｌｅｖｏｌｕｍｅＳａｍｐｌｅＡｄｖａｎｔａｇｅｓＤｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓＵｌｔｒａ⁃ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｓｉｚｅ，ｄｅｎｓｉｔｙｌａｒｇｅｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉ⁃ｕｍ，ｕｒｉｎｅ，ｅｔａｌ．ｗｉｔｈｏｕｔａｄｄｉｔｉｏｎａｌｒｅ⁃ａｇｅｎｔｓｔｉｍｅｃｏｎｓｕｍｉｎｇ，ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｈｉｇｈｓｈｅａｒｓｔｒｅｓｓＵｌｔｒａｆｉｌｔｅｒｓｉｚｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｌａｒｇｅｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉ⁃ｕｍ，ｕｒｉｎｅ，ｅｔａｌ．ｗｉｔｈｏｕｔａｄｄｉｔｉｏｎａｌｒｅ⁃ａｇｅｎｔｓｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｗｉｔｈｓｉｍｉｌａｒｓｉｚｅ，ｈｉｇｈｓｈｅａｒｓｔｒｅｓｓＩｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅａｎｔｉｇｅｎ⁃ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅａｃｔｉｏｎｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｓｍａｌｌｕｒｉｎｅ，ｂｌｏｏｄ，ｅｔａｌ．ｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｅｘｐｅｎｓｉｖｅ，ｒｅｌｙｈｅａｖｉｌｙｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ⁃ｐｏｌｙｍｅｒｒｅａｃｔｉｏｎｌａｒｇｅｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉ⁃ｕｍ，ｕｒｉｎｅ，ｅｔａｌ．ｃｈｅａｐ，ｅａｓｙｔｏｏｐｅｒ⁃ａｔｅｐｏｌｙｍｅｒｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ，ｌｏｗｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｄｉｆ⁃ｆｅｒｅｎｔｄｅｓｉｇｎｓｍａｌｌｂｌｏｏｄ，ｕｒｉｎｅ，ｐｒｅ⁃ｃｉｓｅｓａｍｐｌｅｓｆｉｘａｂｌｅ，ｉｎｔｅｇｒａｂｌｅｓｍａｌｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅ，ｃｏｍｐｌｅｘｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ１㊀现有的外泌体分离方法㊀㊀外泌体的高效分离与富集是对其研究的前提条件，目前较为常用的外泌体分离方法主要有超速离心㊁超滤㊁免疫亲和捕获㊁聚合物共沉淀以及基于微流控技术的外泌体分离方法等５种（见表１）㊂１．１㊀超速离心法㊀㊀超速离心［２０］分离外泌体是通过离心力作用使不同密度㊁大小的物质分离开来㊂主要可以分为两类：一类为差速离心，一类为密度梯度离心㊂㊀㊀差速离心即通过改变离心的速度，从而改变离心力的大小，使不同密度的物质分级分离㊂在分离外泌体时，便是通过不断提高离心机的转速，先将细胞及细胞碎片分离出来，最后再将尺寸较小的外泌体分离出来㊂㊀㊀而密度梯度离心则是使用一种密度能形成梯度（在离心管中其密度从上到下连续增高）又不会使所分离的物质凝聚或失活的溶剂系统对样本进行分离的方法㊂离心后各物质颗粒能够按其各自的比重平衡在相应的统计密度中形成区带，较为常用的密度梯度溶剂是蔗糖㊂实验结果表明，当采用蔗糖为梯度溶剂时，样品中的外泌体将在１ １３ １ １９ｇ／ｍＬ的密度范围内富集［２１］㊂采用超速离心法通常较为耗时，且对设备依赖程度较高，以离心力为驱动力还有可能对囊泡造成损害，导致外泌体的破碎与损失㊂１．２㊀超滤法㊀㊀超滤［２２］即在一定的压力作用下，使待分离液体通过具有一定孔径的特制薄膜，尺寸小于薄膜孔径的物质将通过薄膜，而尺寸大于薄膜孔径的物质将被截留在薄膜上㊂外泌体的尺寸一般为４０ １００ｎｍ，因而可以通过利用不同截留尺寸的超滤膜将外泌体从样品中分离出来㊂使用超滤法分离外泌体操作简单，但是超滤所使用的压力可能会导致囊泡的形变和破裂，且膜孔易堵塞，使用该分离方法最终结果可能导致蛋白污染较多㊂１．３㊀免疫亲和捕获法㊀㊀基于免疫亲和捕获分离外泌体，主要依据是外泌体表面含有其特异性标记物，如ＣＤ９㊁ＣＤ６３等㊂在平面或磁珠上包被抗标记物的抗体，当外泌体经过此平面或磁珠时，便可以与抗体结合从而分离出来［２３，２４］㊂此外，不同细胞分泌的外泌体其表面含有的抗原存在差异，可通过选择不同的抗体实现对不同的外泌体的提取与分离［２５］㊂使用免疫亲和捕获法来捕获外泌体，特异性高㊁操作简便且不影响外泌体形态的完整性，但是效率较低，抗体价格昂贵，存㊃０７９㊃㊀第９期陈雯雯，等：微流控技术在外泌体分离分析中的研究进展在活性和批次差异㊂１．４㊀聚合物共沉淀法㊀㊀共沉淀法分离外泌体是通过在待分离样品中加入其他溶剂，改变样品中物质的溶解度及分散特性，从而将外泌体从溶液中分离出来㊂目前报道的最常用的共沉淀剂是聚乙二醇（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）［２６］，ＰＥＧ可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早期人们［２７］将其应用于从血清等样品中提取病毒，现在也被用来提取外泌体，加入ＰＥＧ后先将沉淀出的蛋白等物质分离出来，然后静置，利用各物质沉淀速率不同将其分离㊂使用ＰＥＧ沉淀法操作简单，但纯度和回收率较低，且聚合物的除去较为困难，因此想要广泛应用仍需要不断改进技术条件㊂图２㊀基于纳米孔膜、纳米阵列过滤分离外泌体的微流控方法Ｆｉｇ．２㊀Ｅｘｏｓｏｍｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｓｂａｓｅｄｏｎｎａｎｏ⁃ｆｉｌｔｅｒｓａｎｄｎａｎｏ⁃ａｒｒａｙｓ㊀ａ．ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＥＶｓｆｒｏｍｕｒｉｎｅｕｓｉｎｇａｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｄｏｕｂｌｅ⁃ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｄｅｖｉｃｅ［２９］；ｂ．ｅｘｏｄｉｓｃｆｏｒｒａｐｉｄ，ｓｉｚｅ⁃ｓｅ⁃ｌｅｃｔｉｖｅ，ａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎａｎｏｓｃａｌｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓｆｒｏｍｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ［３０］．２㊀基于微流控技术的外泌体分离方法㊀㊀目前基于微流控技术的外泌体分离方法主要分为两大类㊂一类是基于外泌体物理性质如尺寸等的分离方法，另一类为基于外泌体生化特性如表面蛋白表达等的分离方法［２８］㊂２．１㊀基于外泌体物理特性的分离方法㊀㊀针对外泌体物理特性进行分离的研究主要集中在尺寸差异上，外泌体的尺寸为３０ １５０ｎｍ，而细胞的尺寸一般在微米数量级，其他的细胞外囊泡如微囊泡以及凋亡小体的大小也和外泌体存在差异，因而可以利用它们尺寸的差异将外泌体从混合物中分离出来㊂和其他的分离方法相比，使用基于尺寸的方式分离出的外泌体大小更加均一㊂在微流控芯片中，基于外泌体尺寸进行分离主要有两大类㊂一类为使用纳米孔膜㊁纳米阵列㊁微过滤器等器件结构直接对样品进行过滤，将外泌体从中分离出来㊂另一类使用流场技术，通过施加动力作用或场作用使外泌体和其他物质分离开㊂此外，也可以将这两种方式结合进行外泌体的分离，在接下来的文章当中将对这两类分离方式进行详细介绍㊂２．１．１㊀纳米孔膜、纳米阵列过滤㊀㊀在最近的研究中，有学者［２９］报道了一种使用双层膜过滤分离尿液中外泌体的体系（见图２ａ）：该微流控芯片的核心部分是两个滤膜，作者将经过离心前处理的样品加入芯片中，样品先流经孔径为２００ｎｍ的滤膜，去除样品中体积较大的物质如细胞碎片和一些较大的囊泡等；之后样品又流经一个孔径为３０ｎｍ的滤膜，此时样品中尺寸小于２００ｎｍ大于３０ｎｍ的物质都将被截流下来㊂后期可以直接在此芯片中对截流下的外泌体进行染色等操作㊂相较于传统的超速离心方式，双层膜过滤耗时短，设备简单㊂该装置的外泌体捕获率为８１ ３％，特异性为９０％㊂Ｗｏｏ等［３０］也利用了双层膜过滤的方式对外泌体进行分离（见图２ｂ），他们将驱动力改成了离心力，装置可以实现对血液中尺寸为２０ ６００ｎｍ的囊泡的富集，分离效率大于９５％㊂此外，也有学者［３１］利用膜过滤的方式，研究出了外泌体分级分离的芯片（ｅｘｏｓｏｍｅｔｏｔａｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｃｈｉｐ，ＥｘｏＴＩＣ）；该芯片的构造和过滤器类似，通过改变中间夹膜的孔径，实现对不同尺寸物质的截留㊂而将具有不同滤膜孔径的芯片串联起来，便可以实现对外泌体的分级分离；分离后将滤器中间的滤膜取出，并将其上截留的外泌体溶解到溶剂中去，实现对不同尺寸外泌体的分离与富集㊂㊃１７９㊃色谱第３９卷㊀㊀确定性侧向位移（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃｌａｔｅｒａｌｄｉｓ⁃ｐｌａｃｅｍｅｎｔ，ＤＬＤ）柱形微流控芯片是一种可以有效分离和富集微米级颗粒包括血液中的寄生虫㊁细菌㊁血细胞和循环肿瘤细胞等物质的技术㊂来自ＩＢＭ㊁普林斯顿大学与西奈山伊坎医学院的科学家们合作设计并制造出了纳米级ＤＬＤ（ｎａｎｏ⁃ＤＬＤ）芯片［３２］，该芯片具有２５ ２３５ｎｍ范围的均匀的间隙尺寸；经过实验他们发现，在低佩克莱数情况下，扩散和确定性位移产生竞争时，ｎａｎｏ⁃ＤＬＤ芯片仍然可以灵敏地将２０ １１０ｎｍ的颗粒分开㊂㊀㊀无独有偶，来自美国纳米医学中心的研究者同样利用柱型微流控芯片实现了对外泌体的分离［３３］㊂与前者不同的是，他们通过在形成的阵列微米柱上构建多孔硅的纤毛从而实现对外泌体的捕获与富集；通过控制合成条件，可以获得不同的纤毛形态及密度㊂当细胞㊁细胞碎片㊁外泌体以及蛋白等流经该带纤毛的微米柱阵列时，细胞以及细胞碎片因为体积过大，不能够被纤毛捕获，外泌体则可以被纤毛捕获，而蛋白等生物小分子因体积过小，会从纤毛的间隙溜走，因而此带有多孔硅纳米线的微柱阵列可以实现对外泌体的分离与富集㊂在实现捕获后可以通过加入磷酸盐缓冲液将多孔的纳米线结构溶解掉，从而将捕获到的外泌体完整地释放出来㊂２．１．２㊀物理场分选㊀㊀除了使用器件对样品进行直接过滤，人们也在微流控芯片上使用流场技术对外泌体进行分离［３４］：杜克大学的学者利用声学技术和微流控芯片技术相结合（以下简称声波微流控），设计了一种可以不用标记及直接接触便可以实现外泌体分离和富集的方法㊂该声波微流控平台包含细胞去除以及外泌体分离两个模块㊂当施加一定频率的声波时，流体中的微粒将会受到声波辐射力的作用，其大小和粒子的体积成正比㊂而当微粒受到声波辐射力影响要发生位置的偏移时，又会受到一个斯托克斯拽力的作用，其大小与粒子的半径成正比㊂当粒子的体积增大１０倍时，斯托克斯拽力增大１０倍，而声波辐射力增大１０００倍，因而体积越大的微粒，受声波场的影响就越明显，运动轨道偏移越大，利用此原理便可以将不同尺寸大小的粒子分离开来㊂使用该平台所获得的外泌体血液细胞的去除率达到９９ ９９９％㊂㊀㊀将电场和磁场结合到微流控芯片上进行外泌体的分离近来也有报道㊂Ｃｈｏ等［３５］提出了利用电场迁移来分离外泌体的方法㊂该方法在孔径为３０ｎｍ的渗透膜施加穿透膜的电场，在电场的作用下蛋白等发生迁移从而透过膜到外侧，而外泌体则会被截留在渗透膜上从而实现分离与富集㊂该方法分离效率较高，在尺寸上可以达到和超速离心类似的分离结果㊂和传统的超速离心方法相比，该种分离方式在ＲＮＡ水平上的回收率为６５％，比超速离心高了７ ９倍，蛋白的去除效率在３０ｍｉｎ内可以达到８３ ６％㊂㊀㊀此外，也有学者［３６］提出了一种利用黏弹流对外泌体进行分离的方法（见图３），该方法通过在样品中加入一种具有生物相容性的聚合物来控制作用在外泌体上的黏弹力从而实现对外泌体的分离，通过选择合适的浓度峰参数，最终所分离出的外泌体的纯度可大于９０％，回收率大于８０％㊂图３㊀基于物理场分选分离外泌体的微流控方法Ｆｉｇ．３㊀Ｅｘｏｓｏｍｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｓｂａｓｅｄｏｎｐｈｙｓｉｃａｌｆｉｅｌｄ㊀Ｆｉｅｌｄ⁃ｆｒｅｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｆｒｏｍｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓｂｙｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃｆｌｏｗｓ［３６］．２．２㊀基于外泌体生化特性的分离方法㊀㊀目前针对外泌体生化特性进行分离的研究主要集中在表面蛋白表达的差异上，通常通过免疫捕获的方式将外泌体从样本中分离出来㊂免疫捕获即将和外泌体相关的抗体吸附在固相载体表面，从而对外泌体进行捕获的技术㊂该技术具有快速㊁灵敏㊁简便㊁载体易于标准化等优点，因而被广泛使用㊂在微流控系统中采用免疫捕获的方式分离外泌体，从基底的状态上分可以分为固定基底免疫捕获和非固定基底免疫捕获两种㊂㊃２７９㊃㊀第９期陈雯雯，等：微流控技术在外泌体分离分析中的研究进展２．２．１㊀固定基底免疫捕获㊀㊀顾名思义，固定基底免疫捕获就是将捕获所需的抗体修饰在平面或有结构的基底上，但基底本身不可移动㊂较常用来作为标记物的蛋白是外泌体特异性的ＣＤ９㊁ＣＤ６３以及ＣＤ８１，此外针对一些具有自己特异性蛋白的外泌体，也可以用相应的蛋白抗体来进行捕获，如ＥｐＣＡＭ［３７］等蛋白㊂有学者［３８］设计并制造了一种可以实时对外泌体进行定量分析的技术，该技术通过在平面底部修饰上外泌体特异性蛋白的抗体，实现对外泌体的捕获，接着通过表面等离子体成像（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅｉｍａｇｉｎｇ，ＳＰＲｉ）对信号进行分析㊂此外，将具有纳米结构的氧化石墨烯和聚多巴胺修饰在平面上，再修饰上捕获外泌体的抗体可以显著提高外泌体的捕获效率［３９］（见图４ａ）㊂图４㊀基于固定基底免疫捕获分离外泌体的微流控方法Ｆｉｇ．４㊀Ｅｘｏｓｏｍｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｃｈｉｐｂａｓｅｄｏｎｉｍｍｕｎｅｃａｐｔｕｒｅｏｎｆｉｘｅｄｂａｓｅ㊀ａ．ｎａｎｏ⁃ｉｎｔｅｒｆａｃｅｄｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｅｘｏｓｏｍｅｐｌａｔｆｏｒｍ（ｎａｎｏ⁃ＩＭＥＸ）［３９］；ｂ．ｓｃｈｅｍａｔｉｃｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｃａｐｔｕｒｅａｎｄｒｅｌｅａｓｅｕｓｉｎｇａｎｅｘｏｓｏｍｅ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃｄｕａｌ⁃ｐａｔｔｅｒｎｅｄｉｍｍｕｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＥｘｏＤＩＦ）ｄｅｖｉｃｅ［４０］．㊀㊀Ｋａｎｇ等［４０］则提出了一种可以实现外泌体可逆捕获和释放的装置（见图４ｂ）㊂该装置由两个不同的被免疫标记的具有结构的聚二甲基硅氧烷层组成，图案的设计结合机械旋转可以有效地提高抗体与外泌体结合的概率，从而可以在获得高的特异性的同时也获得高的外泌体的通量㊂作者在修饰过程中使用了具有双硫键的ＤＴＳＳＰ（３，３ᶄ⁃二硫代双（磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯））这一物质，在捕获完成后，加入具有还原性的ＤＴＴ（二硫苏糖醇）便可以成功地使双硫键断裂开，从而使所捕获到的外泌体被释放出来，以便于下游的进一步分析㊂㊀㊀此外，人们也将一些微结构应用到了对外泌体的捕获上，如鱼骨结构［４１，４２］㊁三角结构等，这些微纳结构的加入，不仅可以增大捕获底面的比表面积，还可以增加液体的混合，提高捕获效率㊂Ｃｈｅｎ等［４３］构建了一种纳米氧化锌包覆的三维支架芯片，三维支架相互连接的微孔使流体流动呈现混流或漩涡特征，氧化锌纳米线阵列为外泌体特异性抗体的固定提供了较大的表面积，纳米阵列具有尺寸排斥效应，对体积较大的囊泡有较好的去除作用㊂２．２．２㊀非固定基底免疫捕获㊀㊀和固定基底免疫捕获相对应，非固定基底免疫捕获即将捕获抗体修饰在可移动的基底上，微珠是目前较为常用的非固定外泌体捕获基底㊂外泌体的尺寸只有３０ １５０ｎｍ，直接分离的话较为困难，设备依赖性强㊂通过在微珠等表面修饰外泌体特异性的抗体等，便可以对外泌体进行捕获与富集㊂之后只要对捕获了外泌体的微珠进行操作便可以将外泌体分离出来，化小为大，操作将更为便捷㊂目前使用较多的微珠是磁珠和硅珠㊂Ｇｏｄｗｉｎ等［４４］将免疫捕获分离和外泌体的目标蛋白检测集合在微流控芯片上，开发了一种新的可以对外泌体蛋白直接进行分析检测的技术㊂该微流控芯片主要由两部分组成，第一部分为外泌体捕获单元，即加入修饰了抗体的磁珠，可以对外泌体进行捕获㊂第二部分为蛋白检测单元，加入蛋白提取剂，便可以在这个芯片上实现对外泌体蛋白的自动化检测㊂该实验装置可在１００ｍｉｎ内实现对３０μＬ血液样品的检测㊂无独有偶，直接在芯片上实现对外泌体中的ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ⁃ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）检测的芯片也已有报道［４５］，检测芯片由外泌体捕获㊁ＲＮＡ捕获㊁反转录以及ｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃ⁃ｔｉｏｎ）４个功能单元组成，外泌体在第一个腔室被表面标记有抗体的磁珠捕获后，加入ＲＮＡ裂解液，裂解出的ＲＮＡ进入到第二个腔室被捕获，之后洗脱出来，进入第三个腔室进行反转录，最后在第四个腔室进行ｑＰＣＲ，便可以对捕获的外泌体的ＲＮＡ进行鉴㊃３７９㊃色谱第３９卷定㊂此外，要对一种特定疾病的外泌体进行判定，有时需要同时对多个蛋白进行检测，这一点，也已经有学者利用免疫标记的磁珠实现［４６］：研究人员以卵巢癌分泌的外泌体为例，用ＣＤ９的抗体来进行捕获，对ＣＡ⁃１２５㊁ＥｐＣＡＭ㊁ＣＤ２４这３种蛋白进行了免疫荧光标记，并对其光强等进行了检测，实验结果表明该方式可以实现对外泌体的多种标志蛋白的检测㊂图５㊀基于非固定基底免疫捕获分离外泌体的微流控方法Ｆｉｇ．５㊀Ｅｘｏｓｏｍｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｃｈｉｐｂａｓｅｄｏｎｉｍｍｕｎｅｃａｐｔｕｒｅｏｎｕｎｆｉｘｅｄｂａｓｅ㊀ａ．ｅｘｏｓｏｍｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇｒａｐｉｄｉｎｅｒｔｉａｌｓｏｌｕｔｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅ［４７］；ｂ．ｅｘｏｓｏｍｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｃｈｉｐｂａｓｅｄｏｎｍａｇｎｅｔｉｃｎａｎｏｐａｒ⁃ｔｉｃｌｅｓ［４８］．㊀㊀而使用不带磁性的微珠进行捕获，通常是在捕获之后利用滤膜截流以及通过流场的作用将吸附了外泌体的微珠分离出来㊂Ｄｕｄａｎｉ等［４７］提出了一种可以将外泌体分离与外泌体荧光检测同步进行的技术（见图５ａ）：作者使用了表面标记有ＣＤ６３抗体的微球，将其和含有外泌体的样品以及表面标记有藻红蛋白的ａｎｔｉ⁃ＣＤ８１一起培养，之后再将微球和缓冲盐溶液一起从不同的入口注入微流控芯片中，在流体惯性力的作用下，微珠将迁移到缓冲液中，从而被分离出来；在微珠收集口处有个荧光检测器，可以实现对外泌体荧光的检测㊂㊀㊀除了使用相对外泌体而言体积较大的微珠，比外泌体尺寸小很多的磁性纳米颗粒［４８］也被应用于对外泌体的分离中（见图５ｂ）㊂通过在磁性纳米颗粒表面修饰上相应的抗体，可以使其和外泌体特异性结合而使外泌体带有磁性，接着便可以通过对磁场的操控将外泌体从磁性纳米孔（ｅｘｏｓｏｍｅｔｒａｃｋ⁃ｅｔｃｈｅｄｍａｇｎｅｔｉｃｎａｎｏｐｏｒｅ，ＥｘｏＴＥＮＰＯ）中分离出来［４８］㊂㊀㊀表２对上述提到的方法进行了归纳与总结㊂３㊀现有的外泌体分析方法㊀㊀外泌体的分析一般是指对其形貌㊁粒径分布和携带的生化信息等参数的表征㊂围绕这些方面，现有的外泌体分析方法主要有显微镜图像观测㊁光散射粒径分析㊁可调电阻脉冲传感㊁抗体检测㊁流式细胞术等㊂３．１㊀显微镜图像观测㊀㊀外泌体的尺寸在１００ｎｍ左右，传统的光学显㊃４７９㊃㊀第９期陈雯雯，等：微流控技术在外泌体分离分析中的研究进展表２㊀基于微流控技术的外泌体分离方法Ｔａｂｌｅ２㊀ＥｘｏｓｏｍｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳａｍｐｌｅＳａｍｐｌｅｖｏｌｕｍｅ／μＬＲｅｃｏｖｅｒｙ／％Ｔｉｍｅ／ｍｉｎＩｓｏｌａｔｅｄｓｉｚｅ／ｎｍＲｅｆ．ＢａｓｅｄｏｎｐｈｙｓｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓＭｅｍｂｒａｎｅｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ㊀Ｅｘｏｄｉｓｃ：ｄｏｕｂｌｅｍｅｍｂｒａｎｅｓｕｒｉｎｅ１０００＞９５３０２０－６００［３０］㊀ＥｘｏＴＩＣ：ｍｕｌｔｉ⁃ｍｅｍｂｒａｎｅｓｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａ，ｐｌａｓｍａ，ｕｒｉｎｅ５０００＞９０６０ ３０－１００［３１］Ｎａｎｏ⁃ｃｏｌｕｍｎａｒｒａｙｓ㊀Ｎａｎｏ⁃ＤＬＤｓｏｒｔｉｎｇｕｒｉｎｅ，ｓｅｒｕｍ９００ ５０６０ ３０－２００［３２］㊀Ｃｉｌｉａｔｅｄｍｉｃｒｏｐｉｌｌａｒａｒｒａｙｌｉｐｏｓｏｍｅｓ１００ ６０１０ ３０－２００［３３］Ｐｈｙｓｉｃａｌｆｉｅｌｄ㊀Ａｃｏｕｓｔｏｆｌｕｉｄｉｃｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｈｕｍａｎｗｈｏｌｅｂｌｏｏｄ５００９９５０ １００［３４］㊀Ｅｌｅｃｔｒｉｃｆｉｅｌｄｍｏｕｓｅｗｈｏｌｅｂｌｏｏｄ１０００６５５０ １０－４００［３５］㊀Ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃｆｌｏｗｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ１００９３．６１０＜２００［３６］ＢａｓｅｄｏｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓＩｍｍｕｎｅｃａｐｔｕｒｅｏｎｆｉｘｅｄｂａｓｅ㊀ＳＰＲｉａｎｔｉｂｏｄｙｍｉｃｒｏａｒｒａｙｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａ３００Ｎ／Ａ１ ７０［３８］㊀Ｎａｎｏ⁃ＩＭＥＸｐｌａｓｍａ㊀２０ ８０４０＜１５０［３９］㊀－ＣＯＣＥＶＨＢ⁃ｃｈｉｐｐｌａｓｍａ１０００９４６０ １００［４１］㊀ＺｎＯｃｈｉｐｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａ，ｂｌｏｏｄ１００＞７０１０３０－１５０［４３］Ｉｍｍｕｎｅｃａｐｔｕｒｅｏｎｕｎｆｉｘｅｄｂａｓｅ㊀ＥｘｏＳｅａｒｃｈｃｈｉｐ：ｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓｐｌａｓｍａ１０００ ７９．７１０＜１５０［４６］㊀Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅｂｅａｄｓｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａ７００Ｎ／Ａ１０６０－９０［４７］㊀ＥｘｏＴＥＮＰＯｃｈｉｐ：ｍａｇｎｅｔｉｃｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｐｌａｓｍａ１００００Ｎ／Ａ６０ １３８－１６１［４８］㊀Ｎ／Ａ：ｎｏｔａｐｐｌｉｃａｂｌｅ．微镜因衍射极限的限制无法观察到这类囊泡［４９］㊂近几十年，电子显微镜（扫描电子显微镜和透射电子显微镜）和原子力显微镜在纳米级别样品表征中快速兴起，逐渐成为外泌体研究的重要工具㊂㊀㊀扫描电子显微镜（ｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏ⁃ｓｃｏｐｅ，ＳＥＭ）利用电磁透镜将电子束在样品表面聚焦，通过高能电子束与样品相互作用产生二次电子㊁反射电子㊁Ｘ射线等信号，获得样品表面信息，具有景深大㊁放大范围广㊁制样简单等诸多优点，常用于外泌体形态和粒径的表征［５０］㊂相比于ＳＥＭ，透射电子显微镜（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＴＥＭ）具有更高的分辨率（低于１ｎｍ）［５１，５２］，不足的是，由于ＴＥＭ是在真空中进行的，生物材料需要固定和脱水，会影响外泌体的尺寸和形态，烦琐的样品制备过程也使测量时间以小时为单位［５３，５４］㊂㊀㊀原子力显微镜（ａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＡＦＭ）是一类通过分析样品表面的原子与微悬臂探针尖端的原子间的相互作用力来研究物质的表面结构及性质的扫描探针显微镜，其分辨率可达亚纳米级［５５－５７］㊂由于原子力显微镜极高的分辨率，外泌体必须结合在一个非常平坦的表面上，例如云母，而抗体可以用来将外泌体与表面结合，这样也可以获得生化信息㊂由于使用抗体与表面结合的微囊效率未知，因此微泡的浓度无法确定㊂此外，表面结合可能会影响微泡的形态，这可能会阻碍真实直径的测定［５３］㊂３．２㊀光散射粒径分析㊀㊀在外泌体的分析检测中，光散射技术通常用于表征外泌体的尺寸分布㊂㊀㊀小角Ｘ射线散射（ｓｍａｌｌａｎｇｌｅＸ⁃ｒａｙｓｃａｔｔｅｒ⁃ｉｎｇ，ＳＡＸＳ）是一项基于Ｘ射线光子在低角度下对样品电子弹性散射的分析技术，可在１ ２００ｎｍ范围提供样品结构信息［５８，５９］㊂值得注意的是，ＳＡＸＳ在对样品粒径进行表征时，需要单分散㊁高浓度的样品［５８］㊂㊀㊀动态光散射（ｄｙｎａｍｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＤＬＳ）是一项测定胶体悬浮液粒径的常用技术［６０］㊂其原理在于将布朗运动与粒子的大小联系起来，利用这种技术可以检测直径在１ｎｍ到６μｍ之间的粒径分布［６１］，是外泌体粒径表征的常用方法［６２，６３］㊂但其受水化层等界面因素的影响，测得的尺寸要比外泌体真实尺寸偏大［５４］㊂㊀㊀纳米颗粒跟踪分析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｔｒａｃｋｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ，ＮＴＡ）是一种可以对外泌体的尺寸和浓度㊃５７９㊃色谱第３９卷进行表征的技术㊂在ＮＴＡ方法中，主要通过跟踪单个外泌体随时间的移动并计算每外泌体的均方位移，确定流体动力学半径并显示出外泌体的大小分布［６４，６５］㊂３．３㊀可调电阻脉冲传感㊀㊀可调电阻脉冲传感（ｔｕｎａｂｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｐｕｌｓｅｓｅｎｓｏｒ，ＴＲＰＳ）是一项单粒子原位表征技术［６６］，该检测系统主要由带有两个电极的流体腔室和一块弹性绝缘聚氨酯膜组成，在聚氨酯膜中含有一个圆锥形状的纳米孔㊂通过监测粒子通过纳米孔时产生的脉冲信号，可以精确测量溶液中外泌体的浓度和粒径分布㊂相比ＤＬＳ，ＮＴＡ等技术，ＴＲＰＳ不依赖布朗运动，样品用量少，测量速度快，可同时对外泌体的尺寸㊁浓度和ｚｅｔａ电位等重要参数进行测定［６７，６８］㊂表３㊀不同外泌体分析方法的比较Ｔａｂｌｅ３㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓＡｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓＡｎａｌｙｓｉｓｏｂｊｅｃｔｓＲｅｆ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｓａｍｐｌｅｓａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｎｓｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｉｚｅ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ［５０－５２，５５－５７］ｐｒｏｂｅｓＬｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｃｈａｎｇｅｏｆｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｉｎｔｅｎｓｉｔｙｓｉｚｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ［５４，５８，６２，６３，６５］ＴＲＰＳｃｈａｎｇｅｏｆｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙｓｉｚｅ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｚｅｔａｐｏｔｅｎｔｉａｌ［６７，６８］Ａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ⁃ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ［６９，７１，７２］Ｎａｎｏ⁃ＦＣＭｔｈｅｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｌｉｇｈｔａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｉｇｈｔｏｆｄｅｔｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓｓｉｚｅ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［７３，７４］３．４㊀抗体检测㊀㊀抗体检测主要依据抗体和抗原的相互作用，将外泌体表面的蛋白表达转化为荧光㊁吸光等可测量信号从而对外泌体进行分析㊂目前在外泌体蛋白检测中最常用的是蛋白印迹法（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）该方法具有特异性强㊁易用性高等特点［６９］，可根据ＣＤ８１㊁ＨＳＰ７０等蛋白的存在情况辅助外泌体的鉴定［７０］㊂酶联免疫吸附测定（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）也是一种常用来对外泌体蛋白进行检测的方法［７１］，相比于Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ＥＬＩＳＡ在蛋白的定量分析中精度更高，但依赖于酶标仪等设备，且不能得到蛋白相对分子质量等信息㊂此外，以生成有色化合物的显色反应为基础的比色分析法在外泌体蛋白的检测中也有一定的应用，该方法可以在几分钟内对外泌体表面蛋白的细微差异进行表征［７２］３．５㊀流式细胞术㊀㊀流式细胞术是一种集细胞高通量分选和多参数检测于一体的精密技术［７３］，流式细胞仪在细胞研究中的成功运用使得其在外泌体检测上也开始受到广泛关注［７４］㊂贝克曼等一些公司建立的纳米流式细胞仪（ｎａｎｏ⁃ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，ｎａｎｏ⁃ＦＣＭ）能够检测到尺寸小于１００ｎｍ的外泌体相关囊泡，随着流式技术的改进和外泌体特异性标记试剂的开发，流式细胞术有望在该领域发挥举足轻重的作用［５６］㊂㊀㊀接下来，在表３中对上述提到的外泌体常用检测方法进行了归纳与总结㊂４㊀基于微流控技术的外泌体分析方法㊀㊀随着技术的进步，外泌体检测的各种方法不断涌现，前面介绍的方法往往需要相对庞大和复杂的实验室基础设施㊂近年来，微流控技术高速发展，许多基于微流控技术的外泌体检测方法不断被报道，这些检测方法具有分析速度快㊁灵敏度高㊁试剂消耗少㊁携带方便等优点㊂此外，微流控技术易于模块化并可多单元集成，这意味着可以将外泌体的纯化㊁富集和检测整合到微流控平台上，为临床发现外泌体生物标志物和对肿瘤等疾病的诊断与预后提供巨大的潜力［７５］㊂目前基于微流控的外泌体分析方法大致可以分为：荧光检测㊁表面等离子体共振㊁核磁共振㊁数字液滴ＰＣＲ㊁电化学传感等，下面将对提到的这几种方法进行详细的介绍㊂４．１㊀荧光检测㊀㊀荧光是一种物质在吸收光照或者其他电磁辐射后出现冷发光的现象㊂其荧光强度㊁波长㊁发光时间与材料的性质有关㊂因此，观测荧光的发射参数可以用来检测目标样品㊂荧光成像技术具有精度高㊁灵敏度高等优点，已广泛应用于微流控芯片的外泌体检测系统中㊂近期的研究报道中，Ａｉ等［５０］建立了一种微流控水动力分析平台，该平台首先利用微珠对溶液中的外泌体进行初步的捕获，然后利用微流控芯片将富集有外泌体的微珠进行分散与固定，在芯片上实现了外泌体的大规模多重荧光分析（见图６ａ）㊂而Ｈａｎｓｆｏｒｄ等［７６］则构建了一种经过抗体功能化的人字形沟槽微流控装置，在实验中，研究人㊃６７９㊃。

微流控技术的研究和应用随着科技的不断发展，微流控技术越来越受到广泛关注，尤其是在生命科学、医学、化学及微纳米流体力学等领域中，发挥着越来越重要的作用。

微流控技术是指在微观尺度上运用流体动力学原理，通过微小的通道、微型控制元件及微小的流体体系来操作、控制及分析微尺度下的流体运动，实现对微尺度下的小分子、细胞、生物大分子等样品的分析和操作，为科学研究及生产提供了有效的手段。

微流控技术的研究一直处于不断的发展和探索中。

从最初的基础理论研究到现在的广泛应用，微流控技术的进展与发展推动了科研的不断深入。

在微流控芯片的构建上，我们需要摆脱传统的纳米加工制备方法，使用微器件的标准化制造方法。

这种方法具有较高的可靠性，能够保证芯片制造的精度和稳定性，同时成本也较低。

利用这种制造方法，我们可以快速制造出高质量的微流控芯片，并实现将其广泛应用于生命科学、医学、环境科学等各个领域。

微流控技术在生命科学领域的应用日益广泛。

在细胞培养及生物大分子研究中，微流控技术较传统方法更能够模拟生物环境，对细胞的生长及发育进行研究；在蛋白质分析领域，减小了反应体积，缩短了反应时间，提高了分析的精度及灵敏度。

同时，微流控技术可以被广泛应用于疾病的诊断及治疗领域。

在疾病筛选及诊断方面，其迅捷、灵敏的操作方法使得微流控技术在各类疾病的早期诊断及治疗方面都有很好的应用。

以血液检测为例，利用微流控技术可以大大提高检测的敏感性和特异性，通过微通道内的染色、离心、酶联等方法，对疾病的早期诊断起到很重要的作用。

同时，微流控技术在环境监测、食品安全等方面也有着广泛的应用。

在环境监测方面，微流控芯片可以直接对水体、空气等各种样品的体积及质量进行精细的控制，达到更为准确的检测目的。

在食品安全领域，现在许多食品流通的环节、过程及生产厂家均需进行严格的质检，而利用微流控技术可快速检测微生物、重金属、有害物质等，提高检测效率及检测准确度。

此外，微流控技术在药物发现及治疗领域的研究也日益深入，为疾病的治疗提供了新思路。