茶藨生柱锈重寄生木霉产毒条件的优化
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东北茶藨子、长白茶藨子经济价值及病虫害防治
片表 面绿 色 ，有 白色 细柔 毛 ，背 面 为淡 绿色 ，密生 白色细 绒 毛 。 长 白茶蔗 子果 实 中含 有大 量 的维生 素ｃ、多种 有基 酸和 糖类 、人 体
总状 花 序 。花 序 轴 粗 ，有 密 毛 ，初 始 直立 ，后 期 下 垂 。 花朵 多 所需 微 量元 素 和水 溶性 维 生 素 ，可 提取 维 生素 、食 用 色 素 和果 胶
东北 茶 蔗 （Ｒｉｂｅｓｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｍ （Ｍａｘｉｍ．）Ｋｏｍ ），隶 属于 虎 率 约为 １６％ ～２５％，种 子含 油率 高 ，可 榨油 。
耳草 科 ，茶蔗 子 属植 物 ，为 直立 落 叶 灌木 ，属 野 生小 浆 果 资源 。 ２ 药 用医疗 价值
东 北 茶 藤 子 俗 称 狗 葡 萄 、山 樱 桃 、灯 笼 果 等 。高 １—２ｍ。枝 粗
达 ４０。花 梗 短 。两 性 花 。萼 管 短 ，钟 状 ，有 ５裂 片 ，反 卷 ，黄绿 酶 ，做 成保 健 食 品 ，有 防治 坏血 病 和多 种传 染 病 的作 用 。东 北 茶
色 。花 冠 ５瓣 ，楔 形 ，绿 黄 色 。雄 蕊 ５枚 ，有 明显 伸 出 ，花 盘 ５个 藤 子 、长 白茶 蔗子 根 和 叶片 含有 黄 酮类 成 分 ，黄 酮类 成 分对 软 化
狗 葡 萄 、山樱 桃 、醋 栗 、小 刺 李 、东 北 醋李 等 。高 １—３ｍ。枝 粗 理 想 的天然 保健 药物 。可 用于保 健药 品 的开发利 用 。
壮 ，灰色 ，小 枝 灰 色或 暗 灰色 ，树 皮 条状 剥 离 ，幼 枝棕 褐 色 或红 ３ 观 赏价 值
褐 色 ，无 毛 、无 刺 。芽 长 卵 圆形 ，长 ５～８ｍｍ，先 端 渐 尖 ，有 多
东 北 茶蔗 子 、长 白茶 蔗子 果实 不仅 可 以食 用 ，加工 性 能好 ，
高效优质茶园的管理知识与技术(4)有机茶病虫害的防治
高效优质茶园的管理知识与技术(4)有机茶病虫害的防治作者：禹利君来源：《湖南农业》 2014年第10期湖南农业大学园艺园林学院禹利君（续第9期第36页）据统计，茶树病虫害会导致茶叶减产10%～20%，情况严重时，甚至无茶可采，直接影响茶叶产值。
而有机茶是一种无污染的保健饮品，蕴含着巨大的市场潜力。
生产有机茶经济效益很高，是茶产业发展方向。
由于在生产过程中要求不使用任何化学农药，所以如何采取无毒、无害且高效的病虫害防治方法是保证有机茶产量和品质的关键。
一、主要病虫害1.主要病害发生在嫩叶上的主要病害有茶饼病、茶白星病和茶芽枯病等；发生在成叶和老叶上的主要病害有茶网饼病、茶云纹叶枯病、茶圆赤星病、茶轮斑病、茶炭疽病和茶煤病等。
叶部病害是影响茶叶生产的主要病害，其他还有由病原菌引起的、发生在根部和茎部的病害。
2．主要虫害按取食方式，可以将茶树害虫分为食叶类害虫、吸汁类害虫(螨)、钻蛀类害虫和地下害虫四大类。
①食叶类害虫。
食叶类害虫通常是以幼虫或成虫取食茶叶为害茶树，食叶类害虫是影响茶叶生产的主要害虫。
②吸汁类害虫(螨)。
吸汁类害虫(螨)是用口针插入茶树芽叶和茎部组织内吮吸汁液为害茶树。
这类害虫(螨)一般体型较小，年发生代数多，繁殖力强，多数为茶树上的重要害虫(螨)。
③钻蛀类害虫。
钻蛀类害虫是通过钻入茶树枝干和果实为害茶树。
④地下害虫。
地下害虫是通过取食茶树地下根茎为害茶树。
二、有机茶病虫害的防治1.农业防治主要措施包括：一是慎选种茶园地，最好在生荒地上种茶。
二是选育抗病能力强的优质茶苗。
三是加强茶园管理。
有的管理措施能够有效减少病虫，常用的有深耕除草、合理修剪、增施农家肥等。
此外，秋冬季清园，剪除病虫枝和细弱枝，扫除地面枯枝落叶，清除茶园杂草可减少越冬病虫数量，创造有利于茶树生长的生态环境。
2.物理防控技术物理措施应用最多的是“三挂”技术。
①挂黄板。
在茶园中将黄板悬挂高于茶蓬5～10厘米的位置，每667平方米挂放25～30块，悬挂时间4月中旬至10月中旬。
3株茶藨生柱锈重寄生木霉菌的形态鉴定及ITS序列分析
（Ｄ Ａ Ｉ ｑｅｃ ａｓ ）『ｅｕ ］ ｃｏ ｉ ｔｔ ｅ ｒ ｔｎｏｃ ｔｅ ｈｒ ｔｓ ｎ ｉｏ ｏｉｃａ ｃｒｔｓｆ Ｒ ， ｅ ｔｉｗｓｄｎｆｄ ｒＮ － Ｓｓ ｏ ｅｎｌ ｉ ．Ｒｓｔ Ａ ｃ ｄ ｇｏｈ ｄｓ ｉｉ ｌ ｒｃａ ｃ ｒａｄｍｃ ｓ ｐ ｒ ｔ ｓ Ｔ １ｔ ｒｎ ３ ｉ ｔｉ Ｔ ｅ ｎ ａ ｙｓ ｌ ｒｎ ｅ ｃｐｏ ｆｕ ｕ ａ ｅ ｒｃ ｃｈａｅ ｉ ｏ ｉ ｃ ｈ ｓａ ｅｉ ｅ
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茶藨生柱锈重寄生木霉粗毒素的基本性质
茶藨生柱锈(Cronartium ribicola )是世界林木三大病害之一的五针松疱锈病的病原，在中国主要危害红松（Pinus koraiensis ）及华山松（P.armandii ）[1-3]。
据调查，茶藨生柱锈目前仅在云南已使上万公顷华山松林发病[4-7]，严重威胁着长江上游防护林体系的建立，给生态恢复带来极大困难。
长期以来,对华山松疱锈病的治理以化学防治为主,并配以修枝、铲除转主寄主等营林技术措施。
然而，由于茶藨生柱锈菌为长循环型转主寄生锈菌,防治相当困难[6,8]。
在华山松疱锈病防治研究过程中，从茶藨生柱锈菌锈孢子堆中分离获得1株重寄生木霉SS003菌株（Trichoderma atroviride ）。
该菌株通过分泌毒素和胞壁降解酶破坏锈孢子，且生物学性状优良，并具有良好的生防效果[9-11]。
笔者对该菌株所产粗毒素的基本性质进行研究,为该菌的活性成分研究及进一步开发利用奠定基础。
1材料和方法1.1供试材料供试菌株为重寄生菌木霉SS003菌株，分离自茶藨生柱锈锈孢子堆[11]，由西南林业大学提供。
生测材料为茶藨生柱锈菌的新鲜成熟锈孢子。
1.2试验方法1.2.1培养方法将供试菌株接于PDA 培养基上扩繁5d ，然后用Φ=0.6cm 的打孔器在培养好的木霉平皿上打孔，将打好的菌块接种在装有100mL植物生理与生物技术茶藨生柱锈重寄生木霉粗毒素的基本性质李永艳1，敖新宇2，陈玉惠2（1.西南林业大学保护生物学学院，云南昆明650224；2.西南林业大学基础部，云南昆明650224）摘要：采用液体发酵和生物测定相结合的方法，研究了茶藨生柱锈(Cronartium ribicola )重寄生木霉SS003菌株（Trichoderma atroviride ）所产粗毒素的基本性质。
结果表明，SS003所产粗毒素为一类非蛋白质、极性较大的物质,具有较高的热稳定性和酸碱稳定性,能被甲醇较好地提取出来,可被活性碳有效地吸附并为甲醇所洗脱。
茶麃生柱锈菌重寄生拟盘多毛孢产毒培养条件的筛选
（ Ｐ ｅ ｓ ｔ ａ ｌ ｏ ｔ ｉ ｏ ｐ ｓ ｉ ｓ ｓ ｐ ｐ ． ）ｆ ｒ ｏ ｍ Ｃ ｒ ｏ ｎ ａ ｒ ｔ ｉ ｕ ｍ ｒ ｉ ｂ ｉ ｃ ｏ ｌ ａ
Ｌ Ｉ Ｊ ｉ ｎ ｇ ， Ｌ Ｉ Ｕ Ｆ ｅ ｎ ｇ — ｌ ｕ， Ｃ ＨＥ Ｎ Ｙｕ — ｈ ｕ ｉ
（ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ， Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ ｗ ｅ ｓ ｔ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｋ ｕ ｎ ｍ ｉ ｎ ｇ ６ ５ ０ ２ ２ ４ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
植物锈病是植物常发生的一种真菌病害， 每年都会给全球农林业造成重大经济损失 ， 由于锈病是由 专性寄生的锈菌 引起 ， 所 以较 之其 它植物病 害防治更为 困难 Ｊ 。茶藤 生柱锈菌 （ Ｃ ｒ ｏ ｎ ａ ｒ ｔ ｉ ｕ ｍ ｒ ｉ ｂ ｉ ｃ ｏ ｌ ａ Ｊ ． Ｃ ． Ｆ ｉ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ） 是五针松疱锈病的病原菌 ， 主要危害五针松 中幼林 ， 导致受害五针松高生长、 径围生长和材 积量 明显 下 降 ， 当病 部 溃疡 斑环 绕树 干周 长一 半 以上 时造成 枝干 枯萎 ， 最终 导致 整株 死亡 ＿ ６ ＿ ８ ］ 。 锈菌 的 重寄生 现象 在 自然 界 的发 生 较 为 普遍 ， 对控 制 锈 病 的 危 害起 到 一 定 的作用 ｊ 。重 寄 生菌 一
Ａｃ ｔ ａ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｈ ｕ ｒ ａ ｅ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ
李靖 ， 刘 风路 ， 陈玉惠． 茶廉生柱锈菌重寄生拟盘多毛孢产毒培养条件的筛选 Ｊ ］ ． 江西农业大学学报 ， ２ ０ １ ７ ， ３ ９ （ ２ ） ： ３ ９ ５ — ４ ０ １
生防菌长枝木霉T6发酵条件优化、剂型研制及促生防病作用研究
生防菌长枝木霉T6发酵条件优化、剂型研制及促生防病作用研究生防菌长枝木霉T6发酵条件优化、剂型研制及促生防病作用研究摘要：生防菌是一种可以抑制病原菌生长并促进植物生长的微生物，因其对环境友好、无毒副作用等特点，受到了广泛关注。
本研究以长枝木霉T6为研究对象，探究了其发酵条件优化、剂型研制以及促生防病作用。
1. 引言随着化学农药的广泛应用，农业生态环境受到了严重的破坏。
而生防菌的引入可以很好地解决这个问题，可有效抑制病原菌的生长并增强植物的免疫力，从而达到防治病害的目的。
长枝木霉是一种具有生防菌作用的真菌，具有广泛的应用前景。
本研究旨在优化长枝木霉T6的发酵条件，研制高效的剂型，并探究其在促进植物生长和防治病害方面的作用机制。
2. 方法与材料2.1. 长枝木霉T6的分离和筛选从野外的植物茎叶表面样品中分离得到长枝木霉T6，并通过菌落直径和溶解能力等指标对其进行筛选。
2.2. 发酵条件的优化通过单因素实验和正交试验，优化了长枝木霉T6的发酵条件，包括培养基成分、温度、pH值、培养时间等参数。
2.3. 剂型研制选取适合长枝木霉T6生长和存活的载体，通过加工制备块菌剂和液菌剂。
2.4. 促生防病作用的研究通过田间试验和室内试验，研究长枝木霉T6对植物生长和病害防治效果的影响。
同时，通过生理生化指标的测定，揭示其促生防病作用的机制。
3. 结果与讨论3.1. 长枝木霉T6的分离和筛选经过筛选，得到直径较大且具有较强溶解能力的长枝木霉T6菌株。
3.2. 发酵条件的优化通过优化发酵条件，得到长枝木霉T6的最佳发酵条件为：培养基成分（葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.01%），温度30℃，pH值7.0，培养时间7天。
在此条件下，长枝木霉T6的发酵产物具有较高的生物活性。
3.3. 剂型研制经过载体筛选和加工制备，成功研制了长枝木霉T6的块菌剂和液菌剂。
3.4. 促生防病作用的研究田间试验和室内试验结果显示，长枝木霉T6处理的植物生长状况较好，抗病能力提高。
茶藨生柱锈重寄生木霉粗毒素的基本性质
ｒｂ ｃ ｌ ｉｉｏａ
Ｌ ｎ ｒｌ ． ＩＹｏ ｇ ａｌ ＡＯ １ ｕ ． Ｘｉ －ｙ ： ＣＨ ＥＮ ｕ ｈｕ １ Ｙ — ｉ
（ ． （ ｈ ｆ（‘ ｌ ａ ｉ ｎ Ｂ ｏ ）？ ｌ ｌ ¨ｔ ｆ ｔ ｈ、 ｔｌ 、 ｌ ｉ ＇ ｉＦａ。 ｙ ｏ ） Ｐ 、 ｔ ｉ ｈ ｇ ， Ｉ ｆ ． ｔ ｕ ｎ ｏ ｌ１ Ｈ ｓ ｌ ｔ ｔ Ｋｕ ｌ ｉ ｇ 、ＩＩ ｛ ０２ ４． ｌ ａ ２ ＿ ｓ ＞ ｎｎｎ Ｉ Ｉｔ ６５ ２ Ｃｈ ｌ ： ．Ｄｅ ａ ｔｌ ｌ 】 Ｆ ｎ ａ ｌ Ｉ ｝ｌ Ｐ ． ｏ Ｉ Ⅵｔ Ｉ ＩＩ Ｈ １ ｐ ｒＩ Ｐｌ ｆ ｕ ｄ ｍｅｌ Ｉ Ｃｔ 】 Ｓ ｕ Ｉ 、 ｜ ｌ【 ｔＩ Ｉｓ １ ｓ
关键 词 ： 小霉 ； 毒 素 ：Ｌ 悱 匝 ： 蓐 柠 锈 粗 ｔ奉 － 茶
Ｅｌｍｅ ｔ ｒ ｏ ｅ ｔ ｓ ｏ ｕ ｅＴｏ ｉ ｏ ｕ ｅ ｙ Ｍ ｙ ｏ ａ ａ ｉｅ（ ｒｃ ｏ ｅ ｍａ ａｒ ｖｒ ｅ ｆＣ ｏ ａ ｔ ｍ ｅ ｎ ａ ｙ Ｐｒ ｐ ｒｉ ｆＣｒ ｄ ｘ ｎ Ｐｒ ｄ ｃ ｄ ｂ ｃ ｐ ｒ ｓｔ Ｔ ｉｈ ｄ ｒ ｔｏ ｉｉ ）ｏ ｒ ｎ ｒｉ ｅ ｄ ｕ
分 泌 毒 素 和 胞 壁 降 解 酶 破 坏 锈 孢 子 ， 生 物 学 性 且
收 稿 日期 ：０ Ｏ ０ — ８； 订 日 期 ：０ｌ一 ｌ０ ２ １－ ９ ２ 修 ２ １Ｏ一５
基 金 项 目 ：西 南 林 业 人 点 基 Ｊ Ｈ （ ０ ０ ； 南 省 森 林 灾 害 预 警 控 制重 点 实 验 室 资 助 项 目（ Ｋ ９ ０ 、 重 １ ７ ６） １ ｊ Ｚ ０ Ａ１５） 作 者 简 介 ： 永 艳 （ ９ ４ ， ， 两 人 ， Ｉ 硕 ｔ＇ ， 要 从 事 资 源 微 生 物 方 面 研 究 １８ 一） 殳 陕 ｒ ： ：－主 Ｌ
Ｌ ｎ ｒｌ ． ＩＹｏ ｇ ａｌ ＡＯ １ ｕ ． Ｘｉ －ｙ ： ＣＨ ＥＮ ｕ ｈｕ １ Ｙ — ｉ
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分 泌 毒 素 和 胞 壁 降 解 酶 破 坏 锈 孢 子 ， 生 物 学 性 且
收 稿 日期 ：０ Ｏ ０ — ８； 订 日 期 ：０ｌ一 ｌ０ ２ １－ ９ ２ 修 ２ １Ｏ一５
基 金 项 目 ：西 南 林 业 人 点 基 Ｊ Ｈ （ ０ ０ ； 南 省 森 林 灾 害 预 警 控 制重 点 实 验 室 资 助 项 目（ Ｋ ９ ０ 、 重 １ ７ ６） １ ｊ Ｚ ０ Ａ１５） 作 者 简 介 ： 永 艳 （ ９ ４ ， ， 两 人 ， Ｉ 硕 ｔ＇ ， 要 从 事 资 源 微 生 物 方 面 研 究 １８ 一） 殳 陕 ｒ ： ：－主 Ｌ
茶藨生柱锈菌锈孢子生物学特性研究
维普资讯
中 国森 林病 虫 ２ ０ ０ ６年 ５月 第 ２ ５卷 第 ３期
茶 藤 生 柱锈 菌 锈 孢 子 生 物 学 特性 研 究
周 兴 国 ， 永 和 ， 德 群 李 周
（ 西南林学院保护生物学学院 ， 云南 昆明 ６０２ ） ５ ２ ４
中 图分类 号 ：７ ３ １ 文献标 识码 ： 文 章编 号 ：６ １ ８ ６ ２ ０ ）３—０ ０ —０ Ｓ ６ ．５ Ａ １ ７ —０ ８ （０ ６ ０ ０１ ３
Ｂｏ ｏ ｃ ｆ ｈ ｅｉｏｐ ｒｓｏ ｒｎ ｒｉｍ ｒ ｉ ｌ ／ ＨＯ Ｘｉｇｇ ｏ ｅ １（ ａｕｔ ｆＣ ｎｅｖ — ｉｎ ｍｉ ｏ ｅａｃｄ ｓｏｅ ｆＣ ｏ ａ ｔ ｉ ｃ ａ Ｚ Ｕ ｎ —ｕ ，ｔ ． Ｆ ｃ ｌ ｏ ｏ ｓｒａ ｓ ｔ ｕ ｂｏ ａ ｙ
摘要 ： ６个不 同地 点 的五针 松 疱锈 病病 原 菌锈 孢 子作 温度 、 对湿度 、 用 相 酸碱度 、 营养条 件及 光照 条 件 ５个 因素 下 的孢 子 萌发 实验 ， 结果 表 明 ： 孢 子 的 萌发 率普 遍 低 ， 锈 一般 不超 过 １ ％； ０ ５℃ ０ 在 ～３ 均 可以 萌发 ， 最适 的 温 度 是 ２ ０～３ ０℃ ， 不 同 来 源 地 的孢 子 最 适 温 度 有 一 定 的 差 别 ； 对 湿度 但 相
ห้องสมุดไป่ตู้
茶 藤生 柱锈 菌 Ｃ ｏａｔ ｍ ｒ ｉ ｌ ． ． ｉ ｈｒ ｒｎ ｒｉ ｉ ｃ ａＪ Ｃ Ｆｓ ｅ ｕ ｂｏ ｃ 是世 界各 种五 针 松 的疱 锈病 病 原 菌 ， 我 国主 要 为 在
害红 松 Ｐ ｎ ｓｋ ｒｉ ｓ ｉｕ ｏａｅ ｉ 华 山松 Ｐ． ｒ ｎ ｉ， ｎ ｓ和 ａ ｍａ ｄ ｉ 且 广泛 分 布 于 东 北 、 南 、 北 和 山西 、 南 、 东 等 西 西 河 山 地 。该 菌 是 一 种 具 有 长 循 环 型 生 活 史 的 锈 菌 ， １ 其 ０ Ｉ阶 段 寄 生 于 五针 松 枝 干 上 ， Ⅲ 阶段 寄 生 ， Ⅱ， 在 茶藤 子属 Ｒ ｂｓｓｐ 和 马先 蒿属 Ｐ ｄｃ ｌｒ ｐ ． ｉｅ ｐ ． ｅ ｉ ａ ｉ ｓｐ ｕ ｓ 植 物上 。锈孢 子 在侵 染循 环 中 占有 重要 的地 位 。在
中 国森 林病 虫 ２ ０ ０ ６年 ５月 第 ２ ５卷 第 ３期
茶 藤 生 柱锈 菌 锈 孢 子 生 物 学 特性 研 究
周 兴 国 ， 永 和 ， 德 群 李 周
（ 西南林学院保护生物学学院 ， 云南 昆明 ６０２ ） ５ ２ ４
中 图分类 号 ：７ ３ １ 文献标 识码 ： 文 章编 号 ：６ １ ８ ６ ２ ０ ）３—０ ０ —０ Ｓ ６ ．５ Ａ １ ７ —０ ８ （０ ６ ０ ０１ ３
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摘要 ： ６个不 同地 点 的五针 松 疱锈 病病 原 菌锈 孢 子作 温度 、 对湿度 、 用 相 酸碱度 、 营养条 件及 光照 条 件 ５个 因素 下 的孢 子 萌发 实验 ， 结果 表 明 ： 孢 子 的 萌发 率普 遍 低 ， 锈 一般 不超 过 １ ％； ０ ５℃ ０ 在 ～３ 均 可以 萌发 ， 最适 的 温 度 是 ２ ０～３ ０℃ ， 不 同 来 源 地 的孢 子 最 适 温 度 有 一 定 的 差 别 ； 对 湿度 但 相
ห้องสมุดไป่ตู้
茶 藤生 柱锈 菌 Ｃ ｏａｔ ｍ ｒ ｉ ｌ ． ． ｉ ｈｒ ｒｎ ｒｉ ｉ ｃ ａＪ Ｃ Ｆｓ ｅ ｕ ｂｏ ｃ 是世 界各 种五 针 松 的疱 锈病 病 原 菌 ， 我 国主 要 为 在
害红 松 Ｐ ｎ ｓｋ ｒｉ ｓ ｉｕ ｏａｅ ｉ 华 山松 Ｐ． ｒ ｎ ｉ， ｎ ｓ和 ａ ｍａ ｄ ｉ 且 广泛 分 布 于 东 北 、 南 、 北 和 山西 、 南 、 东 等 西 西 河 山 地 。该 菌 是 一 种 具 有 长 循 环 型 生 活 史 的 锈 菌 ， １ 其 ０ Ｉ阶 段 寄 生 于 五针 松 枝 干 上 ， Ⅲ 阶段 寄 生 ， Ⅱ， 在 茶藤 子属 Ｒ ｂｓｓｐ 和 马先 蒿属 Ｐ ｄｃ ｌｒ ｐ ． ｉｅ ｐ ． ｅ ｉ ａ ｉ ｓｐ ｕ ｓ 植 物上 。锈孢 子 在侵 染循 环 中 占有 重要 的地 位 。在
2株重寄生木霉菌丝生长的生物学特性
2株重寄生木霉菌丝生长的生物学特性周利;肖斌;陈玉惠;李永和;王海清【期刊名称】《南京林业大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2008(32)1【摘要】对2株茶藨生柱锈菌（Cronartium ribicola J．C．Fischer）重寄生木霉（Trichoderma spp．）TR1、TR2菌株菌丝生长及产孢条件进行单因素筛选及正交实验。
结果表明：TR1菌丝生长速度快，且极易产生分生孢子；TR2菌丝生长速度相对较慢，产孢受一定条件限制。
光照和VB2能明显刺激TR2分生孢子的产生。
2株菌在以大麦粉、黄豆粉、KH2PO4、复合VB为培养基，5％接种量、120r／min、pH为6的条件下菌丝生长最佳。
TR1和TR2菌丝生长的最适温度范围及水势分别为25～30℃、-2．32MPa和20～25℃、-4．54MPa。
【总页数】4页(P95-98)【关键词】茶藨生柱锈菌;木霉菌株;生物学特性;菌丝生长【作者】周利;肖斌;陈玉惠;李永和;王海清【作者单位】西南林学院保护生物学院【正文语种】中文【中图分类】S476.1【相关文献】1.菌核重寄生菌盾壳霉生物学特性研究 [J], 高俊明;王双双;刘慧平;韩巨才2.高温胁迫对刺芹侧耳菌丝生长及其抗棘孢木霉能力的影响 [J], 刘秀明;邬向丽;陈强;仇志恒;张金霞;黄晨阳3.茶藨生柱锈重寄生木霉分生孢子萌发的生物学特性 [J], 陈玉惠;周利;李永和;林宏益4.核盘菌重寄生菌链孢粘帚霉HL-1-1菌株的生物学特性研究 [J], 马桂珍;李世东;张拥华;谢丙炎;吕国忠5.草酸对重寄生真菌盾壳霉分生孢子萌发和菌丝生长的影响 [J], 韦善君;李国庆;姜道宏;王道本因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
茶树主要病虫害及其防治措施
茶树主要病虫害及其防治措施01假眼小绿叶蝉识别：该虫属不完全变态昆虫，一生只经过卵、若虫和成虫三个阶段。
成虫体长3—4毫米，全身黄绿至绿色。
卵长约0.8毫米，香蕉形，若虫除翅尚未形成外，体形与体色与成虫相似。
该虫以成虫和若虫刺吸茶树嫩梢汁液为害。
被害芽梢生长受阻，新芽不发，为害严重时幼嫩芽叶呈枯焦状，无茶可采，全年以夏茶受害最重，成虫多栖息于茶丛叶层中，无趋光性，卵产于嫩梢组织中，若虫怕阳光直射，常栖息在嫩叶背面。
发生规律：一年发生9～12代，以成虫越冬，翌年早春，成虫开始取食孕卵，茶树发芽后开始产卵繁殖。
成虫有陆续孕卵和分批产卵习性，尤其是越冬代成虫的产卵期可长达1个月之久，因此各虫态混杂和世代重叠现象十分严重。
全年一般有两个发生高峰，6月份和10月份。
成、若虫在雨天和晨露时不活动，时晴时雨、留养及杂草丛生的茶园有利于该虫发生。
防治要点：(1)分批及时采茶或轻修剪能采除大量的卵，抑制其发展；(2)喷施白僵菌或植物源药剂进行防治；(3)叶蝉发生较大年份，冬季用石硫合剂封园。
02茶毛虫识别：成虫体长6—13毫米，雌蛾翅淡黄褐色，雄蛾翅黑褐色。
卵近圆形、集产。
幼虫黄褐色，各节的背面与侧面有8个绒球状毛瘤，上着生黄色毒毛、雌蛾产卵于老叶背面，幼虫有群集性，3龄前群集性很强，常数十头至数百头挤集在叶背取食下表皮和叶肉，留下表皮呈半透明黄绿色薄膜状。
3龄后开始分群迁散为害，咬食叶片呈缺刻。
幼虫老熟后爬至茶丛根际枯枝落下或浅土中结茧化蛹。
成虫有趋光性。
发生规律：一般一年发生2代。
以卵块在老叶背面越冬，翌年4月幼虫开始孵化，为害期分别在4—6月、7—9月之间。
防治要点:(1)利用茶毛虫的群集性，结合田问操作摘除孵块和虫群；(2)在茶毛虫核型多角体病毒流行年份，收集虫尸，喷施病毒；(3)灯光诱杀成虫；(4)在低龄幼虫期喷施Bt制剂。
03茶刺蛾识别：成虫体长12一16毫米，茶褐色、趋光性强。
卵散产于茶丛中、下部老叶背面的锯齿附近。
茶树病虫害及其综合治理
《茶树病虫害及其综合治理》xx年xx月xx日contents •茶树病虫害概述•茶树常见病害及防治方法•茶树常见虫害及防治方法•茶树病虫害综合治理措施•茶叶病虫害综合治理的实践应用•结论与展望目录01茶树病虫害概述茶树病虫害是指在茶树生长过程中，由于受到有害生物（如昆虫、病原菌、病毒等）的侵袭和感染，导致茶树出现生长不良、产量下降甚至死亡的现象。
茶树病虫害的定义茶树病虫害主要包括虫害和病害两大类。
虫害主要有茶小绿叶蝉、茶尺蠖、茶蚕等；病害主要有茶饼病、茶炭疽病、茶根腐病等。
茶树病虫害的分类茶树病虫害的定义和分类直接减少茶叶产量茶树病虫害会导致茶叶减产或绝收，如茶尺蠖大量繁殖会直接蚕食茶树叶片，造成茶叶产量大幅下降。
降低茶叶品质茶树病虫害不仅会直接减少茶叶产量，还会影响茶叶的品质和风味。
如茶叶病害会使茶叶出现斑点、腐烂等，严重影响茶叶的感官和营养价值。
茶树病虫害对茶叶产量的影响茶树病虫害的综合治理定期清理茶园，减少害虫滋生环境；合理施肥，增强茶树抗病能力；加强灌溉和排水，防止茶树受淹受旱。
加强茶园管理利用天敌（如寄生蜂、寄生蝇等）对茶树害虫进行生物防治，以减少化学农药的使用量和茶叶中的农药残留。
生物防治在害虫爆发时，可以使用化学农药进行防治，但需要注意科学合理用药，避免过度使用和滥用。
化学防治利用物理方法进行防治，如使用灯光诱杀、色板诱杀等。
物理防治02茶树常见病害及防治方法茶树常见病害概述传染性病害包括病毒、细菌、真菌等引起的病害。
非传染性病害主要由环境因素、化学物质等引起，如土壤过酸过碱、肥料烧伤等。
茶树病害分为传染性和非传染性两大类。
茶树感染病毒后，叶片出现花斑、畸形、脱落等症状，且病毒可借助昆虫传播。
茶树常见病害的症状和发生规律病毒病害茶树感染细菌后，叶片出现水渍状斑点，并伴有黄色或红色胶状物，严重时导致叶片脱落。
细菌病害茶树感染真菌后，叶片出现霉层、锈状物、黑点等症状，且真菌可借助气流和昆虫传播。
茶藨生柱锈菌(Cronartium ribicola)研究进展
茶藨生柱锈菌(Cronartium ribicola)研究进展韩长志【摘要】由茶藨生柱锈菌引起的红松疱锈病和华山松疱锈病,严重危害着红松、华山松等树种,为此,对茶藨生柱锈菌的分类地位、转主寄主以及遗传关系、防治措施等方面进行介绍,以期为有效防治该病菌提供理论依据,同时,为进一步深入研究该病菌指明方向.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2013(042)002【总页数】4页(P11-14)【关键词】茶藨生柱锈菌;转主寄主;生活史;遗传关系【作者】韩长志【作者单位】西南林业大学林学院,云南省森林灾害预警与控制重点实验室,云南昆明650224【正文语种】中文【中图分类】S763.1茶藨生柱锈菌（Cronartium ribicola）是我国重要的进境危险生物之一，可引起华山松疱锈病（也称五针松疱锈病或五针松干锈病）和红松疱锈病。
其主要危害20年生以下的华山松中幼林，导致受害华山松径围和材积量明显下降，当病害发生严重时可造成枝干枯萎，最终整株死亡；此外，在东北林区，该菌还可危害红松，给林业生产造成了严重损失。
鉴于茶藨生柱锈菌造成危害的严重性，从分类地位、生活史、遗传关系以及防治措施等方面对其进行阐述，以期为有效防治该病菌提供理论依据，同时，为进一步深入开展该病菌的基因组功能研究打下坚实的理论基础。
1 分类地位、分布情况及危害1.1 分类地位根据Ainsworth（1973）分类系统，茶藨生柱锈菌属于担子菌亚门（Basidiomycotina）、冬孢菌纲（Teliomycetes）、锈菌目（Uredinales）、栅锈科（Melampsoraceae）、柱锈属（Cronartium）。
1.2 分布情况及危害茶藨生柱锈菌主要分布于中国、美国、加拿大、日本、朝鲜等国，在我国的黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、河南、安徽、山东、山西、湖北、陕西、四川、甘肃、青海、宁夏、新疆、云南、贵州等地均有分布，其中，以引起东北林区的红松疱锈病和陕西、四川、云南三省的华山松疱锈病危害最为严重[1－2］。
茶藨子叶状层菌固体培养特性
茶藨子叶状层菌固体培养特性研究了6种不同培养基对茶藨子叶状层菌（Phylloporia ribis）菌丝形态、生长速度、生物量及三萜含量的影响。
结果表明：茶藨子叶状层菌菌丝体在麦芽汁、胡萝卜和PDA固体培养基中生长速度较快，在麦麸与PDA固体培养基中生物量较高，而在生长速度最慢的GPY固体培养基中，三萜含量最高。
茶藨子叶状层菌；固体培养；培养特性；三萜茶藨子叶状层菌（Phylloporia ribis）为锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）叶状层菌属（Phylloporia）真菌，发现于山东省平邑县，寄生在当地金银花树活体根茎韧皮部，当地人称之为“银花蛾子”。
茶藨子叶状层菌子实体的功效与金银花有相似之处，可用于消炎、解毒、止痛，当地居民用其治疗咽炎、喉炎、肝炎及癌症，有良好的临床治疗效果，具有很大的药用开发价值[1]。
由于受寄主和产地的限制，野生茶藨子叶状层菌采集量很低，限制了对其进一步的开发与利用，目前对它的研究主要集中在采集的野生子实体活性成分分析，而对于其人工培养方面的研究较少，因此，探讨其固体培养特性可为其下一步大规模人工培养奠定基础。
1 材料与方法1.1标本与菌种野生茶藨子叶状层菌（P. ribis）采集于山东省平邑县郑城镇西山的金银花树上（封三图1），子实体形状不规则，呈扁平状半圆形，菌盖表面粗糙，硬而韧，木质化，瓦状叠生排列，深棕色至浅栗色，有同心环状棱纹似年轮及细微绒毛，菌盖长为3～6 cm，宽为1.5～3.5 cm，无菌柄，子实体背面暗褐色，肉眼可见细小的管口，管口浅褐色至暗褐色，断面可见菌肉呈木质化的纤维质，棕黄色，菌管长1～2 mm。
经吉林农业大学菌物研究所图力古尔教授鉴定，该标本为茶藨子叶状层菌。
采用组织分离法分离菌种，将新鲜子实体标本用大量无菌水冲洗至表面无泥沙杂物，再用75%的酒精擦拭表面，将菌盖纵剖为二，用尖头镊子从剖面上取5 mm×5 mm的菌肉组织，置于PDA平板，25 ℃下暗培养，选取生长良好的菌丝，转接到PDA平板，反复纯化，选取生长健壮的菌丝转接至试管斜面PDA培养基，4 ℃冰箱保存。
茶薪菇病害病理及防治技术
茶薪菇病害病理及防治技术茶薪菇，又名茶树菇，是近年来深受国内外市场欢迎的一种时尚珍稀菇品，成为栽培品种的亮点。
但由于该菇的菌丝体和子实体含有一股杏仁香气味，所以诱发病虫害比较多，这其中多为病原菌与害虫侵染引起为害，称为侵染性病害。
栽培者往往未能很好地识别病态和病原，以致盲目采用化学农药处理，结果不但不能有效防治，反而导致菇体受害，产品农残超标，栽培效益欠佳。
这里就常见的侵染性病害特征与病原及防治措施介绍如下。
1.褐腐病受害的子实体停止生长，菌盖、菌柄的组织和菌褶均变为褐色，最后腐烂发臭。
病原菌为疣孢霉，多发生于含水量多的菌袋上，在气温20℃时发病增多。
主要是通过被污染的水或接触病菇的手、工具等传播，侵入子实体组织的细胞间隙中繁殖，引起发病。
防治措施①搞好菇棚消毒，培养基必须彻底灭菌处理；②出菇期间保湿和补水用水要清洁，同时加强通风换气，避免长期处于高温高湿的环境；③受害菇及时摘除、销毁，然后停止喷水，加大通风量，降低空间湿度；④采用链霉素1∶50倍溶液喷洒菌袋，杀灭蕴藏在袋内的病菌，避免第二茬长菇时病害覆发；⑤成菇及时采收，在菌盖未完全展开之前采收。
采收下来的鲜菇，及时销售或加工处理，夏季存放时间不宜过长。
2.软腐病受害的菌盖萎缩，菌褶、菌柄内空，弯曲软倒，最后枯死，僵缩。
病原菌为茄腐镰孢霉侵蚀子实体组织形成一层灰白色霉状物，此为部分孢子梗及分生孢子。
此病菌平时广泛分布在各种有机物上，空气中飘浮的分生孢子，在高温高湿条件下发病率高，侵染严重的造成欠收。
防治措施①原料曝晒，培养基配制时含水量不超60%，装袋后，灭菌要彻底；②接种选择午夜气温低时进行，严格无菌操作；③菌袋开口诱基前，用50%敌敌畏乳油1000倍喷洒杀菌，开口后控制23～25℃适温，空间相对湿度80%；④幼菇阶段发病时，可喷洒pH8的石灰上清液，或用低毒20%三唑铜乳油1500倍液喷雾杀灭。
成菇期发生此病，提前采收，并用5%石灰水浸泡，产品经清水洗后烘干。
茶树栽培过程的污染防治技术
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茉莉花茶中农药残留的来源浅析
袁玉伟 （青岛市农业科学研究所， -33+.. ）
茉莉花茶素以清新幽雅的花香、 醇爽的茶味深受消费者的 青睐， 是我国生产的主要茶类之一， 也是中国出口比较重要的 茶类。随着食品生产的无公害化， 越来越多的消费者开始关注 茶叶中的农药残留问题。 关于花茶的农药残留来源， 很少有报道。笔者曾对花茶中 农药残留来源的主要途径做过初步研究， 发现花茶的农药残留 与茶坯、 茉莉鲜花和残留在花茶中的花干有着直接或间接的渊 源关系。 因此控制花茶农 + 茶坯是茉莉花茶中农药残留的直接污染源， 药残留还是应从源头抓起， 因为花茶的茶坯大多为夏茶加工而 成， 农药残留相对含量比较高，从而对花茶的农药残留容易超 标造成直接影响。 - 花茶 在 窨 花 过程 中 发 生 了残 留 农 药 的转 移 ， 即 发 生从 花 到茶的转移， 转移的途径是比较复杂的， 这种转移与农药的 种 类有 关 系 ， 但 就 其 原 理 来 说 基 本 符 合 茶 坯 的 吸 香 理 论 即 “ 吸 香先 吸 湿 ” 。菊 酯 类 农 药的 转 移 率 相对 其 它 农 药 来说 比 较大， 一般在鲜花中残留的 34 5 64 左右。实验表明， 鲜花 中的氰戊菊酯的残留在 /, 278 9 :8 时， 转移到茶坯中的量大 约为 ., -678 9 :8 。当然， 花茶在加工过程中农药残留的转移 还与下花量、 窨花次数和茶坯含水量有关系。转移量一般是 随着下花量、 窨花次数的增加而增加； 随着茶坯含水量的增 加而降低。 这取决于花干含 / 花茶中花干含量对农药残留有潜在影响， 量和花干中农药残留含量的高低。笔者曾对花茶的农残检测 样中的花干进行统计， 花茶中花干含量在 ., +.4 ; ., <.4 之 间不等， 模拟花茶中不同花干含量的实验结果如表 + 。
不同液体培养基对茶藨子叶状层菌生长代谢的影响
山东科学ＳＨＡＮＤＯＮＧＳＣＩＥＮＣＥ第３６卷第５期２０２３年１０月出版Ｖｏｌ.３６Ｎｏ.５Ｏｃｔ.２０２３收稿日期:２０２２￣１０￣０９基金项目:浙江大学山东(临沂)现代农业研究院服务地方经济发展项目(ＺＤＮＹ￣２０２１￣ＦＷＬＹ０２０１４)ꎻ２０２２年山东省青创团队项目(２０２２ＫＪ１１６)作者简介:孙立娇(１９９９ )ꎬ女ꎬ研究方向为中药学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:２０７４８７７７８０＠ｑｑ.ｃｏｍ∗通信作者ꎬ赵志龙ꎬ男ꎬ副教授ꎬ研究方向为中药微生物天然产物ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｏｚｈｉｌｏｎｇ＠ｌｙｕ.ｅｄｕ.ｃｎ不同液体培养基对茶藨子叶状层菌生长代谢的影响孙立娇１ꎬ孙迪２ꎬ程显好３ꎬ史晓委１ꎬ赵志龙１∗(１.临沂大学医学院ꎬ山东临沂２７６０００ꎻ２.浙江大学山东(临沂)现代农业研究院ꎬ山东临沂２７６０００ꎻ鲁东大学农学院ꎬ山东烟台２６４０００)摘要:茶藨子叶状层菌(Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｉａｒｉｂｉｓ)是一种寄生于５年以上金银花活体根茎韧皮部的药食两用真菌ꎬ具有抗炎㊁抗病毒等作用ꎮ采用４种液体培养基对茶藨子叶状层菌进行人工培养ꎬ并探究不同培养基对生物量㊁三萜㊁多糖及腺苷含量的影响ꎮ结果表明:茶藨子叶状层菌在马铃薯液体培养基和忍冬马铃薯液体培养基中多糖含量较高ꎬ分别为２.９１０ｍｇ/ｇ和２.７０８ｍｇ/ｇꎬ在忍冬麦麸培养基中生物量为３.２８０ｍｇ/ｇ㊁三萜为６.４２６ｍｇ/ｇ㊁腺苷为３.１８２ｍｇ/ｇꎬ含量均高于其他三种培养基ꎮ本研究为大规模人工培养茶藨子叶状层菌提供参考ꎮ关键词:茶藨子叶状层菌ꎻ液体培养ꎻ忍冬ꎻ代谢产物中图分类号:Ｑ９３￣３３５㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００２￣４０２６(２０２３)０５￣００２７￣０６开放科学(资源服务)标志码(ＯＳＩＤ):ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆＰｈｙｌｌｏｐｏｒｉａｒｉｂｉｓＳＵＮＬｉｊｉａｏ１ꎬＳＵＮＤｉ２ꎬＣＨＥＮＧＸｉａｎｈａｏ３ꎬＳＨＩＸｉａｏｗｅｉ１ꎬＺＨＡＯＺｈｉｌｏｎｇ１∗(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＬｉｎｙｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬｉｎｙｉ２７６００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.Ｓｈａｎｄｏｎｇ(Ｌｉｎｙｉ)ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｏｄｅｒｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬｉｎｙｉ２７６００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｃｈｏｏｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＬｕｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹａｎｔａｉ２６４０００ꎬＣｈｉｎａ)ＡｂｓｔｒａｃｔʒＰｈｙｌｌｏｐｏｒｉａｒｉｂｉｓꎬａｔｙｐｅｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌａｎｄｅｄｉｂｌｅｆｕｎｇｕｓｔｈａｔｐａｒａｓｉｔｉｚｅｓｔｈｅｐｈｌｏｅｍｏｆＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａｒｏｏｔｓｔｏｃｋｆｏｒｍｏｒｅｔｈａｎ５ｙｅａｒｓꎬｈａｓａｎｔｉ￣ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｎｄａｎｔｉｖｉｒａｌｅｆｆｅｃｔｓ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｆｏｕｒｔｙｐｅｓｏｆｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉａ(ＰＤꎬＬＰＤꎬＭＦꎬＬＭＦ)ｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｉｔｓａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｕｌｔｕｒｅ.Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉａｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｎｄａｄｅｎｏｓｉｎｅｉｎｔｈｅｂｉｏｍａｓｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＰｈｙｌｌｏｐｏｒｉａｒｉｂｉｓｗｅｒｅｈｉｇｈｉｎＰＤａｎｄＬＰＤｍｅｄｉａ(２.９１０ｍｇ/ｇａｎｄ２.７０８ｍｇ/ｇꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ).ＴｈｅｂｉｏｍａｓｓꎬｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄꎬａｎｄａｄｅｎｏｓｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＰｈｙｌｌｏｐｏｒｉａｒｉｂｉｓｉｎＬＭＦｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅ３.２８０ｍｇ/ｇꎬ６.４２６ｍｇ/ｇꎬａｎｄ３.１８２ｍｇ/ｇꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｈｉｃｈｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｏｔｈｅｒｔｈｒｅｅｍｅｄｉａ.Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｓａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＰｈｙｌｌｏｐｏｒｉａｒｉｂｉｓ.ＫｅｙｗｏｒｄｓʒＰｈｙｌｌｏｐｏｒｉａｒｉｂｉｓꎻｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅꎻＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａＴｈｕｎｂ.ꎻｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ㊀㊀茶藨子叶状层菌(Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｉａｒｉｂｉｓ)属于锈革孔菌科(Ｈｙｍｅｎｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ)叶状层菌属(Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｉａ)ꎬ是一种寄生于５年以上忍冬科植物金银花活体根茎韧皮部的药食两用真菌[１￣２]ꎮ该菌含有甾醇㊁有机酸㊁多糖㊁三萜和苯乙烯基吡喃酮等化学成分[３￣５]ꎬ其中化合物ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｎＡ㊁ｃｒｏｔｏｔｒｏｐｏｎｅ及核苷类成分等具有显著的抗炎㊁抗病毒活性[５]ꎬ多糖类化合物具有抗肿瘤[６]㊁促进免疫调节等药理作用[７￣９]ꎬ且毒理研究表明其安全无毒[９￣１０]ꎮ作为新资源食品以及民间常用药ꎬ广泛用于防治咽炎㊁扁桃体炎等口腔炎症ꎬ在医疗保健方面展现出重要的开发价值ꎬ应用前景广阔ꎮ茶藨子叶状层孔菌作为非腐生类真菌ꎬ对生长条件要求严苛ꎬ野生菌稀少ꎬ严重限制了茶藨子叶状层孔菌的深入开发ꎮ因此ꎬ茶藨子叶状层菌的人工培养是对其开发利用具有重要意义ꎮ近年来ꎬ国内学者对于该菌的人工培养已展开初步相应研究ꎬ陈蒙蒙等[２]采用６种固体培养基人工培养ꎬ发现该菌在麦芽汁固体培养基中生长速度最快ꎬ在麦麸固体培养基中色素积累明显较多ꎬ且生物量最高ꎬ而在ＧＰＹ培养基(葡萄糖蛋白胨酵母膏培养基)中培养４０ｄ左右三萜含量最高ꎮ周丽思等[１１]通过添加不同生药量忍冬茎水提取物对茶藨子叶状层菌发酵的影响进行了探究ꎬ忍冬茎水提物可显著提高菌丝体中麦角甾醇㊁总多糖等含量ꎮ因此ꎬ基于茶藨子叶状层菌的生长习性[１ꎬ３]以及其他真菌的人工培养研究基础[１１￣１９]ꎬ本文采用４种不同液体培养基ꎬ对该菌进行人工液体培养ꎬ探究不同液体培养基对茶藨子叶状层菌代谢的影响ꎬ为茶藨子叶状层菌的人工培养提供思路ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验仪器ＳＷ￣ＣＪ￣２Ｄ超净工作台(苏州净化)㊁ＹＸＱ￣７５Ｓ１１高压灭菌锅(上海博讯)㊁ＨＮＹ恒温振荡培养箱(天津欧诺)㊁ｐＨ计㊁旋转蒸发仪㊁高效液相色谱仪(华普仪器)㊁ＺｏｒｂａｘＥｘｔｅｎｄ￣Ｃ１８色谱柱㊁ＺＦ紫外分光光度计(上海康华)㊁ＫＱ￣５００ＤＥ超声波清洗机ꎮ１.２㊀实验材料供试菌株鲁东大学提供ꎬ经ＩＴＳ序列鉴定ꎬ为茶藨子叶状层菌(Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｉａｒｉｂｉｓ)ꎮ菌丝体培养试剂:ＰＤ培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)㊁葡萄糖㊁麸皮㊁蛋白胨㊁磷酸二氢钾㊁硫酸镁㊁忍冬藤ꎮ多糖含量检测剂:葡萄糖㊁６％苯酚㊁硫酸㊁磷酸二氢钾㊁磷酸氢二钾㊁无水乙醇㊁丙酮㊁乙醚ꎮ三萜含量检测剂:齐墩果酸标准品(上海源叶生物科技有限公司)㊁９５％乙醇(体积分数)㊁５％香草醛冰醋酸溶液(体积分数)㊁高氯酸㊁冰醋酸ꎮ腺苷含量检测剂:腺苷标准品(上海源叶生物科技有限公司)㊁５０％甲醇(体积分数)㊁甲醇(分析纯㊁色谱纯)ꎮ１.３㊀培养基及其制备方法ꎮ茶藨子叶状层菌液体培养基配方见表１ꎮ表１㊀茶藨子叶状层菌液体培养基配方Ⅱ忍冬马铃薯液体培养基(ＬＰＤ)２００ｇ马铃薯∗ꎬ２０ｇ葡萄糖ꎬ忍冬枝叶６０ｇ∗Ⅲ麦麸液体培养基(ＭＦ)４０ｇ麸皮∗ꎬ２ｇ蛋白胨ꎬ２５ｇ葡萄糖ꎬ０.５ｇ磷酸二氢钾ꎬ０.２５ｇ硫酸镁Ⅳ忍冬麦麸液体培养基(ＬＭＦ)４０ｇ麸皮∗ꎬ２ｇ蛋白胨ꎬ２５ｇ葡萄糖ꎬ０.５ｇ磷酸二氢钾ꎬ０.２５ｇ硫酸镁ꎬ忍冬枝叶６０ｇ∗㊀㊀注:∗为煮汁处理ꎬ加入５００ｍＬ去离子水ꎬ蒸煮过滤汁液ꎬ定容至１Ｌꎮ液体培养基按上述配方准确称重ꎬ搅拌均匀后ꎬ以８０ｍＬ/瓶分装至２５０ｍＬ的锥形瓶中ꎬ１２１ħ灭菌３０ｍｉｎꎮ１.４㊀实验方法１.４.１㊀菌种的制备菌种的活化:取４ħ保藏的茶藨子叶状层菌接种至ＰＤＡ(马铃薯固体培养基)培养基中ꎬ置于恒温培养箱ꎬ２８ħ培养１５ｄꎮ一级摇瓶种子制备:活化菌种生长直径至５ｃｍ时ꎬ无菌打孔器制备茶藨子叶状层菌菌块ꎬ挑取菌块接种至ＰＤ培养基中ꎬ置于恒温振荡培养箱中ꎬ２２０ｒ/ｍｉｎꎬ２８ħ培养８ｄꎮ二级摇瓶种子制备:取５ｍＬ一级种子培养液ꎬ接种于二级摇瓶种子ＰＤ培养基中ꎬ２２０ｒ/ｍｉｎꎬ２８ħ培养７ｄꎮ测试培养基的接种与培养:取５ｍＬ二级摇瓶种子培养液ꎬ接种于不同培养基中ꎬ２２０ｒ/ｍｉｎꎬ２８ħ培养１０ｄꎮ１.４.２㊀生物量的测定采用滤纸过滤法定期测定各培养基中茶藨子叶状层菌菌丝体生物量ꎮ发酵结束后ꎬ发酵液离心弃上清ꎬ沉淀物置于烘箱中ꎬ１００ħ烘干至恒重ꎮ蒸馏水洗涤沉淀３次ꎬ８０ħ烘干至恒重ꎬ获得菌丝生物量ꎮ１.４.３㊀ｐＨ的测定以ｐＨ计对发酵液ｐＨ进行测定ꎬ具体方法依照ＧＢ６９２０ １９８６«水质ｐＨ值的测定玻璃电极法»[２０]规定方法ꎬ同一样品重复测定３次ꎮ１.４.４㊀三萜含量测定采用香草醛－冰醋酸法测定忍冬茶藨子叶状层孔菌三萜含量[２１￣２２]ꎮ收集菌丝烘干至恒重后研磨ꎬ称取０.５ｇ菌丝粉末置于１５ｍＬ试管中ꎬ加入８ｍＬ７０％乙醇溶液(体积分数)ꎬ用超声波(４２ｋＨｚ)室温提取１.５ｈꎬ收集上清液ꎬ沉淀继续用６ｍＬ７０％乙醇根据以上条件重复提取２次ꎬ合并３次提取液ꎬ２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ取上清液ꎬ７０％乙醇定容至２０ｍＬꎬ即得醇提样液ꎮ１.４.５㊀多糖含量测定采用硫酸苯酚法测定忍冬茶藨子叶状层孔菌多糖含量[２２￣２５]ꎮ称取０.５ｇ菌丝体粉末加水１５ｍＬꎬ沸腾２ｈꎬ浸泡过夜ꎬ纱布过滤后ꎬ残渣重复上述步骤两次ꎬ合并滤液ꎬ将所获得滤液加热浓缩至原体积的１/５ꎬ再向其中缓慢加入４倍浓缩液体积的无水乙醇ꎬ置于４ħ冰箱中过夜醇沉ꎬ２０００ｒ/ｍｉｎ离心后倾去上清液得到沉淀ꎬ依次用无水乙醇㊁丙酮㊁乙醚洗涤后再用蒸馏水溶解ꎬ最后在１００ｍＬ容量瓶中定容ꎬ即得多糖样品溶液ꎮ１.４.６㊀腺苷含量测定采用高效液相色谱法测定茶藨子叶状层菌腺苷含量[２６]ꎮ取５支１０ｍＬ具塞试管ꎬ分别精确称取四种茶藨子叶状层菌菌丝粉末０.５ｇꎬ分别加入５ｍＬ的５０％的甲醇溶液ꎬ超声(１００Ｗꎬ６０ħ)震荡溶解３０ｍｉｎ后收集上清液ꎮ收集沉淀物ꎬ重复提取２次ꎬ合并３次提取液ꎬ２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ取上清液ꎮ旋干后加入甲醇５ｍＬ溶解ꎬ压滤获得腺苷样品液[２６]ꎮ色谱柱为ＺｏｒｂａｘＥｘｔｅｎｄ￣Ｃ１８(４.６ｍｍˑ１５０ｍｍꎬ４μｍ)ꎻ流动相为甲醇－水(体积比为１ʒ９)ꎻ流速为１ｍＬ/ｍｉｎꎻ检测波长为２６０ｎｍꎻ进样量５μＬꎮ１.４.７㊀数据分析采用Ｅｘｃｅｌ２０１０软件和ＳＰＳＳ２１软件进行数据分析和标准差分析ꎮ所有试验重复３次ꎬ结果为(平均值ʃ标准差)表示ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀不同培养基对茶藨子叶状层菌菌丝体生长的影响在同等培养条件下ꎬ在不同培养基中生长的茶藨子叶状层菌菌丝生长特性及生物量具有明显差别(表２)ꎮＬＭＦ培养基的菌丝生物量最高ꎬ达到３.２８ｇꎬ其他依次为ＭＦ培养基㊁ＬＰＤ培养基和ＰＤ培养基ꎮ同时ꎬ通过检测各培养基的发酵液ｐＨ发现ꎬ茶藨子叶状层菌的适宜ｐＨ在５.０~５.３之间ꎮ表２㊀不同培养基对茶藨子叶状层菌菌丝体生长的影响ＬＰＤ１８ｄ内呈球状ꎬ直径约３~５ｍｍꎬ后渐呈丝絮状黄褐色浅褐色ꎬ清香５.６５０ʃ０.６７９２.８００ʃ０.０９０ＭＦ２２ｄ内呈球状ꎬ直径约２~５ｍｍꎬ后渐呈丝絮状浅黄色黄色ꎬ无清香５.１９０ʃ０.１０９２.８２０ʃ０.４４０ＬＭＦ１６ｄ内呈球状ꎬ直径约３~８ｍｍꎬ后渐呈丝絮状褐色褐色ꎬ清香５.１５０ʃ０.０８９３.２８０ʃ０.６４３２.２㊀不同培养基对茶藨子叶状层菌三萜含量的影响在三萜含量比较中ꎬ经ＬＭＦ培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝三萜含量最高ꎬ三萜含量达到６.４２６ｍｇ/ｇꎬ其次是ＬＰＤ培养基和ＰＤ培养基ꎬ分别为３.３１３ｍｇ/ｇ和２.７０３ｍｇ/ｇꎬ经培养基ＬＰＤ培养的忍冬茶藨子叶状层孔菌虽然生物量较高ꎬ但三萜成分含量最低ꎬ仅有２.３３３ｍｇ/ｇꎮ在茶藨子叶状层菌三萜产量方面ꎬ产量从高到低依次为培养基ＬＭＦ㊁培养基ＭＦ㊁培养基ＰＤ㊁培养基ＬＰＤꎮ在所有培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝中ꎬ经培养基ＬＭＦ培养的茶藨子叶状层菌菌丝三萜产量最高ꎬ８０ｍＬ发酵液中ꎬ达到１.９２８ｍｇꎬ与其余三种培养基相比ꎬ具有显著差异(Ｐ<０.０５)ꎬ三萜产量最低的是ＬＰＤ培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝ꎮ以茶藨子叶状层菌三萜为目标产物时ꎬ应首选培养基ＬＭＦ培养基作为茶藨子叶状层菌菌丝发酵培养基ꎮ表３㊀茶藨子叶状层菌在不同培养基中的三萜产量与含量每８０ｍＬ发酵液三萜产量/ｍｇ０.８１１ʃ０.０４８０.７００ʃ０.０７６０.９９４ʃ０.０６８１.９２８ʃ０.２６９三萜含量/(ｍｇ ｇ－１)２.７０３ʃ０.１６１２.３３３ʃ０.２５２３.３１３ʃ０.２２８６.４２６ʃ０.８９８２.３㊀不同培养基对茶藨子叶状层菌腺苷含量和产量的影响在腺苷含量比较中ꎬ经ＬＭＦ培养基培养的茶藨子叶状层孔菌菌丝腺苷含量最高ꎬ达到３.１８２ｍｇ/ｇꎬ腺苷含量由高到低依次为ＬＰＤ培养基㊁ＭＦ培养基㊁ＰＤ培养基ꎬ分别为２.８５３㊁１.７５２㊁０.９８８ｍｇ/ｇꎮ在茶藨子叶状层菌腺苷产量方面ꎬ产量从高到低依次为ＬＭＦ培养㊁ＬＰＤ培养㊁ＭＦ培养基㊁ＰＤ培养基ꎮ在所有培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝中ꎬＬＭＦ培养中茶藨子叶状层菌菌丝腺苷产量最高ꎬ８０ｍＬ发酵液中ꎬ达到０.９５４ｍｇꎬ与其余３种培养基相比ꎬ具有显著差异(Ｐ<０.０５)ꎬ腺苷产量最低的是经ＰＤ培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝ꎮ以高产茶藨子叶状层菌腺苷为目标产物时ꎬ应首选ＬＭＦ培养基作为茶藨子叶状层菌菌丝发酵培养基ꎮ表４㊀茶藨子叶状层菌在不同培养基中的腺苷产量与含量每８０ｍＬ发酵液腺苷产量/ｍｇ０.２９６ʃ０.００２０.８５６ʃ０.００２０.５２６ʃ０.００５０.９５４ʃ０.００５腺苷含量/(ｍｇ ｇ－１)０.９８８ʃ０.００５２.８５３ʃ０.００７１.７５２ʃ０.０１７３.１８２ʃ０.０１８２.４㊀不同培养基对茶藨子叶状层菌多糖含量和产量的影响不同培养基对茶藨子叶状层菌多糖的含量和产量影响见表５ꎮ在多糖含量比较中ꎬ经ＰＤ培养基培养的忍冬茶藨子叶状层孔菌菌丝多糖含量最高ꎬ高达２.９１ｍｇ/ｇꎬ培养ＬＰＤ中的忍冬茶藨子叶状层孔菌菌丝多糖含量为２.７０８ｍｇ/ｇꎬ培养基ＭＦ中的忍冬茶藨子叶状层孔菌菌丝多糖含量为２.４９８ｍｇ/ｇꎬ经培养ＬＭＦ培养的忍冬茶藨子叶状层孔菌菌丝生物量㊁三萜含量以及腺苷含量均最高ꎬ但其多糖含量仅有２.３１１ｍｇ/ｇꎬ相较其他培养基ꎬ多糖含量最低ꎮ在茶藨子叶状层菌多糖产量方面ꎬ产量从高到低依次为培养基ＰＤ㊁培养基ＬＰＤ㊁培养基ＭＦ㊁培养基ＬＭＦꎮ在所有培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝中ꎬ培养基ＰＤ中茶藨子叶状层菌菌丝多糖产量最高ꎬ８０ｍＬ发酵液中ꎬ达到０.８７３ｍｇꎬ与培养基ＬＰＤ中的菌丝相比差异不明显ꎬ不具有统计学意义ꎬ与培养基ＭＦ㊁培养基ＬＭＦ相比ꎬ具有显著差异(Ｐ<０.０５)ꎬ多糖产量最低的是经ＬＭＦ培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝ꎮ以高产茶藨子叶状层菌多糖为目标产物时ꎬ应首选培养基ＰＤ培养基作为茶藨子叶状层菌菌丝发酵培养基ꎮ表５㊀不同培养基对茶藨子叶状层菌多糖产量与含量的影响每８０ｍＬ发酵液多糖产量/ｍｇ０.８７３ʃ０.１４３０.８１２ʃ０.０６７０.７４９ʃ０.０６９０.６９３ʃ０.０８１多糖含量/(ｍｇ ｇ－１)２.９１ʃ０.４７７２.７０８ʃ０.２２３２.４９８ʃ０.２３１２.３１１ʃ０.２７０３㊀讨论综上实验结果发现ꎬ添加忍冬茎叶水提液的培养基更适合茶藨子叶状层菌的发酵培养ꎬＬＰＤ与ＬＭＦ培养基中菌丝体生物量明显增加ꎬ其菌丝疏松ꎬ有利于菌丝高效利用发酵液中的营养物质与溶解氧ꎬ从而生长速度提高ꎮ同等条件下培养６０ｄꎬＬＭＦ培养基产出的菌丝生物量㊁腺苷含量以及三萜含量最高ꎬ菌丝干重高达１６４.０ｍｇꎬ三萜含量高达０.６４％ꎬ是ＧＰＹ培养基的１.６５倍左右ꎬ腺苷含量高达０.３２％ꎬ综合生物量㊁三萜㊁多糖以及腺苷等多个指标来看ꎬ适宜茶藨子叶状层菌发酵的培养基由高到低依次为ＬＭＦ㊁ＬＰＤ㊁ＭＦ㊁ＰＤꎮ虽然人工菌丝培养取得一定进展ꎬ但茶藨子叶状层菌的产量较低ꎬ仍未达到大规模生产的要求ꎬ还需要进一步探索ꎮ参考文献:[１]张小青ꎬ戴玉成.中国真菌志第二十九卷锈革孔菌科[Ｍ].北京:科学出版社ꎬ２００５:１６９￣１７０.[２]陈蒙蒙ꎬ程显好ꎬ孙磊ꎬ等.茶藨子叶状层菌固体培养特性[Ｊ].食用菌学报ꎬ２０１５ꎬ２２(４):３７￣３９.ＤＯＩ:１０.１６４８８/ｊ.ｃｎｋｉ.１００５￣９８７３.２０１５.０４.００７.[３]范轶欧ꎬ陈敏ꎬ周雯ꎬ等.茶藨子叶状层菌研究概况及开发利用[Ｊ].辽宁中医药大学学报ꎬ２０１３ꎬ１５(１):９１￣９４.ＤＯＩ:１０.１３１９４/ｊ.ｊｌｕｎｉｖｔｃｍ.２０１３.０１.９３.ｆａｎｙｏ.０５５.[４]刘玉红ꎬ徐凌川ꎬ王建平ꎬ等.茶藨子叶孔菌化学成分的研究[Ｊ].中药材ꎬ２００５ꎬ２８(１１):９９８￣９９９.ＤＯＩ:１０.１３８６３/ｊ.ｉｓｓｎ１００１￣４４５４.２００５.１１.０１４[５]于秀玲ꎬ白丽君ꎬ李琳ꎬ等.茶藨子叶状层菌化学成分及其体外抗病毒活性[Ｊ].中成药ꎬ２０２０ꎬ４２(７):１７７７￣１７８１.ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１￣１５２８.２０２０.０７.０１９.[６]牟玥静ꎬ方磊ꎬ李佳ꎬ等.茶藨子叶状层菌的化学成分及抗肿瘤活性研究进展[Ｊ].中国药房ꎬ２０１６ꎬ２７(４):５４２￣５４４. 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重金属锌、镉对蔬菜胁迫的研究分析
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何赟等[8]利用正交实验方法,对香茶藨子进行扦插繁殖试验，发现珍珠岩作为基质可促进香茶藨子生根。
与本试验结果一致，以珍珠岩作为基质能够促进茶藨子生根，且基质粒径越小生根率越高，这可能是基质粒径小会形成较小的空气孔隙，更有利于愈伤组织的形成。
高林等[9]采用不同激素处理石生茶藨子绿枝扦插，发现700mg/L ABT+IBA+NAA （V ︰V ︰V=1︰1︰1）处理插穗效果最好，成活率最高，可达69%[9]。
李建军等[10]认为，以华蔓茶藨子嫩枝为材料，采用100mg/kg NAA 和IBA 浸泡30min 的生根率较高，且IBA 效果明显优于NAA 。
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第 39 卷 第 5 期 2011 年 5 月
东 北 林 业 大 学 学 报 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY
Vol． 39 No． 5 May 2011
茶藨生柱锈重寄生木霉产毒条件的优化
李永艳 陈玉惠 敖新宇
（ 西南林业大学， 650224 ） 昆明，
表4 方差来源 A（ 蔗糖） B（ KNO3 ） C（ KH2 PO4 ） D（ MgSO4 ） 重寄生木霉 SS003 产毒条件正交试验方差分析结果 锈孢子死亡率 偏差平方和 自由度 443． 326 2 573． 509 439． 803 3． 388 2 2 2 F值 菌丝干质量 偏差平方和 1． 215 0． 122 × 10 － 4 1． 571 0． 010 × 10 － 4 1． 205 0． 014 × 10 － 4 0． 009 0． 003 × 10 － 4 F值 自由度 2 3． 288 * 2 0． 259 2 2 0． 385 0． 069
1
1． 1
材料与方法
供试材料 分离自茶藨生柱锈 供试菌株为重寄生木霉 SS003 菌株， ［7 ］ 菌锈孢子堆 ， 由西南林业大学提供。供试锈孢子于 2010 年 3 月中旬采自云南省昆明市东川区二二二林场的华山松疱锈
1 ） 西南林业大学重点基金项目 （ 110706 ） ； 云南省森林灾害预警 与控制重点实验室资助项目 （ ZK09A105 ） 。 1984 年 12 月生， 第一作者简介： 李永艳， 女， 西南林业大学保护 生物学学院， 硕士研究生。 通信 作 者： 陈 玉 惠， 西 南 林 业 大 学 基 础 部， 教 授。 E － mail： cyh196107@ 126． com。 收稿日期： 2010 年 10 月 22 日。 责任编辑： 程 红。
产毒培养基的筛选 SS003 在供试的 5 种培养基中均能生长和产毒 ， 但产毒 能力及生长量存在较大差异 （ 表 2 ） 。 相同培养时间内 （ 8 d） ， SS003 在 Richard 培养液中产毒最强， 其锈孢子死亡率（ 88． 75% ） 较对照（ 15． 00% ） 高 73． 75% ； Czapek 培养液中次之， 其锈孢 子死亡率（ 80． 00% ） 较对照 （ 20． 00% ） 高 60． 00% ； PSK 培养液 中最差， 锈孢子死亡率（ 35． 00% ） 仅比对照（ 5． 67% ） 高 29． 33% 。 5 种培养液中， PD 培养液最利于 SS003 菌丝生长， 8 d 后的菌 Richard 培养液次之 丝干质量每 100 mL 培养物达 0． 953 5 g， （ 菌丝干质量每 100 mL 培养物 0． 413 8 g） ， 而其余 3 种培养液 菌丝干质量每 100 mL 培养物均 均不利于 SS003 菌丝的生长， 5 种培养基中， Richard 和 PD 较适合 SS003 不足 0． 1 g。因此， Richard 培养基更适合产毒培 菌株的产毒和菌丝生长 。其中， 养， 而 PD 培养基则更适合菌丝生长 。
锈孢子对 SS003 产毒的影响： 在装有 100 mL 产毒最佳的 Richard 培养液的三角瓶里加入锈孢子 （ 5 g / L ） ， 连续振荡培 养 8 d 后制备毒素原液并进行生物测定和生物量测定 。 以未 加入锈孢子的毒素原液为对照 。每处理重复 3 次。
2
2． 1
结果与分析
注： * 表示 F 检验， 具有显著性差异。F0． 1 = 3． 110。F0． 05 = 4． 460。
Hale Waihona Puke 4 个因子影响 SS003 产毒的主次顺序为： B、 C、 A、 D， 最优组合 为 B2 C2 A3 D3 。由于该组合不在正交试验安排之列 ， 需对其验 证。验证结果表明， 该培养基组合的毒素原液对锈孢子的致 死率（ 75． 00% ） 高于正交表中任何培养基组合的毒素原液对 锈孢子的致死率。而 4 个营养因子对 SS003 生物量的影响由 C、 B、 D， 大到小为： A、 最优组合为 A3 C3 B1 D2 。
第5 期
李永艳等： 茶藨生柱锈重寄生木霉产毒条件的优化
103
ard） 和再减半试验（ 1 /4 Richard） 。以 Richard 培养液的毒素原 液为对照进行生物测定和生物量测定。每处理重复 3 次。
表1 水平 1 2 3 A（ 蔗糖） 20 30 50 正交试验因子水平 因 B（ KNO3 ） 5 10 15 子 C（ KH2 PO4 ） 2． 5 5． 0 7． 5 g·L － 1 D（ MgSO4 ） 2． 0 2． 5 3． 0
1）
摘 要 运用产毒培养基筛选、 锈孢子诱导和正交试验对茶 藨生柱锈重寄生木霉 SS003 菌株 （ Trichoderma atroviride） 的产毒营养条件进行优化 。结果表明， SS003 在 5 种产毒培养基中均能产毒和生长 ， 但 Richard 培养基更 PD 培养基则更适合菌丝生长 ； 茶 藨 生柱锈的锈孢子对产毒具有一定抑制作用 ； SS003 菌株的最佳 适合产毒培养， KNO3 10． 00 g / L、 KH2 PO4 5． 00 g / L、 MgSO4 3． 00 g / L 和 FeCl3 0． 02 g / L， 培养液中 产毒营养组合为： 蔗糖 50． 00 g / L、 各个营养元素的减量不利于毒素的产生 。 关键词 茶藨生柱锈菌； 重寄生木霉； 正交试验； 锈孢子； 毒素 分类号 Q939． 95 Optimal Conditions for Toxin Production of Mycoparasite Trichoderma atroviride on Cronartium ribicola / Li Yongyan，Chen Yuhui，Ao Xinyu（ School of Conservation Biology，Southwest Forestry University，Kunming 650224 ，P． R． China） / / Journal of Northeast Forestry University． － 2011 ， 39 （ 5 ） ． － 102 ～ 104 An experiment was conducted to optimize the nutritional conditions for toxin production of mycoparasite SS003 strain （ Trichoderma atroviride） on Cronartium ribicola J． C． Fischer by screening of culture medium for toxin production，aeciospore induction and orthogonal experiment． Results indicated that five kinds of culture media were suitable for toxin production and hyphal growth of SS003 ； however，the Richard liquid culture medium was most suitable for toxin production， and PD liquid culture medium was most suitable for hyphal growth． The aeciospores of C． ribicola had certain inhibitory effect on toxin production． The optimal nutritional combination for toxin production was obtained as sucrose 50． 0 g / L， KNO3 10． 0 g / L，KH2 PO4 5． 0 g / L，MgSO4 3． 0 g / L and FeCl3 0． 02 g / L． Reduction of each nutritive element in the culture solution was not favorable to toxin production． Keywords Cronartium ribicola； Trichoderma atroviride； Orthogonal experiment； Aeciospores； Toxin 五针松疱锈病是世界林木三大病害之一 ， 为国内外检疫 对象， 其病原为茶藨生柱锈菌 （ Cronartium ribicola J． C． Fischer） 。在我国主要危害红松（ Pinus koraiensis） 及华山松（ P． armandii） ［1］ 。据调查， 茶藨生柱锈菌目前已使云南上万公顷华 ［2 － 3 ］ ， 山松林发病 对长江防护林体系的建设和西部生态环境 的恢复造成了严重威胁 。茶藨生柱锈菌为长循环型转主寄生 锈菌， 具多型现象。在其生活史的 5 个阶段中， 锈孢子传播可 侵染转主寄主冰川茶藨子 （ Ribes glaciale wall． ） 、 滇中茶藨子 （ Ribes soulieanum Janczewski） 等［4］ ， 因此防治非常困难。长期 以来， 五针松疱锈病的防治主要以化学防治为主 ， 配以修枝、 铲除转寄主植物等营林技术措施 。这些方法虽然在一些重病 区取得一定防治效果， 但至今仍未能遏止住该病害的蔓延且 化学防治方法的长期应用还会带来严重的环境问题 。重寄生 木霉 SS003 菌株（ Trichoderma atroviride） 可导致茶藨生柱锈菌 ［5 － 6 ］ 。本 锈孢子迅速死亡， 而毒素是其致死的主要因素之一 研究针对该木霉产毒条件的优化进行研究 ， 以明确其毒素产 为毒素的基本性质研究及活性成 生所需要的最佳营养条件 ， 分的分离纯化和应用研究奠定基础 。 病的发病林分， 采集锈孢子器突破病部表皮且包被未完全破 裂时的锈孢子， 采集后的锈孢子于 4 ℃ 下低温干燥保存， 备 ［8 ］ Czapek 培养液［9］87 、 Richard 培养 用。对改良 Fries 培养液 、 ［9 ］77 、 PD 培养液、 PSK 培养液［10］5 种液体培养基进行筛选 。 液 1． 2 试验方法 然后 培养方法： 将供试菌株接于 PDA 培养基上扩繁 5 d， 用 Φ = 0． 6 cm 的打孔器在培养好的 SS003 平皿上打孔， 将打 好的菌块接种在装有 100 mL 培养液的 250 mL 三角瓶中， 每 L ∶ D = 12 ∶ 在 120 r / min 下振荡培养 （ 25 ℃ ， 瓶接种 3 块， 12 ） ， 培养液保持自然 pH 值。每处理重复 3 次。 毒素原液的制备： 将培养 8 d 的供试菌株培养物， 先用 8 4 000 r / min 离心 20 层纱布滤去菌丝体， 所得的滤液经 8 ℃ ， min， 上清夜即为毒素原液。 所有操作均在无菌条件下进行 。 滤液置于 4 ℃ 下保存， 备用。 生测方法： 生测采用凹玻片法， 即在灭过菌的凹玻片内注 入 100 μL 毒素原液后， 取少量锈孢子浸于其中 ， 适当搅拌使 盖上盖玻片后置于放有浸湿滤 锈孢子与培养滤液充分接触 ， 纸的培养皿内， 室温下 3 h 后观察锈孢子的变化情况 。 按照 ［7 ］ 杨艳红 的方法判断锈孢子的活力 。 生长量的测定： 把用 8 层纱布过滤好的菌丝放在已知质 量的定量滤纸上， 将滤纸连同菌丝体置于烘箱内 50 ℃ 烘至恒 质量。以菌丝干质量作为生长量的指标 。 产毒培养基的筛选： 将菌块分别接入 5 种培养液中， 连续 振荡培养 8 d 后制备毒素原液并进行生物测定和生物量测 定， 以未接入菌块的培养液为对照 。每处理重复 3 次。 产毒条件的优化： 以产毒培养基筛选所获最佳产毒培养 基（ Richard 培养液） 中的 4 个主要营养因子进行 4 因子 3 水 并以各组合的毒素原液进行生物测定 ， 同 平正交试验（ 表 1 ） ， 时测定生物量。每处理重复 3 次。 半培养基对 SS003 产毒的影响： 以正交试验筛选所获结 果对 Richard 培养液的各个营养因子的量进行减半 （ 1 /2 Rich-
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Vol． 39 No． 5 May 2011
茶藨生柱锈重寄生木霉产毒条件的优化
李永艳 陈玉惠 敖新宇
（ 西南林业大学， 650224 ） 昆明，
表4 方差来源 A（ 蔗糖） B（ KNO3 ） C（ KH2 PO4 ） D（ MgSO4 ） 重寄生木霉 SS003 产毒条件正交试验方差分析结果 锈孢子死亡率 偏差平方和 自由度 443． 326 2 573． 509 439． 803 3． 388 2 2 2 F值 菌丝干质量 偏差平方和 1． 215 0． 122 × 10 － 4 1． 571 0． 010 × 10 － 4 1． 205 0． 014 × 10 － 4 0． 009 0． 003 × 10 － 4 F值 自由度 2 3． 288 * 2 0． 259 2 2 0． 385 0． 069
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材料与方法
供试材料 分离自茶藨生柱锈 供试菌株为重寄生木霉 SS003 菌株， ［7 ］ 菌锈孢子堆 ， 由西南林业大学提供。供试锈孢子于 2010 年 3 月中旬采自云南省昆明市东川区二二二林场的华山松疱锈
1 ） 西南林业大学重点基金项目 （ 110706 ） ； 云南省森林灾害预警 与控制重点实验室资助项目 （ ZK09A105 ） 。 1984 年 12 月生， 第一作者简介： 李永艳， 女， 西南林业大学保护 生物学学院， 硕士研究生。 通信 作 者： 陈 玉 惠， 西 南 林 业 大 学 基 础 部， 教 授。 E － mail： cyh196107@ 126． com。 收稿日期： 2010 年 10 月 22 日。 责任编辑： 程 红。
产毒培养基的筛选 SS003 在供试的 5 种培养基中均能生长和产毒 ， 但产毒 能力及生长量存在较大差异 （ 表 2 ） 。 相同培养时间内 （ 8 d） ， SS003 在 Richard 培养液中产毒最强， 其锈孢子死亡率（ 88． 75% ） 较对照（ 15． 00% ） 高 73． 75% ； Czapek 培养液中次之， 其锈孢 子死亡率（ 80． 00% ） 较对照 （ 20． 00% ） 高 60． 00% ； PSK 培养液 中最差， 锈孢子死亡率（ 35． 00% ） 仅比对照（ 5． 67% ） 高 29． 33% 。 5 种培养液中， PD 培养液最利于 SS003 菌丝生长， 8 d 后的菌 Richard 培养液次之 丝干质量每 100 mL 培养物达 0． 953 5 g， （ 菌丝干质量每 100 mL 培养物 0． 413 8 g） ， 而其余 3 种培养液 菌丝干质量每 100 mL 培养物均 均不利于 SS003 菌丝的生长， 5 种培养基中， Richard 和 PD 较适合 SS003 不足 0． 1 g。因此， Richard 培养基更适合产毒培 菌株的产毒和菌丝生长 。其中， 养， 而 PD 培养基则更适合菌丝生长 。
锈孢子对 SS003 产毒的影响： 在装有 100 mL 产毒最佳的 Richard 培养液的三角瓶里加入锈孢子 （ 5 g / L ） ， 连续振荡培 养 8 d 后制备毒素原液并进行生物测定和生物量测定 。 以未 加入锈孢子的毒素原液为对照 。每处理重复 3 次。
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结果与分析
注： * 表示 F 检验， 具有显著性差异。F0． 1 = 3． 110。F0． 05 = 4． 460。
Hale Waihona Puke 4 个因子影响 SS003 产毒的主次顺序为： B、 C、 A、 D， 最优组合 为 B2 C2 A3 D3 。由于该组合不在正交试验安排之列 ， 需对其验 证。验证结果表明， 该培养基组合的毒素原液对锈孢子的致 死率（ 75． 00% ） 高于正交表中任何培养基组合的毒素原液对 锈孢子的致死率。而 4 个营养因子对 SS003 生物量的影响由 C、 B、 D， 大到小为： A、 最优组合为 A3 C3 B1 D2 。
第5 期
李永艳等： 茶藨生柱锈重寄生木霉产毒条件的优化
103
ard） 和再减半试验（ 1 /4 Richard） 。以 Richard 培养液的毒素原 液为对照进行生物测定和生物量测定。每处理重复 3 次。
表1 水平 1 2 3 A（ 蔗糖） 20 30 50 正交试验因子水平 因 B（ KNO3 ） 5 10 15 子 C（ KH2 PO4 ） 2． 5 5． 0 7． 5 g·L － 1 D（ MgSO4 ） 2． 0 2． 5 3． 0
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摘 要 运用产毒培养基筛选、 锈孢子诱导和正交试验对茶 藨生柱锈重寄生木霉 SS003 菌株 （ Trichoderma atroviride） 的产毒营养条件进行优化 。结果表明， SS003 在 5 种产毒培养基中均能产毒和生长 ， 但 Richard 培养基更 PD 培养基则更适合菌丝生长 ； 茶 藨 生柱锈的锈孢子对产毒具有一定抑制作用 ； SS003 菌株的最佳 适合产毒培养， KNO3 10． 00 g / L、 KH2 PO4 5． 00 g / L、 MgSO4 3． 00 g / L 和 FeCl3 0． 02 g / L， 培养液中 产毒营养组合为： 蔗糖 50． 00 g / L、 各个营养元素的减量不利于毒素的产生 。 关键词 茶藨生柱锈菌； 重寄生木霉； 正交试验； 锈孢子； 毒素 分类号 Q939． 95 Optimal Conditions for Toxin Production of Mycoparasite Trichoderma atroviride on Cronartium ribicola / Li Yongyan，Chen Yuhui，Ao Xinyu（ School of Conservation Biology，Southwest Forestry University，Kunming 650224 ，P． R． China） / / Journal of Northeast Forestry University． － 2011 ， 39 （ 5 ） ． － 102 ～ 104 An experiment was conducted to optimize the nutritional conditions for toxin production of mycoparasite SS003 strain （ Trichoderma atroviride） on Cronartium ribicola J． C． Fischer by screening of culture medium for toxin production，aeciospore induction and orthogonal experiment． Results indicated that five kinds of culture media were suitable for toxin production and hyphal growth of SS003 ； however，the Richard liquid culture medium was most suitable for toxin production， and PD liquid culture medium was most suitable for hyphal growth． The aeciospores of C． ribicola had certain inhibitory effect on toxin production． The optimal nutritional combination for toxin production was obtained as sucrose 50． 0 g / L， KNO3 10． 0 g / L，KH2 PO4 5． 0 g / L，MgSO4 3． 0 g / L and FeCl3 0． 02 g / L． Reduction of each nutritive element in the culture solution was not favorable to toxin production． Keywords Cronartium ribicola； Trichoderma atroviride； Orthogonal experiment； Aeciospores； Toxin 五针松疱锈病是世界林木三大病害之一 ， 为国内外检疫 对象， 其病原为茶藨生柱锈菌 （ Cronartium ribicola J． C． Fischer） 。在我国主要危害红松（ Pinus koraiensis） 及华山松（ P． armandii） ［1］ 。据调查， 茶藨生柱锈菌目前已使云南上万公顷华 ［2 － 3 ］ ， 山松林发病 对长江防护林体系的建设和西部生态环境 的恢复造成了严重威胁 。茶藨生柱锈菌为长循环型转主寄生 锈菌， 具多型现象。在其生活史的 5 个阶段中， 锈孢子传播可 侵染转主寄主冰川茶藨子 （ Ribes glaciale wall． ） 、 滇中茶藨子 （ Ribes soulieanum Janczewski） 等［4］ ， 因此防治非常困难。长期 以来， 五针松疱锈病的防治主要以化学防治为主 ， 配以修枝、 铲除转寄主植物等营林技术措施 。这些方法虽然在一些重病 区取得一定防治效果， 但至今仍未能遏止住该病害的蔓延且 化学防治方法的长期应用还会带来严重的环境问题 。重寄生 木霉 SS003 菌株（ Trichoderma atroviride） 可导致茶藨生柱锈菌 ［5 － 6 ］ 。本 锈孢子迅速死亡， 而毒素是其致死的主要因素之一 研究针对该木霉产毒条件的优化进行研究 ， 以明确其毒素产 为毒素的基本性质研究及活性成 生所需要的最佳营养条件 ， 分的分离纯化和应用研究奠定基础 。 病的发病林分， 采集锈孢子器突破病部表皮且包被未完全破 裂时的锈孢子， 采集后的锈孢子于 4 ℃ 下低温干燥保存， 备 ［8 ］ Czapek 培养液［9］87 、 Richard 培养 用。对改良 Fries 培养液 、 ［9 ］77 、 PD 培养液、 PSK 培养液［10］5 种液体培养基进行筛选 。 液 1． 2 试验方法 然后 培养方法： 将供试菌株接于 PDA 培养基上扩繁 5 d， 用 Φ = 0． 6 cm 的打孔器在培养好的 SS003 平皿上打孔， 将打 好的菌块接种在装有 100 mL 培养液的 250 mL 三角瓶中， 每 L ∶ D = 12 ∶ 在 120 r / min 下振荡培养 （ 25 ℃ ， 瓶接种 3 块， 12 ） ， 培养液保持自然 pH 值。每处理重复 3 次。 毒素原液的制备： 将培养 8 d 的供试菌株培养物， 先用 8 4 000 r / min 离心 20 层纱布滤去菌丝体， 所得的滤液经 8 ℃ ， min， 上清夜即为毒素原液。 所有操作均在无菌条件下进行 。 滤液置于 4 ℃ 下保存， 备用。 生测方法： 生测采用凹玻片法， 即在灭过菌的凹玻片内注 入 100 μL 毒素原液后， 取少量锈孢子浸于其中 ， 适当搅拌使 盖上盖玻片后置于放有浸湿滤 锈孢子与培养滤液充分接触 ， 纸的培养皿内， 室温下 3 h 后观察锈孢子的变化情况 。 按照 ［7 ］ 杨艳红 的方法判断锈孢子的活力 。 生长量的测定： 把用 8 层纱布过滤好的菌丝放在已知质 量的定量滤纸上， 将滤纸连同菌丝体置于烘箱内 50 ℃ 烘至恒 质量。以菌丝干质量作为生长量的指标 。 产毒培养基的筛选： 将菌块分别接入 5 种培养液中， 连续 振荡培养 8 d 后制备毒素原液并进行生物测定和生物量测 定， 以未接入菌块的培养液为对照 。每处理重复 3 次。 产毒条件的优化： 以产毒培养基筛选所获最佳产毒培养 基（ Richard 培养液） 中的 4 个主要营养因子进行 4 因子 3 水 并以各组合的毒素原液进行生物测定 ， 同 平正交试验（ 表 1 ） ， 时测定生物量。每处理重复 3 次。 半培养基对 SS003 产毒的影响： 以正交试验筛选所获结 果对 Richard 培养液的各个营养因子的量进行减半 （ 1 /2 Rich-