Car—T细胞培养标准操作流程1 目的：保证Car—T细胞制备和培养符合要求。
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养3 责任人：实验员人、临床相关人员。
4 内容4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管,75cm2培养瓶,150 cm2培养瓶，EP管，1。
8ml冻存管4。
2试剂：X-VIVO 15TM,PBS缓冲液，75％医用酒精，人淋巴细胞分离液,CD3/CD28免疫磁珠，IL-2,注射用人血白蛋白。
4.3环境：4.3.1外周血分离,培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒,紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min,生物安全柜运行稳定后方可操作。
4。
4操作：4.4。
1采集接收外周血4.4。
1。
1患者符合治疗方案,各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
4.4.1。
2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》,核对外周血患者相关信息，及相应检测报告,报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti—TP，ALT.4。
4.2操作前准备4。
4.2。
1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min,生物安全柜运行稳定。
4。
4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基,恢复室温。
4。
4.2。
3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：4。
4。
3。
1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器,把血袋内外周血转入50ml离心管中。
4.4.3.2用PBS缓冲液按1：1稀释外周血,混匀。
4。
4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。
方法如下:用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0。
5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上,然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面.4.4。
