分子标记筛选实验
DNA提取的实验仪器与耗材准备：水浴锅，高速冷冻离心机，小型离心机，预冷的异丙醇，1.5ml的灭菌eppondorf管，50 ml的灭菌离心管，70%的酒精，5M的KAc混合液，研钵，液氮，SDS抽取液，1M Tri-HCl (pH 8.0)，0.5M EDTA (pH 8.0)，TE (pH 8.0)( 相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996）
1.DNA小量提取法（SDS小量提取法）
F2群体DNA采用SDS小量提取法，步骤如下：
1. 取新鲜水稻样本叶片2cm左右于1.5 eppondorf管中，加入液氮，用电钻磨碎。
2. 每管磨碎的水稻叶片中加入700ul已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水浴30min。
3. 加入200ul 预冷的5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴30min后，于40C 10000转离心4min，吸取上层液到另一准备好的1.5ml eppondorf管中。
4. 加入等体积预冷的异丙醇，置于-200C 30min后，40C 10000转离心4min。
5. 弃上清，加入70% 乙醇清洗，上下颠倒混匀，小型离心机快速离心弃上清，倒扣晾干（注：晾干不宜太久，反止DNA难溶）。
6. 将晾干的DNA溶于100ul TE溶液中， 40C保存备用。
2．DNA大量提取法（SDS大量提取法）
亲本DNA和突变体DNA池、正常株DNA池采取SDS大量提取法，步骤如下：
1.取每个水稻新鲜样本叶片1g，放入10ml离心管，加入液氮，用电钻磨碎。
2.加入5ml已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水浴20min。
3.水浴20min后加入1 ml 5MKAc混合液，上下颠倒充分混匀，冰浴20min，
冰浴期间要将离心管上下颠倒数次。
4.加入等体积的氯仿，室温下以3000（10000 rmp）的速度离心 3min，吸取
上清于另一准备好的50 ml离心管中。
5.加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃，可以看见DNA絮状沉淀。
6.用玻棒挑出DNA絮状物，用75%乙醇清洗两次，将乙醇到掉，晾干。
7.将晾干的DNA溶于500ul TE溶液中， 40C保存备用。
3．PCR扩增体系与反应条件
3.1 PCR 反应体系
终浓度
Primer pair (4uM) 2ul 0.4 uM
10×buffer 2ul 1×buffer
Mg2+(25mM) 2ul 2.5uM
dNTPs(10mM) 0.3ul 133ul
Taq酶（4u/ul） 0.25ul 1U/20ul
DNA(20ng/ul) 2ul 1.5ng/ul
Sterile water 11.45ul
总体积 20ul
3.2 PCR 反应程序
94℃,4mi n
94℃,45s
55℃（因具体引物而定）, 45s (32个循环)
72，45s
72℃,10min→ 4℃,保存
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验仪器与试剂：小型电泳槽及配套大小玻璃板，夹条、梳子、黑色的长夹子（full-length clamps）、灌胶底座（precition caster base）、注射器及导管等部件。l6%丙烯酰胺，TEMED，10%过硫酸铵溶液，loading buffer(上样缓冲液)，10×TBE buffer(相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996）)
4.1 制胶（6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶）
1.将玻璃板洗净水平放置晾干后，再用含有酒精的纸巾将玻璃表面擦拭干净，晾干。
2.小玻板水平放置，将两个夹条整齐地放于玻板两边，大玻板对应放上；然后夹上胶条，最好玻璃的边缘用琼脂糖胶封边，防止灌胶的时候漏胶，等琼脂糖胶干后，随后直接装上电泳仪上，将整个装置水平放置（用水平仪没定）。
3.准备凝胶，按以下比例进行配置：每块板取6ml 6%丙烯酰胺和24 ml 1×TBE，加入20ulTEMED和200ul 10%过硫酸铵溶液（最好现配现用），在干净的小烧杯
混匀。
5. 灌胶：用玻璃棒引流灌入胶液，当胶面前沿到达顶端即可停止灌胶。
6. 插梳子：将梳子的平端插入胶室约0.5cm即可。（注意观察是否有漏胶，要及时补胶）
7. 凝胶约1小时：若需过夜，用保鲜膜封住玻板的上端，或直接往电泳槽中加1×TBE缓冲液准备跑电泳。
4.2 电泳
1.往电泳槽灌入约500ml 的1×TBE，使缓冲液淹没小板玻璃，随后小心拔掉梳子，用注射器轻轻冲冼各加样孔。期间注意旋紧电泳槽螺丝，防止漏液。
2.接通电极，开始预电泳，一般为恒压200V, 10分钟。
3. 其间准备样品：5ulPCR产物+ 5ul上样缓冲液（loading buffer）。
4. 预电泳结束后，关闭电源，开始点样。点样之前再次冲冼加样孔，每个加样孔可加5ul的样品。
5. 电泳时，一般用200V。如发现散热太大，需用电风扇吹风散热。
6. 停止电泳：一般情况下，当溴酚蓝即将跑出胶的底部时，即可关闭电源开关，停止电泳。
7. 卸胶板时，首先将槽中的缓冲液通过放水孔（drain port）。小心卸下玻璃板。记住样本的起始点样孔。
8. 取出胶板后，先卸去橡胶长夹条，再轻轻地撬开大、小玻板，将凝胶进行后续的固定—银染—显色。
4.3 银染
固定液，0.1M 硫代梳酸钠，显影液的配制（使用前5小时配制），染色液的配制（使用前10分钟配制）(相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996) 1.固定：用刀子轻轻地撬开玻璃板，将凝胶放入盛有100ml新配制的冰醋酸溶液（每100ml 10%的乙醇加500μl冰醋酸为一块板用量）的固定盒中，在摇床上轻摇5分钟。（固定液可保留）
2.银染：放入20%硝酸银溶液银染液（1ml 20%的硝酸银/100ml固定液）轻摇5-8分钟。
3. 水洗：将固定盒中液体小心倒掉，用蒸馏水冲洗三次。
4. 显影：加入显影液（每100ml 3%的NaOH加500μl甲醛），在水平摇床上显色10分钟左右。
5. 停影：当条带显示出来时，迅速将显影液倒掉，清水冲洗，银染结束。
分子标记辅助选择育种 传统的育种主要依赖于植株的表现型选择 (Phenotypieal selection)。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。 育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选
择(molecular marker-as—sisted selection，MAS)育种更受到人们的重视。 第一节分子标记的类型和作用原理 一、分子标记的类型和特点 按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性(annealling)、延伸(exten—sion)三步(图17—1)。变性指的是通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程；复性(又称退火)是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互补的模板在局部形成杂交链；延伸是指在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始点的5'-3'的DNA链延伸。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经25～30个循环后，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2×106-7拷贝。按照PCR所需引
常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。
分子克隆技术 一、填空题 1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。 2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前，要对载体进行去磷酸化处理，我 们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它 的目的是___________________________。 3.用α互补筛选转化子是，带有外源片段的菌落显___________________________色。 4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。 5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和 ___________________________。 6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、 ___________________________、___________________________、 ___________________________、___________________________。 二、简答题 1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。 2.为得到质量较好的水稻RNA，抽提前应做如何准备？RNA抽提过程中、RNA的 保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么？ 3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害，在操作放射性同位素 时，我们可以采取哪些措施进行防护？ 4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些？ 5.质粒抽提时用到的SolutionI，SolutionII，SolutionIII及异丙醇分别起什么作用？操 作时应注意什么？ 三、分析问答题 1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA 和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。 2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤？涉及到哪些工具酶？要获得 理想的结果，各步骤操作中应主要注意哪些事项？ 3.在Southern杂交实验中，同一根杂交管内的膜曝光的····（原卷此处不清晰）冲 洗后，有些组X光片信号很强，有些组信号很弱，有的样品点样孔附近有较强的 信号，但是有的地方信号较弱，请分析造成这种结果的可能原因。 4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR（反转录前没有对总RNA进 行去除DNA 的处理）试验的琼脂糖凝胶电泳图，凝胶上共点了6个样，PCR使用 的模板从左至右分别是：该组提取的水稻总DNA，该组提取的水稻总RNA，该组 的4个反转录产物。（原卷本题图不清晰） 请问： 提取的RNA的质量如何？ RT-PCR是否成功？为什么会出现这样的结果？ 有哪些地方需要改进？
分子标记辅助选择（MAS）与QTL定位在鸡遗传育种中的应用 摘要：近年来，随着畜禽基因组研究计划相继开展，分子标记的研究与应用得到 了迅速的发展，这为准确地评价畜禽群体遗传结构及遗传多样性提供了新的机遇。分子标记辅助选择（MAS）也越来越受到育种学家的广泛关注，并且目前已用于生产实践，对提高经济效益和育种效率起到了大的推动作用。而对鸡的染色体上QTL定位工作也有了迅猛的发展，成为动物基因定位工作中一个异常活跃的领域。对鸡数量性状的研究也已发展为直接将研究目标指向各个数量性状位点，借助各种遗传标记，构建遗传连锁图谱，通过一定的统计分析方法，从而将影响数量性状的多个基因定位于特定的染色体区域。分子标记辅助选择（MAS）与QTL定位之间具有紧密联系。本文主要综述分子标记辅助选择（MAS）与QTL定位在鸡遗传育种中的研究进展。 关键词：鸡；分子标记辅助选择（MAS）；QTL定位 1.引言 鸡的许多经济性状属数量性状，该类性状的发生受到2对或更多对等位基因的控制，每对等位基因没有显性与隐性的区别，而是共显性的。这些等位基因对该数量遗传性状形成的作用微小，所以也称为微效基因(minor gene)，它们在染色体上的位置称为数量性状基因座(quantitative trait loci，QTL)。目前随着QTL 研究的深入，不仅丰富和发展了数量遗传学的内容，成为新兴的分子数量遗传学的主体，也必将对畜禽的育种改良起到极大的推动作用，从而开创动物育种的新纪元。 2.分子标记辅助选择（MAS） 2.1 相关概念 Stam（1986）提出通过限制性片段长度多态性（RFLP），可对生物有机体的基因组进行标记，利用标记基因型能非常准确地估计数量性状的育种值，以该育种值为基础的选择，称为标记辅助选择（marker assisted selection,MAS）。Lander 和Thompson（1990）定义标记辅助选择，为把分子遗传学方法和人工选择相结合达到性状（traits）最大的遗传改进，人们进一步将MAS定义为以分子遗传学和遗传工程为手段，在连锁分析的基础上，运用现代育种原理和方法，实现性状最大的遗传改进。 2.2 常用分子遗传标记及应用 目前常用于家禽遗传育种的分子遗传标记主要有：(1)限制性片段长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP);(2)DNA指纹(DNA fingerprint，DFP);(3)随机扩增多态DNA(Randomly Amplified polymorphisms DNA，RAPD);(4)微卫星DNA(Microsatellite DNA);(5)单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP);另外随着仪器的改善和技术的不断提高，现在也发展了很多新型、高效的检测突变的方法。下面主要介绍目前家禽遗传育种中常用的分子遗传标记。
分子克隆实验标准步骤 一、 常规分子克隆实验流程： 二、 分子克隆实验标准步骤（含实验编号）： 1. PCR 扩增目的基因（编号Clone SOP-1） 以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例 体系（50ul ）： 10×KOD buf 5ul dNTP(2mM) 5ul Mg 2+ 3ul Primer1 1ul Primer2 1ul Template50-200ng KOD0.5ul ddH 2O up to 50ul 程序： 95℃2min 98℃10s 58℃30s 35cycle 68℃2kb/min 68℃7min 12℃∞
2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2） 琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。 胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。 ③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀 的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。 3.试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3） 以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 ①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL， 12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） ②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中， 称取重量。 ③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN 溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。 注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA 的能力较强。 ④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑥重复操作步骤⑤。 ⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附 柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 ⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或 ddH2O，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。 4.酶切反应（编号Clone SOP-4） 以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例 双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）： 10×FastDigest? buffer or 10×FastDigest? Green buffer 5ul FastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ul FastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ul DNAN ddH2Oupto50ul 酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。 5.酶切产物的回收（编号Clone SOP-5） 以本实验室常用Axygen?AxyPrep?PCRClean-UpKit（Axygen）为例 ①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A
第六章分子标记辅助选择 选择是育种中最重要的环节之一。所谓选择，是指在一个群体中选择符合要求的基因型。但在传统育种中，选择的依据通常是表现型而非基因型，这是因为人们无法直接知道个体的基因型，只能从表现型加以推断。也就是说，传统育种是通过表现型间接对基因型进行选择的。这种选择方法对质量性状而言一般是有效的，但对数量性状来说，则效率不高，因为数量性状的表现型与基因型之间缺乏明确的对应关系。即使是质量性状，有的也可能会因为表型测量难度较大或误差较大而造成表型选择的困难。另外，在个体发育过程中，每一性状都有其特定的表现时期。许多重要的性状（如产量和品质）都必须到发育后期或成熟时才得以表现，因而选择也只能等到那时才能进行。这对于那些植株高大、占地多、生长季长的作物，特别是果树之类的园艺作物，显然是非常不利的。总之，传统的基于表型的选择方法存在许多缺点，效率较低。要提高选择的效率，最理想的方法应是能够直接对基因型进行选择。 分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可能，因为分子标记的基因型是可以识别的。如果目标基因与某个分子标记紧密连锁，那么通过对分子标记基因型的检测，就能获知目标基因的基因型。因此，我们能够借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，这称为标记辅助选择（MAS）。这是分子标记在育种中应用的最主要方面。 第一节质量性状的标记辅助选择 如前所述，传统的表型选择方法对质量性状一般是有效的， 86
因为质量性状的表现型与基因型之间通常存在清晰可辨的对应关系。因此，在多数情况下，对质量性状的选择无须借助于分子标记。但对于以下三种情况，采用标记辅助选择可提高选择效率：（1）当表现型的测量在技术上难度很大或费用太高时；（2）当表现型只能在个体发育后期才能测量，但为了加快育种进程或减少后期工作量，希望在个体发育早期（甚至是对种子）就进行选择时；（3）除目标基因外，还需要对基因组的其它部分（即遗传背景）进行选择时。另外，有些质量性状不仅受主基因控制，而且还受到一些微效基因的修饰作用，易受环境的影响，表现出类似数量性状的连续变异。许多常见的植物抗病性都表现为这种遗传模式。这类性状的遗传表现介于典型的质量性状和典型的数量性状之间，所以有时又称之为质量-数量性状。不过，育种上感兴趣的主要还是其中的主基因，因此习惯上仍把它们作为质量性状来对待。这类性状的表型往往不能很好地反映其基因型，所以按传统育种方法，依据表型对其主基因进行选择，有时相当困难，效率很低。因此，标记辅助选择对这类性状就特别有用。一个典型的例子是大豆孢囊线虫病抗性的标记辅助育种（Y oung 1999）。 本节首先介绍质量性状标记辅助选择的基本方法（前景选择和背景选择），然后介绍它们在育种上的应用（基因聚合和基因转移）。 一、前景选择 对目标基因的选择称为前景选择（foreground selection; Hospital and Charcosset 1997），这是标记辅助选择的主要方面。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才能够达到较高的正确率。假设某标记座位（M/m）与目标基因座位（Q/q）连锁，重组率为r，F1代基因型为MQ/mq，其中Q为目标等位基因，亦即要选择的对象。由于M 87
实验室常用生化试剂配方 1.常用抗生素配制以及使用说明（参考链霉菌室操作手册2019版） 抗生素 英文名称及缩写 抗性基因 贮藏液浓度(mg/ml) 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 35 25(0.15M NaOH配) 50(DMSO配) 50 50 MM 使用终浓度（μg/ml）链霉菌 2CM YEME 大肠杆菌 LA或LB 氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素紫霉素萘锭酮酸 TMP Ampicillin, Amp bla Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am Viomycin,Vio Nalidixic acid Trimethoprim cat hyg aac/aph aadA str tsr ermE aac(3)IV vph －* 10 10 2 5 10 5 100 10 －－ 25 25 20 25 10 － 50 －－－－－－ 2.5 － 5 50-100 25 － 25 50 25 25 20 10-30
注意事项： (1) –表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制，配制过程请 确保抗生素粉末充分溶解混匀后再分装； （2）Km 和Am有交叉抗性，同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并 设置阴性对照； （3）Hyg、Vio易见光分解，配制好后应用锡箔纸包好,使用过程中建议避光操作。有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio （4）用无菌水配制的抗生素需在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌并 分装；氯霉素、TMP、硫链丝菌素可以在超净工作台外配制分装，无需过滤除菌，但需确 保配制贮存液所用溶剂（无水乙醇、DMSO）未遭受污染，建议配制氯霉素时使用新的无水 乙醇，不要使用抽提质粒或总DNA时用的无水乙醇，以防止污染；DMSO，即二甲亚砜，易 挥发，有剧毒； （5）长期不用的抗生素请置于-20℃保存，抗生素粉末按照使用说明一般置于4℃保存，经常使用时可以暂置于4℃保存； （6）抗生素的实际使用浓度请结合实验经验进行适当调整； (7)配制抗生素时应尽量一次性称取抗生素粉末，配制过程中建议穿工作服，戴一次 性橡胶手套及口罩，及时清理称量配制抗生素时使用的台面及器具，以避免抗生素及溶剂 对自身的损伤及对工作环境的污染。 注意事项： (1)表中所列酶均可以用无菌水配制，也可以用相应的缓冲液配制，缓冲液配制方法 参考《分子克隆实验指南（第3版）》： 蛋白酶 K缓冲液：50 mM Tris（pH 8.0），1.5 mM 乙酸钙； RNase A缓冲液：TE （pH 7.6）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA；溶菌酶缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 8.0）； (2) RNase A配制好后沸水浴处理5 min，取出贮存RNase A后首次使用时也需沸水 浴处理5 min后再使用； （3）制备原生质体时使用的溶菌酶配制时需过滤除菌，其他情况一般无需过滤除菌； （4）所有酶均应在-20℃保存，使用过程中避免反复冻融，配制过程中尽量避免外界 污染。 （1）IPTG用无菌水配制，0.22μm一次性滤膜过滤除菌，分装保存于-20℃；
实验1 《科达组装电脑管理信息系统》 一、上机实验目的 1. 了解使用数据库开发一个小型信息系统的过程。 2. 掌握使用Access 数据库保存数据、按用户要求对数据进行处理，通过友好界面输出信息报告的方法。 3. 掌握Access 数据库查询、统计、输出等功能。 4.通过实验理解数据库知识、软件开发工具知识和管理信息系统知识，了解如何将它们融会贯通起来为解决实际应用问题服务。 二、上机实验基本要求 1. 在规定上机时间内完成信息系统的开发任务，由指导老师检查通过。 2. 按时提交上机实验报告。 3. 指出系统的创新之处（学生要说明系统的创新点及意义）。 三、开发系统资料 （一）公司基本情况 科达电脑公司现在是一个销售电脑外部设备和组装电脑的小公司，成长很快。该公司成立于1997 年，由于销售量增长很快，公司考虑扩展其业务。 公司目前推出5 种型号的计算机：入门级PC、家用PC、小企业PC、高能PC 和超强PC。公司采用标准配件组装这些计算机，其中一些配件如键盘、鼠标、主板及电源对所有型号的计算机都是一样的。另外一些配件象CPU，不同型号的计算机有不同的配置，入门级和家用PC 使用的是Celeron 系列产品，而其它型号则使用不同速度的Pentium 系列产品。还有一些配件包括硬盘、显示器和声卡对不同型号的计算机有不同的配置。在某些计算机中可能有一个特别的配件，另外一些则可能有多个特别的配件。例如，一些计算机中配置多条内存，另一些则配置多个硬盘。 （二）各种型号计算机的配置说明 科达公司的仓库里存放着装配公司五种计算机的全部配件，一共有36 个品种，每组装一台计算机，会使用15～20 种配件。 下列表格给出了每种计算机使用配件的详细情况。（注意，这些表格含有大量的重复和冗余，这种格式是不宜用作数据库表的）。
分子克隆技术实验讲义 黑龙江大学生命科学学院 2016年3月 甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定 一、实验目的 1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。 2、学习和掌握质粒、T载体的特点。 3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。 4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。 5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。 7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。 8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。 二、相关知识
（一）T载体的制备 pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点，用EcoRⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。 （二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆） 把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒， 这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍 末端（compatible end），以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。 相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。 （三）大肠杆菌感受态细胞的制备 外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大 量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌 宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞（competent cell）是经过一定方法处理后，具有 接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。 相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及方法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。 （四）重组DNA的转化及重组子的鉴定 将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两 个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易 操作和进行下一步的分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆 中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA 分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接 上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子，未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降 解掉；对克隆工作带来影响的是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产 生克隆，但是每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子，每个单克隆都是由一个细胞形成的，因此在每个
分子克隆技术 DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆，是在体外对DNA分子按照既定的目的进行人工重组，并导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA 分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。 其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）经过特定限制性酶切割以及与目标载体连接，组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质，并且来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。 分子克隆技术的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。 实验前准备 实验开始前，需准备好所需的试剂，如PCR扩增及酶切，连接所需酶类试剂及相应的buffer，均为TaKaRa产品分装，Buffer、dNTP、引物试剂等需要从-20℃取出至室温融化、涡旋震荡混匀离心后使用，酶类试剂从-20℃取出瞬时离心（小于4000 rpm）放置冰浴中备用。 还有各项实验所需的药品（如琼脂糖），以及配置好培养基，抽提质粒用的溶液一、二、三等试剂。 本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：Thermo Scientific Arktik PCR仪，水平电泳槽，超净工作台，恒温水浴锅，紫外照胶仪，赛默飞公司提供的F1，F2和F3一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml离心管，玻璃试管，赛默飞公司提供的QSP盒装吸头及15ml离心管等。 接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先在GenBank中查询目的基因序列，然后根据得到的序列进行酶切位点分析及引物的设计，通过RT-PCR获取目的基因，酶切以及与载体连接，转化进入宿主菌中，针对得到的菌落进行菌落PCR快速筛选，得到初步的阳性克隆，最后通过质粒提取及鉴定，得到的阳
Euphytica(2005)142:169–196 DOI:10.1007/s10681-005-1681-5C Springer2005 An introduction to markers,quantitative trait loci(QTL)mapping and marker-assisted selection for crop improvement:The basic concepts B.C.Y.Collard1,4,?,M.Z.Z.Jahufer2,J.B.Brouwer3&E.C.K.Pang1 1Department of Biotechnology and Environmental Biology,RMIT University,P.O.Box71,Bundoora,Victoria3083, Australia;2AgResearch Ltd.,Grasslands Research Centre,Tennent Drive,Private Bag11008,Palmerston North, New Zealand;3P.O.Box910,Horsham,Victoria,Australia3402;4Present address:Plant Breeding,Genetics and Biotechnology Division,International Rice Research Institute(IRRI),DAPO Box7777,Metro Manila,Philippines; (?author for correspondence:e-mail:bcycollard@https://www.doczj.com/doc/fd9809240.html,) Received11July2004;accepted2February2005 Key words:bulked-segregant analysis,DNA markers,linkage map,marker-assisted selection,quantitative trait loci (QTLs),QTL analysis,QTL mapping Summary Recognizing the enormous potential of DNA markers in plant breeding,many agricultural research centers and plant breeding institutes have adopted the capacity for marker development and marker-assisted selection(MAS). However,due to rapid developments in marker technology,statistical methodology for identifying quantitative trait loci(QTLs)and the jargon used by molecular biologists,the utility of DNA markers in plant breeding may not be clearly understood by non-molecular biologists.This review provides an introduction to DNA markers and the concept of polymorphism,linkage analysis and map construction,the principles of QTL analysis and how markers may be applied in breeding programs using MAS.This review has been speci?cally written for readers who have only a basic knowledge of molecular biology and/or plant genetics.Its format is therefore ideal for conventional plant breeders,physiologists,pathologists,other plant scientists and students. Abbreviations:AFLP:ampli?ed fragment length polymorphism;BC:backcross;BSA:bulked-segregant analysis; CIM:composite interval mapping;cM:centiMorgan;DH:doubled haploid;EST:expressed sequence tag;SIM:sim-ple interval mapping;LOD:logarithm of odds;LRS:likelihood ratio statistic;MAS:marker-assisted selection;NIL: near isogenic lines;PCR:polymerase chain reaction;QTL:quantitative trait loci;RAPD:random ampli?ed poly-morphic DNA;RI:recombinant inbred;RFLP:restriction fragment length polymorphism;SSR:simple sequence repeats(microsatellites);SCAR:sequence characterized ampli?ed region;SNP:single nucleotide polymorphism; STS:sequence tagged site Introduction Many agriculturally important traits such as yield,qual-ity and some forms of disease resistance are controlled by many genes and are known as quantitative traits(also ‘polygenic,’‘multifactorial’or‘complex’traits).The regions within genomes that contain genes associated with a particular quantitative trait are known as quan-titative trait loci(QTLs).The identi?cation of QTLs based only on conventional phenotypic evaluation is not possible.A major breakthrough in the characteri-zation of quantitative traits that created opportunities to select for QTLs was initiated by the development of DNA(or molecular)markers in the1980s. One of the main uses of DNA markers in agricul-tural research has been in the construction of linkage maps for diverse crop species.Linkage maps have been utilised for identifying chromosomal regions that contain genes controlling simple traits(controlled by a single gene)and quantitative traits using QTL
振动试验的正确选择方法 振动试验是力学环境试验中的一种。振动台就是用于此类试验的专门的力学环境试验设备。振动试验机模拟产品在制造，组装运输及使用过程中所遭遇的各种环境，用以鉴定产品是否忍受环境振动的能力，适用于电子、机电、光电、汽机车、玩具……等各行各业的研究、开发、品管、制造。 一、振动的描述 1、什么叫振动 振动是一种波动。机械振动是物体在平衡点附近反复进行的机械运动。 2、振动的分类 振动可分为随机振动和周期振动。 周期振动包括正谐、多谐、方波、锯齿波。 周期振动都可分解为一系列简谐振动之和。 按是否有外力推动，振动又可分为自由振动和强迫振动。 二、正谐振动的描述 2.1 频率、角频率 频率和角频率都是用来描述单位时间内振动的次数的。 每秒钟振动的次数，高频红外碳硫分析仪称为振动的频率，常用f表示。单位是：次数/每秒，用Hz表示。 假如用机械转子激振器每秒钟的转动弧度数来描述振动，称为振动的角频率，常用ω表示。单位是：弧度/每秒。 频率和角频率之间有如下的关系: ω=2πf 3.2 位移、速度、加速度 位移、速度和加速度都是用来描述振动的幅度的。 位移是指振动时物体离开平衡位置的最大距离，常用A表示。单位是：米（m）。 速度是指振动时物体运动的最大速度，常用v表示。单位是：米/每秒（m/s）。 加速度是指振动时物体运动的最大加速度，常用a表示。单位是：米/每秒平方（m/s2）。有时也用重力加速度g来表示：g=9.8m/s2。 在正弦振动的情况下，且使用国际单位制时，位移、速度、加速度三者之间有如下的关系： v=ωA=2πfA a=ωv=ω2A=（2πf）2A 三、使用振动试验机的优点： 1、设计时，可分析破坏点、易不良点， 2、质量时，可分析每一批产品所产生的不同点和不良点， 3、生产时，可完全一边振动一边测量，使产品不良率早发现， 4、耐久测量，让产品耐久使用、使不耐久的组件提早改进，公司品牌口碑即会更好。 四、振动台的分类、原理、特点 振动台按它们的工作原理可以分为电动台、机械台、液压台三种。 电动台以输出激振力为主要规格。它的频率范围最宽，一般为5-3000Hz。最大位移一般为±12-25mm。最大加速度一般可达100g。配以水平滑台可以作水平振动。配以随机控制仪可以作随机振动。精度指标好。但是它的台面尺寸小,常须另配辅助台面；运行成本及价格比较高。常用于电工、电子元器件等产品的高频、高加速度振动试验。 机械台以最大负载为主要规格。频率范围一般为5-80Hz。最大位移一般为±3-5mm。
0实验4 选择结构程序设计 一、实验目的 1．了解C 语言表示逻辑量的方法，学会正确使用逻辑运算符和逻辑表达式。 2．熟练掌握if 语句和switch 语句。 3．结合程序掌握一些简单的算法。 4．学会程序调试的一般方法。 二、实验内容 1．程序调试示例 （1）改正下列程序中的错误，输入x ，计算并输出下列分段函数f (x )的值（保留一位小数）。 （以10 和0为例）?????=≠==)0( 0)0( 1 )(x x x x f y 源程序（有错误的程序）： #include
双击错误信息，箭头指向第一个“}”所在的行，错误信息指出在“}”前缺少分号。在y=1/x后补上分号。 ②重新编译，出现新的错误提示： 双击错误信息，箭头指向“scanf(%lf”,x)”所在的行，错误原因是“x”前少了“&”，将之补上。重新编译并连接，都正确。 ③选择菜单栏上的“Tools”——“Customize”命令，在“Customize”对话框中单击“Toolbars”选项卡，在其中勾选“Debug”显示调试工具条。 ④单步调试程序。单击调试工具条中按钮（Step Over），每次执行一行语句，编辑窗口的箭头指向某一行，表示程序将要执行该行。 在上图的下半部分列出了变量窗口和观察窗口，在观察窗口中可以改变变量的值。 ⑤再单击3次（若调试工具条未出现，则利用第三步将之调出）， 程序执行到输入语句这一行，同时运行窗口显示： 表示程序将要执行该行。继续单击按钮，在运行窗口中输入10，按回车键，则箭头指向if(x!=0)这一行。此时，在变量窗口可以看到变量10.000000000000。 ⑥继续单击按钮2次，箭头指向“else”这一行，在变量窗口可以看到变量y的值为 0.1000000000000。 ⑦继续单击铵钮2次，运行窗口显示运行结果，符合题目要求。 ⑧单击（Stop Debugging）按钮，程序调试结束。