菌种的复苏传代及保存标准程序
目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。
范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。
职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。
内容：
菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。
1.菌种的复苏
1.1冻干菌种的复苏
检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。
1.1.1准备：
①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。
②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。
③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。
1.1.2操作：
1.1.
2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。
1.1.
2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。
1.1.
2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。
1.1.
2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。
1.1.
2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将
冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。
1.1.
2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。
1.1.
2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。
1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。
1.2.1准备：①冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。
②细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按1：1比例混匀制成。
1.2.2按1.1.2.1~1.1.2.4操作，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。
1.2.3按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-20℃或-80℃条件下冷冻保存。
1.2.4制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按1.2.3冻存。
1.3冻存菌悬液的复苏：
1.3.1准备：
①用具：灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。
②培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基10ml、硫乙醇酸盐流体培养基12ml或改良马丁培养基10ml等）、琼脂斜面或平板培养基。
③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。
1.3.2操作：
1.3.
2.1从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。
1.3.
2.2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台。
1.3.
2.3用75%酒精棉球擦拭菌种冻存管外壁，稍干。
1.3.
2.4点燃酒精灯，在火焰旁打开菌种冻存管盖，用一支灭菌滴管吸取解冻的菌悬液，接种至10ml液体培养基中（生孢梭菌需接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中）。或用接种环取菌悬液划线接种于琼脂斜面或平板培养基上。
1.3.
2.5将用过的滴管和菌种管投入消毒液内浸泡，接种环在火焰上灼烧。
1.3.
2.6将上述接种后的培养基在规定温度下培养（细菌在30~35℃恒温培养18-24小时，真菌在23~28℃恒温培养24-48小时，黑曲霉*培养5~7天）。
1.3.
2.7仔细观察培养物：如呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种，注明菌名、编号、代次和接种日期后，置2~8℃冰箱内保存；如发现菌苔形状不典型，可进行平板分离单菌落。
1.3.
2.8注意：已解冻的冻存管不可再冻存。
2.菌种的接种、传代
2.1.准备
①用具：接种环、酒精灯。
②培养基：营养琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基或适宜的液体培养基。培养基应新鲜制备，如斜面已干缩，无冷凝水，则不宜再使用。
③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液。
④菌种：根据2010年版《中国药典》的要求，传代次数（n）应不超过4代。
2.2将冰箱中取出的菌种斜面，在室温放置30分钟，待温度平衡后再移入接种室内或超净工作台。
2.3点燃酒精灯，将菌种管与接种管持在左手拇指、食指与中指之间，试管口斜向上，
两试管口平齐靠近火焰旁。
2.4用右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种时易拔取，再以右手持接种环在火焰上烧红30秒钟，随后将全部铂金丝及金属棒部分在火焰上灼烧，往返通过3次。
2.5右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔出棉塞，夹在无名指、小指及掌部，并勿使其与任何物品接触。
2.6将灼烧过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，取出时，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入至接种管内液体培养基中，或在琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上，注意只划动一次，勿重复移动，且勿使菌苔沾在管壁口。
2.7取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁将试管棉塞塞上，然后将接种过细菌的接种环在火焰上灼烧灭菌。
2.8已接种毕的各管贴好标签，注明菌名、编号、代次（n+1）和接种日期，细菌管置30~35℃培养18~24小时；真菌管一般置23~28℃培养24~48小时（黑曲霉需培养5~7天）。
2.9培养到期后取出培养物，仔细观察菌苔形态，是否正常，并与上代菌种比较，有无杂菌。必要时涂片，革兰氏染色镜检，呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种。如发现菌苔形状不典型，可继续进行平板划线培养，分离单菌落，挑选典型菌苔接种于营养琼脂斜面上，代替原有的工作用菌种。
2.10检查合格的工作用菌种，放入冰箱内2~8℃保存，一般1个月转种一次。2.11菌种（第n 代）接种至适宜培养基中，在规定的温度条件下的培养物，即为第n+1代。
注意：黑曲霉*致病性很强，操作时应特别注意：
①黑曲霉孢子相当稳定，其在0.9%氯化钠溶液中，4℃左右的条件下可以保存较长的时间，故可将此孢子悬液作为储备液在1~2月内使用，以减少反复操作的风险性。
②为防止黑曲霉孢子的传播，接种传代时应关闭风机，近酒精灯操作。
③若传代的母代菌种为菌悬液，则用无菌吸管吹吸管内液体，取1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7日。
④接种传代时，改良马丁斜面必须是干燥的，否则影响其孢子的形成。
⑤接种传代后，使用过的器具均需在121℃，30分钟高压灭菌后再作处理。
3.菌种的保存：
3.1菌悬液冻存法：
冻干菌种（0代）复苏后，可按上述方法制备第1代菌悬液、第2代菌悬液进行冻存。
3.2琼脂斜面低温保存法：日常使用的工作用菌种可用此法在短期内保存。
3.2.1将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸包好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 1个月移种一次，继续进行保藏。
3.2.2适用范围：细菌、酵母菌、真菌保藏。
3.2.4注意事项：
①保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。
②保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。
③必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。
④每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。
⑤铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，应在室温下保存。
3.3液体石蜡保存法：利用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。
3.3.1方法：
3.3.1.1将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~ 0.5 %琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。
3.3.1.2取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~170℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的水分。
3.3.1.3将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端 1 ㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。
3.3.2适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。
3.3.3注意事项：
①保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。
②保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。
③使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精
灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。
⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1 ㎝为宜。⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。
4.菌种在传代、保存或使用过程中发现污染、变异，应及时销毁，不得用于常规检验。
5.菌种传代、保存及使用、销毁均应填写相应记录：《0代菌种保管使用记录》、《冻存菌种保管使用记录》、《菌种传代记录》、《菌种使用记录》及《菌种销毁记录》。
6.菌种按“检定菌管理制度”管理。
7.附录：
7.1菌种编号：传代复苏的菌种应有统一编号,编号方法为:菌种代号-G或W-代次-管号。
G表示用于冻存的菌种，W表示工作用菌种。
①菌种代号：常用菌种的代号见下表：
②菌种购进的年、月：如0608表示2006年8月购进
③菌种代次，用1、2、3、4、5表示。
④母代冻存菌种的编号，用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ…表示。
⑤菌种的序号，用1、2、3…表示。
7.2常用工作用菌种的生物学特征
①金黄色葡萄球菌
形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄状，菌落直径为0.8～1.5mm，革兰氏染色阳性。
培养特性：
⑴在肉汤琼脂培养基、营养肉汤中，生长良好。在28～38℃生长较好，pH为4.5～9.8，以pH7.4左右最好。
⑵营养琼脂平板，培养24～48小时，形成圆形凸出、边缘整齐、表面光泽且金黄色的菌落，直径1～2mm（应挑选光滑型菌落）。
⑶营养肉汤培养基，生长迅速，经37℃24小时培养呈均匀混浊，管底稍有沉淀，微微振摇即可上升，消散均匀。但培养基含有可发酵糖类或菌型变为粗糙型者，可出现自然凝集现象，⑷抵抗力：在干燥情况下，可生存数月，在无糖培养基内生存数年。对热80℃30分钟才被杀死。在1%石炭酸液中15分钟被杀死，碘酒中须1分钟，75%酒精中须数十分钟才被杀死。
②藤黄微球菌
形态与染色：个体略大于葡萄球菌，直径0.5～3.5um，单个成双或四联状排列，或呈不规则的团块。革兰氏染色呈阳性。
培养特性：专性需氧菌，营养要求不高，最适温度为25～30℃。在琼脂平板上培养可形成圆形凸起，光滑、不透明黄色菌落。在液体培养基中均为混浊生长。
③枯草杆菌
形态与染色：菌体细短棒状，0.7～0.8um宽，2.0～3.0um长，单个或呈链状，两端半圆形，染色均匀。芽孢0.6～0.9um宽，1.0～1.5um长，椭圆形或圆柱形，常产生于菌体中央或接近中央。革兰氏染色呈阳性，能运动。
培养特性：
⑴营养琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，凹凸不平，边缘锯齿状，稍有蔓延，呈白色或微黄色，应挑选粗糙形菌落），本菌变异时可出现光滑型菌落。
⑵营养肉汤培养基中呈少量混浊并生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜，粘附于试管壁上。
⑶培养最适温度30～37℃，生长范围15～55℃，兼性厌氧或需氧。
⑷抵抗力：菌体湿热55℃，1小时即被杀死，芽孢能耐高温，100℃3小时才被杀死，120℃40分钟才被杀死。
④短小芽孢杆菌
形态与染色：本菌为杆状，革兰氏染色阳性，无荚膜，芽孢偏生，椭圆形，有动力。
培养特性：本菌与枯草杆菌相似，培养最适温度30～37℃，生长范围15～50℃，兼性厌氧或需氧。此外，短小芽孢杆菌有两点不同于枯草杆菌：在琼脂培养基上，大多数菌株的菌落为光滑型并变为微黄色，用于检定的菌种，应挑光滑型菌落；有些菌株营养需要生物素（维生素H）及氨基酸。
⑤大肠埃希菌
形态与染色：短杆菌0.4～0.7um宽，2～4um长，两端钝圆，大多数有5～8根鞭毛，运动活波，但亦有无鞭毛，不运动，不形成芽孢，革兰氏染色阴性。
培养特性：菌落扁平，光滑，圆润，在EMB琼脂平板上呈紫黑色，有金属光泽。
⑥白色念珠菌
形态与染色：本菌为革兰氏阳性，但染色不均匀，卵圆形，壁薄生芽的酵母样菌。大小为2.5～4um。
培养特性：琼脂平板培养，菌落表面湿润粘稠，圆形，乳白色，微凸，边缘整齐。
⑦生孢梭菌
形态与染色：大多数菌株周身皆有鞭毛，能运动，并可形成杆状或梭状芽孢杆菌，菌体一般较粗
大，长约3～8um，宽约0.4～1.2um。革兰氏染色呈阳性，菌体老化后常可变为阴性。
培养特性：本菌严格厌氧，培养的最适温度为37℃。在琼脂平板上培养24～48小时，生长缓慢，菌落直径2～5mm，蔓延生长，边缘不规则，有锯齿状突起；在硫乙醇酸盐流体培养基中24～48小时生长良好，呈长絮状，伴有恶臭，再培养数日后菌体可自溶，液体由混浊变清。
⑧铜绿假单孢杆菌：
菌体长短不一，菌落粘连，培养基被染成绿色。革兰氏染色呈阴性。
La型菌落：湿润扁平大山脉状，在营养肉汤培养基中呈易碎菌落，膜下菌液浑浊。
Sm型菌落：表面粗燥突起，呈乳头状，在营养肉汤培养基中形成厚膜，膜下菌液澄清。
⑨黑曲霉：
菌落为近乎透明的小圆点装或匍匐于培养基表面的不规则丝状物。镜检为3~10um圆形。
接种至改良马丁培养基上先是形成黄色菌落，后长出孢子。培养5~7天后可观察到斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。
菌种的复苏传代及保存标准程序 目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。 范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。 职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。 内容： 菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。 1.菌种的复苏 1.1冻干菌种的复苏 检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。 1.1.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。 ③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。 1.1.2操作： 1.1. 2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。 1.1. 2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。 1.1. 2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。 1.1. 2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。 1.1. 2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将
冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。 1.1. 2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。 1.1. 2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。 1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。 1.2.1准备：①冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。 ②细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按1：1比例混匀制成。 1.2.2按1.1.2.1~1.1.2.4操作，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。 1.2.3按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-20℃或-80℃条件下冷冻保存。 1.2.4制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按1.2.3冻存。 1.3冻存菌悬液的复苏： 1.3.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基10ml、硫乙醇酸盐流体培养基12ml或改良马丁培养基10ml等）、琼脂斜面或平板培养基。 ③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。 1.3.2操作： 1.3. 2.1从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。
菌种传代与复苏 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-
菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 传代和接种 菌种冻干粉复苏 把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 菌种斜面传代操作
培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。 堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。菌种的培养与保存 大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时白色念珠菌23-28摄氏度培养7天黑曲霉23-28摄氏度培养7天 将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8摄氏度）保存，一般2个月转种一次。菌悬液的制备 取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌苔少许接种至营养肉汤中（10ml/支，已灭菌），将已接种毕的细菌管置35-37摄氏度培养18-24小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用两周。
菌种管理制度 1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。 3、定义 标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 4、职责 4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。 4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 5、规程 5.1菌种的申购 部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。 5.2菌种的接收 菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。 5.3菌种的保存 5.3.1工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而
4.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 4.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 4.3 传代和接种 4.3.1 菌种冻干粉复苏 4.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 4.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 4.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 4.3.2菌种斜面传代操作 4.3.2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 4.3.2.2点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。
借用一下 标准菌验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理 介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理规程规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书 1.标准菌的来源 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC （B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～8 ℃，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球 3.2培养基 改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮. 液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮. 3.3操作步骤： a.打开洁净工作台。 b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。 c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。 d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。 e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。 g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培
菌种传代与保藏作业指导书
菌种传代与保藏作业指导书 1.标准菌的来源 标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基 改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、
余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。 i．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。 3.4菌种确认 用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。 3.5污染处理 假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管 3.6菌种的传代与保藏
菌种传代与复苏
菌种传代与复苏 （实操） 一、菌种传代与复苏 1.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 1.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心， B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 1.3 传代和接种 1.3.1 菌种冻干粉复苏 1.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 1.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 1.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 1.3.2菌种斜面传代操作 1.3. 2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
2015版药典菌种传代中国药典2010年版二部及菌种使用 说明书 导读:就爱阅读网友为您分享以下“中国药典2010年版二部及菌种使用说明书”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对https://www.doczj.com/doc/fd16924246.html,的支持! 依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书 1.标准菌的来源 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(China Medical culture collection ,CMCC)提供的冷冻干燥菌种(0代)或由上级药检部门已接种好的菌种斜面(3代)。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签 1 CMCC(B)代表细菌(bacteria),CMCC(F)代表真菌(fungi)每种菌具有固定的代号。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括:菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于,20?，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面(3代)应检查菌种管是否完好。储存于2, 8 ?，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备
3.1物品及试剂:接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球 3.2培养基 2 改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮. 液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮. 3.3操作步骤: a.打开洁净工作台。 b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。 c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开(开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂)。 d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5,0.8 ml 到安瓿中。 e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌 3 种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。 g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度(细菌培养温度30,35?，培养18,24小时;真菌培养温度23,28?，培养3,5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长;若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。 h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1,2滴滴在改良马丁琼
菌种传代与复苏 （实操） 一、菌种传代与复苏 1.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 1.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心， B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 1.3 传代和接种 1.3.1 菌种冻干粉复苏 1.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 1.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 1.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 1.3.2菌种斜面传代操作 1.3. 2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 传代和接种 菌种冻干粉复苏 把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，
将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 菌种斜面传代操作 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。 堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。菌种的培养与保存 大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时白色念珠菌23-28摄氏度培养7天黑曲霉23-28摄氏度培养7天将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8摄氏度）保存，一
菌种传代与保藏作业指导书 1、标准菌得来源 标准菌株必须购买具备资质得菌种保藏中心提供得冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。 2、标准菌得验收 从菌种保藏中心购买得原始菌种管就是玻璃安瓿装得冻干菌，接收同时应检查就是否有随菌种附有得相关资料。接收菌种时应检查安瓿得数量与名称，与每一支安瓿得完整性。在相应得菌种接收记录上记上所有得关于菌种得信息，如名称、数量与接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入得0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。购买得已接种好得菌种斜面（3代）应检查菌种管就是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。 3、标准菌得复苏、复壮及标准储备菌株得制备 3、1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球 3、2培养基 改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮、 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、
乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 3、3操作步骤： a、打开洁净工作台。 b、在安瓿得外表面用75%得酒精擦拭并让其自然风干。 c、用一小砂轮在安瓿得上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。 d、以无菌方法用一无菌吸管从已准备好得上述液体培养基中移取0、5～0、8 ml到安瓿中。 e、轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种与液体培养基充分混合并完全溶解。 f、用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应得液体培养基。 g、根据安瓿上所标明得不同菌种类型而将其培养于相应得温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察就是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。 h、取经复苏后得上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后得菌种中加入100ml20%得无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应得确认。其
菌种得复苏传代及保存标准程序 目得:建立菌种得复苏、传代及保存标准程序、 范围:适用于检定用菌种得复苏、传代及保存得操作、 职责:质管部生物测定人员对本规程得实施负责。 内容: 菌种得复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行、操作中使用过得滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡,试验结束后经1２1℃３0分钟高温灭菌处理。 １.菌种得复苏 1.1冻干菌种得复苏 检定用标准菌种,由中国药品生物制品检定所提供,为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。 1．１.１准备: ①用具:灭菌1ｍl滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。 ②培养基:根据菌种得性质选择合适得液体培养基(营养肉汤培养基或改良马丁培养基)、营养琼脂(或改良马丁琼脂)斜面数支。 ③消毒液:7５%酒精、碘酒、0.1％新洁尔灭或84消毒液等。 1.１。2操作: 1。1。２.１将准备妥得冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台、 1.1.2。2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕,再７5％酒精棉擦净菌种管外壁,放在灭菌双碟内待干。 1.1。2。3点燃酒精灯,将菌种安瓿得封口一端在火焰上灼烧红热,用灭菌滴管吸取液体培养基少许,滴在灼热得菌种安瓿封口一端,使其骤冷而炸裂。 １．1.2.4取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂得管口打开后,把菌种安瓿放入灭菌双碟内。 1．1。2、5另取一支灭菌滴管,在火焰旁吸取适用液体培养基少许,加至菌种管底部,将 冻干菌搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,接种至液体培养基内、用接种环取菌液
划线接种于琼脂斜面培养基上。 1.1。2。6将已接种得液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下(一般细菌在3０~35℃,真菌在23~28℃)培养24ｈ。 １。1.2。7 取出培养物(第1代),仔细观察菌苔形态、有无杂菌,必要时涂片、革兰氏染色镜检,若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型,可进行平板分离单菌落。 １、２为保证工作用菌株得传代次数不超过5代,并减少购买冻干菌种得次数,可在对冻干菌种复苏得同时制备部分菌悬液(第1代)冷冻保存,并将此冻存菌液复苏后得第２代培养物冻存保藏。 1.２.1准备:①冻存保护液(４0%无菌甘油)及灭菌冻存管、 ②细菌冻存液:由液体培养基与冻存保护液按1:１比例混匀制成。 1.２．２按1.１、２。1～1、1.２。４操作,将冻干菌复溶后,吸取菌悬液加入到细菌冻存液中,混匀。 １。２.3按1mｌ/管得量分装至灭菌冻存管中,密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-２0℃或－80℃条件下冷冻保存。 １.2.４制备第２代冻存菌悬液时,可用接种环直接刮取第１代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长得纯菌落,再接种至细菌冻存液中,混匀后按1.２。3冻存。 1。3冻存菌悬液得复苏: 1.3．1准备: ①用具:灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。 ②培养基:根据菌种得特性选择适宜得液体培养基(如营养肉汤培养基10mｌ、硫乙醇酸盐流体培养基１2ml或改良马丁培养基1０ml等)、琼脂斜面或平板培养基。 ③消毒液:75％酒精、０、1%新洁尔灭或84消毒液等、 1。3。2操作: 1。3。２。１从低温冰柜中取出菌种冻存管,室温下放置使其自然解冻。1．３。２、2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台、 1.3．2、3用75％酒精棉球擦拭菌种冻存管外壁,稍干。 1.3. 2.4点燃酒精灯,在火焰旁打开菌种冻存管盖,用一支灭菌滴管吸取解冻得菌悬
几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法） 定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2 接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。 2.1.4 密波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。 2.1.5 挖块接种法 挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。 2.2 穿刺接种
菌种验收、传代与保藏作业指导书 1.目的 为确保菌种管理的正确操作性，制定本作业指导书。 2.适用范围 适用于实验室各菌种。 3.职责 检验员负责菌种的验收、传代与保藏。 4.内容 4.1定义 标准菌株是指由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。 传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每培养一次即称为一代。所有传代用菌种和工作用菌种的传代次数应严格控制，原则上不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度传代增加菌种变异和污染的风险。 4.2标准菌的来源 标准菌株需有明确来源，应可溯源至国内或国际认可的菌种保藏中心的标准菌株。 4.3标准菌的验收 新购买的标准菌株应检查是否随菌种附有菌种证书。接收时还应检查菌种数量和名称及每一支包装的完整性。在相应的菌种验收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和验收日期等。新购入的标准菌株储存于－20℃冰箱。 4.4菌种的复苏与传代 根据不同的菌种保存方法和保存形式，选择适宜的方法无菌开启菌种。应减少开启过程对菌种活力的影响，且不要引入外部污染。 经冷冻干燥安瓿保存的菌种：先用适宜的消毒剂擦拭安瓿后，用砂轮在安瓿上部1/3处划痕，将安额管顶部烧热，将无菌水滴于加热处使顶部出现裂纹，用无菌器具轻叩裂
纹处上部，开启安瓿管的顶端，用适宜的缓冲液或液体培养基溶解菌块，并转移至新鲜的培养基上培养。 甘油小瓷珠保存法保存的菌种：取出冻存管并用力摇晃，使管内瓷珠分散。无菌条件下拧开冻存管，用无菌的接种环（接种针）或镊子取出1个小瓷珠，拧紧瓶盖。尽可能快地将冻存管放回原来的保存环境，温度过多改变将减弱细菌的生产能力。取出的小瓷珠可以直接放在平板培养基上作划线接种，或者直接置于适合的液体培养基中培养。 斜面低温保存法保存的菌种：从冰箱中取出菌种斜面，放置室温后，移入生物安全柜。点燃酒精灯，把接种环金属部分放在火焰上灼烧，往返通过3次，然后用左手握住培养基试管，将管口靠进火焰旁，右手用无名指、小指及掌部夹住塞子，拨开塞子，用接种环在营养琼脂斜面刮取少量菌苔堵上塞子，左手将菌种管放下，另取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开塞子，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使菌划在斜面的表面上。取出接种环，在火焰旁将培养基管塞子堵上，然后将接种过菌的接种棒在火焰上灼烧灭菌。 4.4.1标准菌株传代 4.4.1.1从冰箱中取出的新购买的标准菌株（一般为第二代，G2），以及灭菌的对应培养基一起移入生物安全柜。按照说明书指示复溶标准菌株，用10μL一次性接种环蘸取菌液，直接接种至平板或液体培养基，置于对应的温度培养，此为第3代（G3）。 4.4.1.2挑取平板上纯菌落按甘油小瓷珠保存法保存，作为保存菌种（G3），也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面培养数支，按斜面低温保存法保存，作为工作用菌种，此为第4代（W4）。 4.4.1.3将第3代（G3）瓷珠保存的菌于-20℃冻存，将工作用菌（W4）于适当温度下培养适当时间后在4℃冰箱保存，用于日常检验。 4.4.1.4取冷冻保存的第3代（G3）瓷珠菌种转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成瓷珠菌种保存菌第4代（G4）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后4℃冰箱保存用作工作用菌种，此仍为第4代（W4）。 4.4.1.5将第4代菌种（G4）于瓷珠菌种保存管冻存，将生长、转种后的第3代（G3）菌种经高温灭活处理后丢弃。 4.4.1.6按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新采购标准菌株，重复上述操作，保存和使用菌种。 4.4.1.7当工作用菌种代数小于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用
目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。 范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。 职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。 内容： 菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。 1.菌种的复苏 冻干菌种的复苏 检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。 1.1.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。 ③消毒液：75%酒精、碘酒、%新洁尔灭或84消毒液等。 1.1.2操作： 1.1. 2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。 1.1. 2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。 1.1. 2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。 1.1. 2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。 1.1. 2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将
冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。 1.1. 2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。 1.1. 2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。 1.2.1准备：①冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。 ②细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按1：1比例混匀制成。 1.2.2按操作，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。 1.2.3按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-20℃或-80℃条件下冷冻保存。 1.2.4制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按冻存。 冻存菌悬液的复苏： 1.3.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基10ml、硫乙醇酸盐流体培养基12ml或改良马丁培养基10ml等）、琼脂斜面或平板培养基。 ③消毒液：75%酒精、%新洁尔灭或84消毒液等。 1.3.2操作： 1.3. 2.1从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。 1.3. 2.2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台。
四、试验用菌种的培养传代方法 ●程序： 冻干菌复苏————接种（斜面）（菌种传代） （营养肉汤） 制备菌悬液对照菌液 ●检定用标准菌种，由中国药品生物检定所提供，为冷冻干燥菌种。 ●菌种的复苏与保存在专用无菌室或超净工作台内进行。 1 菌种的复苏 ?把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。 ?先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。 ? 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24 h。 ? 取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3 代即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。 2 菌种的传代与保存 方法（1）：菌斜面菌斜面（保存） ? 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上著名菌名及接种日期。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 ? 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环伸人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。 ? 堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。? 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。? 将已接种毕的细菌管置35~37℃培养22~24小时，霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培养7日。取出后放人冰箱保存，一般3个月转种一次。 方法2：菌斜面营养肉汤分离平板菌斜面 如果菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代（分离菌落）： 用接种环取上述菌管（斜面）菌苔少许接种置营养肉汤中(5ml/支,已灭菌), 置35~37℃培养18~24小时后，再用接种环取培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液），接种于分离平板，置35~37℃培养18~24小时，用接种针选典型菌落划线于营养琼脂斜面，置35~37℃培养18~24小时。一般同时接种几支管，其中一支用于以后菌种传代或接种到半固体琼脂培养基中，其它用做工作菌种。 常用分离平板： 大肠埃希菌——EMB琼脂平板 铜绿假单胞菌——溴化十六烷三甲铵琼脂培养基 金黄色葡萄球菌——甘露醇氯化钠琼脂培养基 沙门菌——SS琼脂平板