植物基因工程中的常用启动子 _3231 植物基因工程中的常用启动子
植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能可分为三类：组成型启动子(constitutive promoter )、诱导型启动子(inducible promoter) 和组织特异性启动子(tissue – specific promoter)。这种分类大体上反映了它们各自的特点, 但在某些情况下，一种类型的启动子往
往兼有其它类型启动子的特性。
1 组成型启动子
组成型启动子在所有组织中都启动基因表达，具有持续性，不表现时空特异性；RNA和蛋白质表达量也是相对恒定的。它包括异源和内源组成型启动子两类。植物基因工程中应用的异
源组成型启动子主要有CaMV35S启动子（来源于烟草花叶病毒基因），能在大部分植物中对异
源基因进行启动表达，完整的CaMV35S启动子是植物基因工程中应用最为广泛的组成型启动
子之一，如在马铃薯、拟南芥、烟草、蘑菇、毛白杨等植物中的转基因应用。常用的还有来
自农杆菌的Nos和Ocs启动子。内源启动子主要有水稻肌动蛋白(actin)和玉
米泛素(ubiquitin)基因的启动子，这些启动子可以更有效地驱动外源基因在单子叶植物中的表达。
Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，
用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果。用这些启动子代替
CaMV 35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。组成型启动子已经广泛地应用于双子叶植物、单子叶植物以及真菌等的基因工程中。但是由
于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有表达，应用中逐渐暴露出一些问题。例如外
源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原
有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致
死亡(karlowaki et al., 2003; Ehasani et al., 2003; Miyao et al., 2003)。另外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象
(Kumpatla et al., 1998)，因此，人们寻找更为有效的组织、器官特异性启动子代替组成型
启动子，以更好地调控植物基因表达。
2 特异性启动子
特异性启动子可分为两类，一是受诱导表达的启动子，能对外界的物质如病原物、化学物质
或逆境作出反应，启动植物体内相应的生理生化过程。二是组织特异表达的启动子，使基因
在特定的组织中表达。特异性启动子避免了基因过量表达对植物体的伤害，同时可避免外源
基因在食用部位表达，解决了食品安全性问题。特异性启动子的克隆和应用为
在植物中特异
性地表达外源基因奠定了基础。
(1) 诱导型启动子
诱导型启动子在某些物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高基因的转录
水平。他们有
以下共同特点：?[3][4][5]启动子的活化受物理或化学信号的诱导；? 具增强子、沉默子或类似功能的序列结构；? 感受特异性诱导的序列都有明显的专一性；? 一部分该类型的启动子同时具组织特异性表达的特点；?该类启动子常以诱导信号
命名，可分为光诱导表达
基因启动子，如rbcS、cab基因启动子；热诱导表达基因启动子如大豆的Gmhsp17。3-B启动子；创伤诱导表达基因启动子如水稻的RCH8启动子；激素诱导
表达基因启动子如绿豆的
VR-ACS6启动子；真菌和共生细菌诱导表达基因启动子如马铃薯P69B启动子等(王关林和方宏筠，1998)。
(2 )组织特异性启动子
组织特异性启动子的调控机制目前已进行了深入的研究，基因的上游存在着调
控序列，启动
子除具有一般的结构外，通常还有一些调控特异表达的元件。在组织特异性启
动子调控下，
基因的表达通常只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节
的特性。
根特异性启动子的研究
Keller等1989年分离了来自烟草的富含羟脯氨酸的糖蛋白hrgp基因，这个基因所编码的蛋
白用来强化新形成侧根的细胞壁，在根中特异表达；Keller 等1991年又发现一个法国菜豆胞壁蛋白基因富含甘氨酸蛋白grp基因启动子是根管束组织特异表达的，在其-96上一页[3][4][5]～- 76bp处有一个特异性表达元件负责根尖膨大维管分化区组织带中的主要表达。
茎杆和叶片特异性启动子的研究
Kyozuka等 (1993 ) 研究了水稻和番茄的rbcS基因启动子在水稻中的启动活性，证明了它
们都能驱动gus基因在叶片和茎杆中特异表达。Iris Meier等 ( 1995) 研究番茄rbcS基因家族也发现rbcS3A在叶片和茎杆中特异表达。Sheng等研究水稻cab基因启动子，证明了cab基因启动子仅在绿色组织中启动活性。大多数叶片和茎杆特异的启动子同时也是受光诱导的
启动子。
生殖器官特异性启动子的研究
Mariani等将烟草花药绒毡层特异表达基因启动子TA29与核酸酶基因Barnase、RnaseT 融合后转化植物核酸酶基因在花药中特异表达，破坏绒毡层, 获得雄性不育烟草和油菜，开创了
基因工程创造雄性不育系的先河，至今已在烟草、玉米、油菜、拟南芥、水稻等植物上获得
成功。Annadana等克隆了菊花UEP1 启动子并与4个异源启动子（矮牵牛的chs2A 和EPF225, 拟南芥的CER6以及马铃薯的PMC）比较发现：UEP1启动子在伞形花序和花盘小花的花瓣中表
达量最高，紧接着是CER6上一页[3][4][5]和EPF225启动子，在伞形花序小
花中UEP1启动子的表达量是CaMV 35S启动子的50倍。
维管束特异性启动子的研究
目前发现的能够定位于维管组织的启动子根据其来源基本可以分为两种：一是植物本身特异
性表达蛋白的基因的启动子，如能在韧皮部特异表达的玉米蔗糖合成酶基因
Sh1启动子，谷氨酰胺合成酶基因GS34启动子；二是能特异性侵染植物维管组织的病毒基因启动子（刘昱
辉和贾士荣，2003）。
韧皮部特异性启动子的研究
韧皮部特异性启动子区别于其它类型启动子的一个显著特点是在该类启动子序列中存在一
段与启动子的韧皮部特异性表达有关的序列。将几种韧皮部特异性启动子的序列进行比较，
发现在距TATA box上游的不同位置，有一个13bp的保守序列
T/ATAAGT/AACGAAT/CC/A，它可能与韧皮部特异表达有关，除此保守序列外，启动子中可能还存在其它的决定韧皮部特异
性的元件，例如在对杨树树皮贮藏蛋白(bark storage protein, BSP)基因、
笋瓜韧皮部蛋白2基因(PP2)及竹节花黄斑驳病毒(commelina yellow mottle vims CoYMV)启动子序列分析发现，前两者分别存在特征序列GCTATG和CGTATG，推测(G/C)(G /C)TA TG序列可能也与启动子的韧皮部特异性及启动子的活性密切相关（张海利和吕淑霞，2003）。蒋浩等将笋瓜韧皮部蛋白(phloem protein) PP2杨树树皮储藏蛋白BSP启动子通过农杆菌介导转化烟草，首次用转基因植物证明笋瓜PP2上一页[3][4][5]基因启动子可驱动外源基因在
异源植物韧皮部及分生组织中特异性表达。
种子和果实中特异性启动子的研究
李丽等利用PCR技术从油菜基因组DNA中分离napinB启动子，该启动子为种子特异表达。
通过比较发现，不同napinB基因启动子5’端起始密码子前300bp中相当一部分序列是保守
的，越靠近起始密码子，同源性越高，甚至某些区段核苷酸序列高度一致。由此可见，napinB基因启动子间具普遍同源性。napinB启动子5’上游区域与以往发表的napin启动子编码区比较表明，一些序列在进化上具有保守性，可能影响基因调控并与种子特异表达密切相关。 2A12是番茄中另一种果实特异性启动子。毛自朝等（2002）用PCR方法获得了番茄果实专一
性启动子(2A12)和农杆菌（C58）Ti质粒上的ipt基因，并使两种嵌合基因经农杆菌介导转
入番茄品种“中蔬4号”的基因组中。GUS组织化学活性分析表明，2A12启动子具有严格的果实表达专一性。转基因果实中细胞分裂素的含量增加，最终导致果实中种子发育的停滞和
胎座组织的增厚，并形成无籽番茄果实，且果实采后的储藏保鲜时间延长了1－2周。
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养 基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另 一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有 液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。 水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。 （2）琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 （3）琼脂糖凝胶的染色 电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。 三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌 感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培 养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培 养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液 中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去 上清液
（一）基因工程的定义、诞生及重大发现 基因工程是利用人工的方法将DNA在体外进行切割，再和一定的载体拼接重组，获得重组的DNA分子，然后导入宿主细胞或者个体，使受体生物的遗传特性得到修饰或改变的过程。 基因工程的正式诞生是以斯坦福大学的Cohen等人于1973年建立的基因工程的基本模式为标志。Cohen的实验向人们证实，基因工程很容易打破不同的物种之间的界限，可以依据人们的目的和意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型，因此把这一年定为基因工程诞生元年。基因工程得以诞生完全依赖于分子生物学、分子遗传学、微生物学等多学科研究的一系列重大突破，概括起来，从20世纪40年代开始，在现代分子生物学研究领域中，理论上的三大发现和技术上的三大发现对基因工程的诞生起到了决定性作用。 基因工程理论上的三大发现： （1）1928年，英国医生格里菲斯发现了生物主要的遗传物质是DNA （2）1953年，沃森和克里克明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制的机制 （3）1961年，以莱文伯格为代表的一批科学家，经过大量的实验，1966年全部破译了64个密码，编排了一本遗传密码字典。 基因工程技术上的三大发现： （1）DNA分子的体外切割和连接。 （2）利用载体携带DNA片段 （3）大肠埃希菌转化体系的建立 （二）园艺基因工程的介绍 园艺基因工程具有的特点：1、植物细胞具有全能性2、园艺植物遗传资源丰富3、植物细胞具有细胞壁4、染色体基因组庞大而且往往是多倍体。 园艺基因工程主要包括：目的基因的克隆、表达载体的构建、目的基因的植物细胞的遗传转化、细胞培养及蜘蛛再生、转化植株的筛选与鉴定等。 园艺基因工程的研究与发展的领域：1、花卉基因工程2、果树基因工程3、蔬菜基因工程4、药用植物基因工程 -----------------------文献 （三）基因工程在农业中应用实例 随着人口的不断增加，在世界上不少地方视频的供给都成了大问题。生物工程技术的应用为最终解决了这一问题提供了有效的途径。科学家利用基因工程可培育出具备抗寒、抗旱、抗盐碱、抗病等特性的品种，使得适合农作物生长的范围大大增加。 （１）提高植物固氮能力和光合效率 科学家发现了一种与合成脯氨酸有关的基因，将其转入固氮菌后，后者获得了即固氮又抗盐的能力，从而有助于植物的生长。植物光合作用效率的高低决定了其产量的多少，英国剑桥的植物育种所研究了如何转移叶绿体基因，将其中的高光效基因转移到另一种品种中去，以增强其光和效率，从而能产生更多的粮食。根瘤菌可帮助豆科植物固定、吸收和利用空气中游离的氮，科学家们曾把肺炎克氏杆菌的孤单基因转入大肠杆菌，是大肠杆菌也能直接利用空气中的氮。日本已成功将固氮基因转入到水稻根系微生物中，这种微生物可向水稻提供1/5的需氮量，因而可减少氮肥的使用量。 （２）提高粮食蛋白质含量 应用基因工程技术还可以使粮食中的蛋白质含量提高。美国威斯康星大学的研究人员从菜豆中提取了储藏蛋白质基因，并将其转移到向日葵中后，表达了该基因美国明尼苏达大学也进行了类似的研究，他们把玉米醇溶蛋白基因转移到了向日葵根部的细胞中。这些实验
植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月
前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
1
目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
2
植物基因工程的重要意义 关键词：植物基因工程技术，转基因 正文： 作为21世纪科技的重要发展项目，基因工程技术在植物方面应用的意义主要体现在以下五个方面。 1．植物基因工程技术可以实现超远缘育种,克服不亲和障碍 我们知道，在作物育种中最早应用的是植物组织培养技术，这种技术已在花卉、药材、森林和农作物育苗得到广泛的应用，我国已在甘蔗、人参和马铃薯等方面收到显著经济效益。此外，还可从培养细胞或再生植株选择所需要的突变体。如Shepard(1983)从马铃薯培养物中选出一种能抗腹疫病(Phytophthorainfectans)的抗性植株以及利用培养细胞生产诸如喜树碱等化合物。但以上方法只是同类植株的基因改变。此外人们还对植物原生质体融合进行了研究。但是植物细胞融合后性状的表达，取决于它在以后有丝分裂时染色体是否发生交换或丢失情况。[1]但到目前为止，由融合的细胞而能培养成植株者容寥寥无几，这可以说是克服远缘杂交不亲和障碍的最早例子。如果说细胞融合可以克服种属之间不亲和性，而基因重组则可在更大范围内进行了。动物基因如萤火虫的发光蛋白基因,寒带鱼的抗冻蛋白基因,蛇、蝎的毒液基因等也已转移给作物,分别获得能发光的转基因烟草,抗寒的转基因甜菜、转基因番茄和抗虫的转基因棉花等。[2]由此可见，外源基因导入植物细胞后引发的改变是巨大的。 2．植物基因工程技术可以增强作物改良力度,促进品种更新换代 作物改良基本有两方面，其中提高作物品种的光合与养分效率、病害与虫害抗性正在成为植物基因工程的研究重点,促使作物品种适应低温、干旱、雨涝、土壤瘠薄和盐碱以及温室效应等新旧灾害从而提高作物产量，也已成为基因工程育种的主要内容。 农业生产中，增加粮食产量无非依靠两种途径:一是提高作物品种的生产能力;二是减轻环境因素对作物生长的不利影响。据报道，全世界每年因虫害、病害、草害以及寒冷、干旱、盐碱等灾害对粮食生产所造成的损失令人惊叹：全球每年因虫害与病害所造成的作物减产达30%以上，因杂草所损失的粮食至少在10%以上，再加上低温、干旱和盐碱等各种因素，全世界每年至少要损失粮食产量的一半以上。[3～5] 同时，为了防治病虫害及杂草等，还要施用大量的化学农药，这不仅消耗大量的能源，更严重的是对生态环境造成了极大的甚至是不可逆的破坏。为了摆脱上述困境，从20世纪80年代起，人们开始研究和利用转基因抗性植物来预防病虫害和杂草等，并收到了良好的效果。与传统作物育种技术相比，利用基因工程技术进行遗传育种有其自身的优势，一方面由于它可以将特定的抗性基因定向转移，因而成功率较高，可大大提高选择效率，在很大程度上避免了传统育种工作的盲目性；另一方面是其基因来源打破了种属的界限，除了植物基因以外，动物和微生物的抗性基因都可以作为外源基因转人植物基因组中，并获得表达。[6] 3．植物基因工程技术可以拓宽应用研究,扩大生产领域 随着转基因植物技术日益成熟,利用植物的生物反应器作用,进行贵重药品、人畜疫苗和精细化工等的生产,因具有成本低,竞争力强的吸引力,正在成为高技术及其产业化的新兴热门领域。现已成功地将干扰素、胰岛素、多肽抗体、人血清白蛋白等基因转给植物进行这些药物的生产。美国现已得到多肽抗体转基因烟草,美国还在通过转基因植物研制麻疹、乙肝、艾滋病等疫苗,甚至成功地获得了口服植物疫苗。现国际上正在出现研制营养药物的新思路。此外,现还大量进行用于塑料、染料、涂料、洗涤、香料、润滑剂等的转基因植物研究。据
农杆菌介导的植物转基因技术 一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。 二、实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 实验一培养基配制 一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract （牛肉浸膏） 5g/L ，Yeast extract （酵母提取物） 1g/L ，Peptone （蛋白胨） 5g/L ，Sucrose （蔗糖） 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。 二、实验方法 第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract （牛肉浸膏）； 1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose
（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取 200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过高导致抗生素失效。 4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml 培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。 第二组配制YEB液体培养基 1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过高导致抗生素失效。 4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分 装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。 5、分装好后，封口备用。 第三组配制MS液体培养基 1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调pH=5.8。
植物叶绿体基因工程发展探析(一) 摘要从叶绿体的概念、转化优点、转化主要过程及方法等方面概述了叶绿体基因工程的发展情况,介绍了叶绿体基因工程的应用,包括提高植物光合效率、合成有机物质、生产疫苗、增强植物抗性及在系统发育学中的应用等,并提出叶绿体基因工程存在的问题,对其未来发展进行了展望。 关键词植物叶绿体;基因工程;发展;应用;存在问题;展望叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器,其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年Straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年Baur和Correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出,质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣1]。1988年Boynton等首次用野生型叶绿体DNA转化了单细胞生物衣藻突变体(atPB基因突变体),使其完全恢复光合作用能力,标志着叶绿体基因工程的诞生2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术,在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。 1叶绿体基因工程概述 1.1叶绿体简介 叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状DNA。叶绿体DNA分子一般长120~160kb。叶绿体DNA有IRA和IRB2个反向重复序列(分别位于A链和B链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。 1.2叶绿体基因组转化优点 叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。 1.3叶绿体转化的主要过程 叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物4]。 1.4叶绿体转化的主要方法 依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株5]。二是农杆菌T-DNA介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的Ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是PEG处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的PEG浓度下与植物原生质体共培养。 2叶绿体基因工程的应用 2.1提高植物光合效率 植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于Rubisco酶的丰富度。Rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制CO2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量6]。很多科学家正试图通过提高Rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突
植物分子生物学实验技术 班级：研122班 专业：作物生物技术 姓名：陕建国 学号：20122419 授课教师：红英老师
实验一：植物DNA和RNA提取方法的讨论 一、提取植物DNA和RNA的用处 提取植物组织的DNA和RNA，分析其序列，了解序列的排列顺序可以更好的从分子水平上进行研究，从分子水平上改良植物或者说农作物的一些性状、品质等。 （一）提取植物DNA的用处 DNA的提取在植物基因工程以及植物分子生物学研究中占有重要地位，DNA 的提取效率直接决定着后续实验的成败。另外，提取植物DNA在分子育种方面也有很重要的用处。（二）提取植物RNA的用处 提取RNA 可以进行 Northern 杂交、原位杂交、RT-PCR 以及 cDNA 文库构建等很多分子生物学实验。提取RNA也是进行基因表达分析及基因克隆等分子生物学研究的基础。 二、植物组织DNA的提取方法 提取植物DNA的试验原理： 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L 的NaCl 溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。 （一）植物DNA的SDS提取法：（来自You are so late的新浪空间） 试验试剂： 1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L 的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。 3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。 4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。 5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/L HCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6 氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7、 5mol/L 高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O7 0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9、1mol／L HCl。 10、0.2mol/L NaOH。 11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。
第八章植物基因工程 基因工程：在基因的水平上改造生物的技术体系，是指在体外对生物DNA进行剪切、加工，把不同亲本的DNA分子重新组合，并把它引入细胞中表达出具有新的遗传特性的生物这一过程。 植物基因工程：又称植物遗传转化/转基因，是将外源基因转移到植物细胞内，并稳定地整合、表达与遗传的技术。目的是改变植物性状，培育高产、优质high yield、抗逆新品种/系；或者利用转基因植物/细胞来生产外源基因的表达产物。 植物转基因研究的用途： 1）理论研究：如基因功能分析； 2）实践应用：如作物遗传改良。 基因工程的基本内容 1）目的基因的分离； 2）目的基因与载体连接； 3）重组分子转入寄主细胞并繁殖； 4）阳性克隆的筛选； 5）从阳性克隆中提取已扩增的目的基因； 6）目的基因克隆到表达载体，导入寄主细胞并表达。 植物基因工程的一般流程 目的基因的分离→表达载体的构建→植物遗传转化→转化体的筛选、鉴定与植株再生→转基因植物的分子检测→转基因植物的表型鉴定→转基因植物的遗传分析、田间试验 经遗传改良的生物, 统称： genetically modified organism (GMO)； Genetically engineered organism (GEO)。 转基因植物(transgenic plants), 又称： genetically modified plant (GMP)； genetically modified crop (GMC)。 第一节目的基因的分离 目的基因：已经或准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段，称为~。 可能是: 1）全长基因：外显子+内含子+转录启动区+终止区； 2）全长cDNA：UTR区+编码区（ORF）； 3）开放读框/编码区（ORF，CDS）；信使核糖核酸(mRNA)分子中能翻译成多肽的那部分序列。来自DNA分子中的外显子。 4）一个完整的操纵子或基因簇； 5）只含启动子或终止子等元件的DNA 片段。 1. 分离目的基因的策略/方法： 1) 基于已知/同源序列--分子杂交/筛库与PCR； cDNA文库和基因组文库 （1）构建基因组文库或cDNA文库； 基因组文库：将生物基因组DNA切割成一定大小的片段，与合适的载体连接并导入宿主细
瓜叶菊Mlo基因片段的克隆 摘要 瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）是菊科（Compositea）多年生草本植物，是元旦、春节重要的观赏盆栽早春花卉，具有广阔的开发前景和现实意义。近年来，白粉病（Powdery Mildew）逐渐成为制约瓜叶菊商品化产业发展的重要病害之一。瓜叶菊白粉病的传统生物防治方法不仅使病原产生抗药性，还会造成成本增加和环境污染等问题。因此，利用基因工程手段培育具有广谱抗白粉病的瓜叶菊种质资源具有非常重要的意义。 Mlo基因是一种新型的抗病基因，可能参与瓜叶菊白粉病的调控过程。它与显性R基因控制的抗病基因不同，它是由单基因控制的隐性抗病基因，具有非小种专化的持久抗性，其功能类似于G蛋白偶联受体。Mlo基因可能对细胞坏死具有负调控作用，即抑制细胞坏死，类似于其它突变体基因以寄主死亡来抵抗病原菌的入侵，Mlo基因突变为mlo基因后，对细胞死亡的负调控作用被解除，被侵染细胞可能更易死亡，由此引发广谱的抗病性。任何感病的野生型都可以通过对Mlo基因进行诱变而获得抗性。这种抗性，即便是在粗放的栽培管理条件下，也可以在田间得到持久保存，即便没有病原菌的侵染，突变的mlo植物也表现出自身细胞壁加固（cell wall appositions，CW As）和叶细胞的自发死亡现象。因此，对该基因的克隆以及结构和功能的研究，为瓜叶菊的抗病育种奠定了基础并提供了新思路。 本研究以瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）为试材，通过PCR方法克隆了Mlo基因片段的cDNA序列，并采用生物信息学方法对其进行预测和分析，为进一步研究瓜叶菊Mlo 基因的功能和表达情况提供了理论依据。 关键词: 瓜叶菊；Mlo基因片段；PCR扩增；
国内外基因工程的发展 现状及展望 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
国内外基因工程的发展现状及展望 学号：姓名：王雪班级：生物工程1003班 摘要：从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。本文主要介绍了现阶段国内外基因工程的发展状况及未来的展望。 关键词：基因工程国内外发展展望 一．基因工程的成果 1.工程在农业生产中的应用 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，大大提高了营养价值，得到了
基因工程技术的现状和前景发展 摘要:从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 关键词:基因工程技术；前景；现状 一、基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。 由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。 二、基因工程应用于医药方面 目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程
药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。 目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。三、基因工程应用于环保方面 工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。 四、前景展望 由于基因工程运用DNA分子重组技术，能够按照人们预先的设计创造出许多新的遗传结合体，具有新奇遗传性状的新型产物，增强了人们改造动植物的主观能动性、预见性。而且在人类疾病的诊断、治疗等方面具有革命性的推动作用，对人口素质、环境保护等作出具大贡献。所以，各国政府及一些大公司都十分重视基因工程技术的研究
五种常用的植物转基因技术 杂粮作物2010 . 30(3):186～189RainFedCrops''…… 文章编号:1003—4803(2010)03—0186—04 五种常用的植物转基因技术 汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞 (1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167) 摘要:从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管 通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍. 关键词:农杆菌介导法;基因枪法;超声波介导法;子房注射法;花粉管通道法;原理;基本步骤;优缺点 中图分类号:$336文献标识码:B 植物转基因技术是通过各种物理的,化学的和生物的 方法将从动物,植物及微生物中分离的目的基因整合到植 物基因组中,使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物 预期性状的一种生物技术方法.1983年,首例抗病毒转 基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技 术改良农作物.目前,植物转基因技术已在作物改良和育 种领域发挥了重要作用.通过植物转基因技术,一些来自 于动物,植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因,抗非生 物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以 改良现有的农作物和培育新的农作物品种.以DNA重组 技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的 来源,打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障.植
物转基因技术已应用到玉米,水稻,小麦,大豆和棉花等许多农作物.同时,该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中"J.目前,根据转基因植物的受体类型, 植物转基因方法可以分为3大类:以外植体为受体的基因转化方法,如农杆菌介导法,基因枪法和超声波介导法;以原生质体为受体的基因转化方法,如聚乙二醇法,电击法, 脂质体法及磷酸钙?DNA共沉淀法;以种质系统为受体的基因转化方法,如子房注射法和花粉管通道法j.由于以 原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大, 培养过程繁杂,培养工作量大且培养技术不易掌握;原生质体再生植株的遗传稳定性差,再生频率低并且再生周期长;相关的转化方法的转化率低,效果不理想等缺点,所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用.本文将对农杆菌介导法,基因枪法,超声波介导 法,子房注射法和花粉管通道法的原理,基本步骤和优缺点作以简要介绍. 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用,最实用有效并且具有最多 成功实例的一种植物转基因方法J.农杆菌是一类普遍 存在于土壤中的革兰氏阴性细菌.目前,用于植物转基 因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌.某些根癌 农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构和功能相似的质粒和Ri质粒J.Ti质粒和Ri质粒含 有3个功能区:参与农杆菌侵染植物过程的vir区,参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区,在农杆菌中启动质粒复制的orj区.在vir区上的vir操纵子群作用下,rrj质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内,而后将T—DNA整合到植物基因组中J.T-
五种常用的植物转基因技术 植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti 质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T— DNA 是质粒上一段10—30kb的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA 转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。 农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB， pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在VirD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。 农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程；(4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染；(5)共培养及脱菌处理；(6)愈伤组织筛选、分化与植株再生；(7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测；(7)转基因T1代的目标性状鉴定。 农杆菌介导法具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、基因沉默现象少、转育周期
水寨中学生物自主探究学案 内容：基因工程的基本操作程序课时：2课时年级：高二编号64 一、教学目标 1．知识目标： 了解基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）了解基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 二、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 第一课时 三、教学过程 （一）复习上节内容 1、什么是基因工程？DNA重组技术的基本工具有哪些？运载体需要具备哪些条件？ 以上问题可以不展示 （二）讲授新课 1、基因工程的基本步骤包括那四步？ 2、第一步：目的基因的获取 （１）为什么要有目的基因的获取这一步骤？ （２）目的基因的获取方法有哪些？ （3）为什么要建立基因文库？怎么建立的？
（4）如何从基因文库中获取目的基因？ （5）为什么要建立cDNA文库？如何获取cDNA？ （5）PCR技术的原理是什么？利用PCR技术扩增目的基因的前提是什么？ （6）如何获取引物？ （7）请你用文字和箭头描述PCR技术扩增的过程？ 3、第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤） （1）在基因工程的操作过程中，为什么要构建基因表达载体？单独的DNA片段能不能稳定遗传？ （2）参考课本P11页图1—10基因表达载体模式图，在学案上绘出基因表达载体的模式图，并标出其组成部分。并了解什么是启动子、终止子？他们位于哪里？有什么作用？标记基因的作用是什么？
思考:1、作为基因工程的表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么 2、完成教材P11页的“寻根问底” 第二课时 4、第三步：将目的基因导入受体细胞 （1）为什么要把目的基因导入受体细胞而不是在外界培养让其维持稳定和表达？（2）什么是转化？ （3）将目的基因导入植物细胞的方法有哪些？最常用的方法是哪种？（结合示意图，了解农杆菌转化法的基本过程） （4）将目的基因导入动物细胞的基本操作程序是怎样的？要用到什么技术？ （5）早期的基因工程为什么选择原核生物作为受体细胞？大肠杆菌细胞最常用的转化方法是？
植物转基因原理与技术 植物转基因原理与技术 转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体细胞中的过程。微生物和动物细胞转基因开展较早，技术也比较成熟，相对动物和微生物转基因来说，植物转基因开展较晚。自1984年获得第一株转基因烟草以来，近二十年的时间里在数百种植物中获得成功。下面就植物转基因的原理和常见技术做一简单介绍。 原理 根据植物细胞能再生成植株的全能性，利用生物媒介或其他物理化学的方法和技术将外源基因导入受体细胞并且整合到基因组中，通过组织培养获得完整植株。在培养过程中为了筛选阳性转基因植物往往采用植物敏感的抗生素进行筛选，最后经过分子生物学和生理方面的检测来鉴定抗性生根的植株是否是真正的转基因植物。以技术为媒介，一个植物转基因系统必然涉及到外源基因和受体细胞。外源基因可以是克隆到质粒等载体中的或是未经克隆的裸露基因。受体细胞根据转基因技术和植物的类型的不同，可以选择外植体，愈伤组织，原生质体等。一个好的转基因受体细胞应该是具有高效稳定的再生能力，并且能接受外源基因的整合，并对选择抗生素敏感的无性繁殖系。植物转基因流程图如下所示。 外植体） 愈伤组织瞬时表达 外源基因植物受体细胞 原生质体 生殖细胞稳定表达 获得抗性生根转基因苗转基因植物的检测和鉴定（PCR, Southern blot ,Northern blot,生理指标鉴定等） 技术 就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为三大系统：载体转化技术，直接转化技术和种质转化技术。下面分别叙述。 一载体转化技术 载体转化技术是指通过农杆菌的Ti 或Ri质粒，植物病毒的DNA或RNA等生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法。其中土壤农杆菌转化系统是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法。病毒载体转化系统的研究也取得一些成就。 土壤农杆菌是一类浸染受伤植物并且形成冠瘿瘤的革兰氏阴性菌。它的致瘤能力来源于存在于细胞内的Ti（tumour-induced）质粒。它利用Ti质粒控制植物细胞来生产自己独特的“食品”- 冠瘿碱，从而将植物细胞转变成特定营养的安全避难所和工厂。Ti质粒长200-250kb，上面分布着四个区：T-DNA(transferred DNA) ,Vir(virulence gene) ,控制结合转移的区域和与冠瘿碱利用有关的基因区。毒力基因即Vir基因控制着转移DNA 即T-DNA向植物细胞转移，T-DNA是唯一整合进植物基因组的区域，它编码植物激素和冠瘿碱合成酶。T-DNA转化植物的过程如下：植物受伤后释放酚类化合物信号分子被位于细胞膜的VirA蛋白感受，VirA蛋白是受配基刺激自身磷酸化的受体，并将磷酸基团转移给Vir区基因调控蛋白因子VirG。VirG 调控着下游基因的表达来完成T-DNA的切割，包装和转移。 天然的Ti质粒因为太大，酶切位点多又诱导产生肿瘤，所以不适合作为载体。经过改造后可以作为基因工程载体，主要是通过破坏或缺失癌基因成为安全载体，太大不适合操作可以通过同源重互换或功能互补来解决。T-DNA整合进植物基因组与其边界序列相关，而与内部序列无关，因此可以将内部控制植物激