《生物工程进展》1998,V o l.18,N o.1
具有重要应用价值的真核表达系统
陈 峰 朱 祯
(中国科学院遗传研究所,北京100101)
摘要 基于T7RNA聚合酶与T7强启动子(<10)间的特异识别而建立起来的偶联表达系统在大肠杆菌中已取得了令人满意的结果。最近,该系统在酵母、昆虫、哺乳动物细胞和植物细胞中陆续实现了高效表达。T7RNA聚合酶2<10启动子偶联表达系统的相对独立性和高效性,不仅预示着该系统可以在真核基因工程中发挥重要作用,而且其独特的作用机制为人们探索新的特异高效真核表达系统提供了一个可供借鉴的模式。
关键词 真核表达系统 T7RNA聚合酶 T7启动子 高效表达 基因工程
1973年,Cohen把两个携带有不同抗菌素抗性的DNA片段体外连接在一起,得到一个新的质粒,该重组质粒获得了原来两个质粒的双重抗性。这个实验是基因工程的起点,二十多年来,基因工程取得了令人瞩目的成就:人生长激素释放抑制因子、胰岛素、人生长激素、干扰素等一批基因工程产品已经商品化;转基因鼠、猪、牛、鱼以及抗病虫、抗除草剂、延熟保鲜等一
;基因治疗的研究已从单纯的针对遗传病发展到治疗恶性肿瘤、A I D S等非遗传性疾病[1,2,3]。
基因工程技术是以打破物种界限,赋予生物新的遗传性为其特点的,最终目标是使外源基因在受体细胞内按人们期望的方式进行表达。表达系统是基因工程的关键,原核生物表达系统已为人们所深入了解并被广泛应用,真核生物表达系统一度发展缓慢,随着人们对真核生物遗传表达机制的深入了解以及实验手段的不断提高,真核生物表达系统的研究已有了长足的进展[4]。人们已在酵母、昆虫、哺乳动物细胞和植物细胞中实现了外源基因的表达。由于真核生物表达机制的复杂性和目前人们认知水平的局限性,其作为一个应用系统还不够十分完善。尤其当人们期望某一外源基因在特定的条件下、特定的组织中以及特定的发育时期高效表达时,常规的真核表达系统往往不能胜任,使用更为有效的表达调控元件以及对其进行有效地组合,是优化真核生物表达系统的一条重要途径。
T7噬菌体的RNA聚合酶可特异识别T7噬菌体的启动子,并可作为唯一的酶蛋白成分独自催化T7基因的转录过程[5]。基于T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子间特异性识别而建立起来的高效偶联表达系统已显示出了在真核生物基因工程中的巨大应用潜力[6]。
1 T7RNA聚合酶和T7启动子的特点
T7噬菌体属于E.co li烈性噬菌体,基因组全长39,936bp,共编码约50个基因。T7噬菌体的转录过程可分为早期和晚期两个阶段。早期转录使用宿主RNA聚合酶活性,晚期转录阶段是在T7RNA聚合酶作用下完成,这是T7噬菌体调控早期基因表达向晚期过渡的关键。
T7RNA聚合酶由早期转录物编码产生,是T7噬菌体编码的唯一的RNA聚合酶,含883个氨基酸,分子量约为100KD。与E.co li RNA聚合酶相比更为简单,所识别的启动子仅是一个高度保守的23bp的序列(-17～+ 6)[5]。T7噬菌体的转录产物可分为三组,组分 为早期转录物,组分 和 为晚期转录物。它们的一个共同的特征就是各组转录产物的转录
起始位点尽管不同。然而通常却在相同的位点终止转录(T e ,T <和T 7末端)。晚期转录的终止位点T <是最强的一个终止子,其终止效率为90%,其余越过T <的转录物指导合成少量头部蛋白和尾部蛋白。T 7RNA 聚合酶可以识别所有晚期转录启动子,这些启动子有着强烈
的相似性。表1列出了部分晚期转录基因的启动子序列,第 组的10个启动子较弱,分别有2—7个碱基不同于保守序列,第 组的5个启动子相对较强,其中编码主要头部蛋白的基因10启动子<10是最强的启动子。
表1 T 7
噬菌体的部分启动子核苷酸序列
2 T 7RNA 聚合酶偶联表达系统
业已证明,由T 7RNA 聚合酶和<10启动子组成的表达体系在大肠杆菌内十分有效,该系统通常由宿主菌、噬菌体D E 3、pET 系列载体组成。通过IPT G 诱导T 7RNA 聚合酶表达,进而可以启动p ET 载体质粒上目的基因的表达[7]。<10启动子的高度保守序列为23bp ,与真核生物启动子无任何共通特征,在真核生物中很难找到同源序列[8]。<10启动子只被T 7RNA 聚合酶所识别,而T 7RNA 聚合酶只作用于T 7启动子,并且不需要任何其它转录因子协助,这决定了两者在真核细胞中的相互作用是独立的。T 7RNA 聚合酶偶联表达系统的这种独特的作用机制,表明受体细胞将不受生物种属及
细胞类别的限制。不同实验室的实验结果表明:该系统在大肠杆菌、格兰氏阳性细菌、酵母和高等真核生物中都是适用的[9]。尤其是将该系统应用于高等真核生物中时,其高效表达特性是常规表达系统所不具备的。T7RNA聚合酶与T7启动子间的作用高效性主要原因在于: T7RNA聚合酶催化RNA合成的速度是E. co li RNA聚合酶的5倍[10,11],少量T7RNA聚合酶在短时间内即可合成大量的目的RNA。
T7RNA聚合酶<10启动子偶联表达系统在真核细胞中的特异性、高效性是通过使用特殊的真核启动子和级联放大效应实现的。T7RNA聚合酶在真核细胞内的表达依赖于寄主细胞的遗传表达机制,因此在基因的5′2端连接真核生物启动子是必须的。通过真核启动子控制T7RNA聚合酶的合成,进而可启动<10启动子下游目的基因的表达。使用不同类型的真核启动子调控T7RNA聚合酶的表达,借此可以使<10启动子控制下的目的基因进行各种特异性的表达。由于T7RNA聚合酶与<10启动子作用的高效性,使得这种级联放大效应远优于真核启动子对目的基因的直接调控,这是该系统优于常规真核表达系统的主要原因。
真核生物RNA合成的场所位于细胞核内,因此T7RNA聚合酶首先应定位于细胞核内[12]。真核生物细胞核是一个相对封闭的区域,分子量大于60KD的蛋白不能自由通过核孔[13],一些大分子量蛋白质进入细胞核的过程将主要依赖于多肽链氨基酸序列所携带的核定位信号(N uclear L ocati on Signal,NL S)[14,15]。T7RNA聚合酶分子量为100KD,其为原核类型蛋白,不具备核定位功能,因此要进行T7RNA聚合酶的核定位,必须将核定位信号插入到蛋白质的氨基酸序列中。来源于SV40大T抗原的核定位信号已用于几种较大蛋白质的核定位研究[16]。D une等[17]通过对T7RNA聚合酶编码序列的修饰,将核定位信号(PKKKR KV)插入到T7RNA聚合酶第10氨基酸与第11氨基酸残基之间,并使其成功地定位于动物细胞核内。L assner等[18]使用同样策略,将T7RNA聚合酶定位在烟草细胞核内。定位于细胞核内的T7RNA聚合酶即可识别T7启动子,并进一步启动外源目的基因的表达。
真核生物的表达机制与T7噬菌体不同,其初级转录物需进行转录后加工,m RNA的3′2端需要进行聚腺苷化,该过程是由真核结构基因下游的Po ly(A)加尾信号决定的。来自T7噬菌体的终止子T<缺少此一信号,为保证外源基因在真核生物中的有效表达,在外源基因3′2端连接真核生物终止子是必须的。同时考虑到T7RNA聚合酶具有强聚合酶活性,容易造成通读,在真核生物终止子后连接T7强终止子T<以形成双终止子结构,对及时终止外源基因的转录是必要的。
3 T7RNA聚合酶偶联表达系统在真核基因工程中的应用
T7RNA聚合酶偶联表达系统在真核生物中的应用首先是通过瞬时表达实验实现的, Po lk inghom e等人[19]使用重组杆状病毒在昆虫细胞(Sf21)中进行了上述实验,外源氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因在受体细胞中获得了瞬时高水平表达(270—640ng 百万细胞)。Fuerst 等人[20]用重组痘苗病毒在哺乳动物细胞中进行了Β2半乳糖苷酶和CA T的表达研究,其中CA T的表达水平比最佳常规哺乳动物表达系统高400—600倍。L ieber等人[6]完成了外源基因在哺乳动物细胞内稳定的高效表达工作,他们首先获得了可表达T7RNA聚合酶的转化细胞克隆,进而用T7启动子控制下的Cat基因进行转化,在此Cat基因获得了高效表达,表达水平比最强的动物启动子高6倍。
基于T7RNA多聚酶与<10启动子的偶联特性,目前已有人尝试利用此系统进行作物雄性不育系的创制。以绒毡层特异启动子2 T7RNA聚合酶基因作为表达盒 ,以T7启动子2RN ase基因作为表达盒 ,分别转化植物,并相互杂交,获得的子一代植株将同时含有上述两个表达盒。T7RNA聚合酶在绒毡层中表
达将启动<10启动子控制下的RN ase的大量合成,后者将降解花粉形成过程中所必需的RNA组分,进而导致花粉败育。因此所获得的杂交一代将全部是雄性不育植株,可进一步用于杂交制种。
T7RNA聚合酶2<10启动子偶联系统还可应用于作物抗病、抗虫生物技术育种研究。在自然界,某些抗病性品种在病原体感染时,感染部位细胞作出迅速的超敏反应,造成局部细胞坏死,避免了病原体的进一步传播,使病灶局限在感染范围内,而作物本身在整体上得到了保护。T7RNA聚合酶偶联表达系统可强化这一反应通路,使作物的抗性得到加强。在植物抗虫基因工程研究中,通常使用组成型强启动子控制抗虫基因的表达,人们普遍认为使用损伤诱导表达启动子是一种更好的选择。然而,目前所分离到的这类启动子,其特异表达强度均达不到实际应用的要求,使用T7RNA聚合酶偶联表达体系有可能从根本上解决这一问题。
T7RNA聚合酶偶联表达系统还有可能应用于生物反应器生产基因工程产品,使用真核生物作为生物反应器产生的初级产物可正确的进行糖基化修饰和其它转译后加工,因此其性质更接近天然产品。应用此系统以昆虫细胞和哺乳动物细胞作为生物反应器生产生物制剂的潜力是十分巨大的(本节开始已进行了介绍,在此不多赘述)。以植物为生物反应器生产一些需要量大的生物制品有可能大幅度降低生产成本。以马铃薯为例,其块茎作为生物反应器可用于生产血浆白蛋白或新型塑料材料等,它需要目的基因特异性地在块茎中高效表达,T7RNA 聚合酶2<10启动子偶联表达系统符合这一要求。
T7RNA聚合酶偶联表达系统还可应用于医学领域的研究,Chen等人[21]使用T7RNA 聚合酶和T7启动子控制下的T7RNA聚合酶基因以及目的基因(荧光素酶基因或人生长激素基因)共同转染动物干细胞。T7RNA聚合酶基因和目的基因在外源T7RNA聚合酶作用下可直接在受体细胞内表达,受体细胞一旦能够自主合成T7RNA聚合酶就可进一步维持上述基因的持续表达。此系统的一大特点是:目的基因的表达可在细胞质中进行,不需要有关基因进入细胞核内。上述反应通路一经建立,外源基因即可高效地、较稳定地在受体细胞内表达,其中人生长激素基因可持续表达6天之久。鉴于胞浆表达系统的这些特点,其有可能应用于某些特定的基因治疗目的。L i等人[22]直接使用T7RNA聚合酶和含有<10启动子的表达载体转化小鼠干细胞和T I13290肿瘤细胞,使H erp s Si m p lex病毒的胸苷激酶基因在寄主细胞的胞浆内获得了高效表达。在这里应该强调的是除该系统具有高效表达特性外,还具有良好的可控性。使用常规表达载体进行基因治疗时,可能发生的外源DNA的整合会引起目的基因在宿主细胞内的持续表达,并带来了潜在的危险性,因此适时终止目的基因的表达是必要的。T7RNA聚合酶作为蛋白质在宿主细胞内不能自我复制,应用T7RNA聚合酶与DNA 复合物(T7启动子2目的基因)共同转染宿主细胞,可使目的基因在宿主细胞内短时间高效表达,达到治疗的目的。一旦T7RNA聚合酶自行降解将自动终止目的基因表达,其安全性是常规基因治疗方法所无法达到的。
4 结束语
来源于T7噬菌体的T7RNA聚合酶、<10启动子间的特异作用,不仅为我们提供了一个有效的真核生物表达系统,而且为我们探索、建立新的真核生物表达系统提供了一种模式。相信,随着人们对T7RNA聚合酶2<10启动子偶联表达系统了解的进一步深入,以及对系统本身的不断完善,T7RNA聚合酶、<10启动子相偶联作为一个特异而高效的真核生物表达系统将在真核基因工程领域发挥重要的作用。
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A H igh Effective Eukaryotic Expression Syste m of Poten ti a l Use i n Genetic Eng i neer i ng
Chen Feng Zhu Zhen
(Institute of genetics,A cadem ia Sinica,Beijing100101)
Abstract T h is paper in troduces a novel and h igh effective eukaryo tic exp ressi on system, w h ich is based on the specific recogn iti on of T7RNA Po lym erase to T7p rom o https://www.doczj.com/doc/fb4700045.html, pared w ith the conven ti onal exp ressi on system,the T7RNA Po lym erase2T7p rom o ter coup led system is rela2 tively indep enden t and h igh effective,w h ich no t on ly has the po ten tial i m po rtan t app licati on value in eukaryo tic genetic engineering,bu t its successfu l estab lishm en t also b rings u s a new idea in ex2 p lo ring and founding novel sp ecific eukaryo tic exp ressi on system.
Key W ords: Eukaryo tic exp ressi on system,T7RNA Po lym erase,T7p rom o ter,h igh effec2 tive exp ressi on,genetic engineering
(接第44页)
Som e Proble m s of Ultraf iltra tion
Appl ica tion s for B iolog ica l Pur if ica tion
Abstract In th is paper discu ssed are the p rob lem s in the b i o logical app licati on s of u ltrafil2 trati on,w h ich are no t u sually described in general tex tbook s and m o st of literatu re,and w h ich are p articu larly i m po rtan t in b i o logical separati on.M em b rane quality,m em b rane system and device, p rocessing m ethod of sam p les w ith b i o logical activity,m ode of operati on,selecti on and deter m ina2 ti on of p aram eters are directly analyzed.A new m ethod,i.e.,cen trifugal2u ltrafiltrati on concen tra2 ti on,w h ich is no t comm on ly u sed and know n in Ch ina,is recomm ended.T he sam p les w ith h igh activity are likely to be denatu red w h ile p rocessed w ith a cup2like u ltrafiltrato r,w h ich is no r m ally igno red by m o st experi m en talists.W e exp lain and so lve such p rob lem by selecti on of system and relative facto rs.A reference standard fo r p u rificati on by fracti onati on is p ropo sed.M o reover,w ays to operate and select the operati on system s are also m en ti oned.
【最新资料,Word版，可自由编辑！】 一、价值评估的作用与意义。 本文所指的“价值”，是指可持续经营公司的价值，即公司未来现金流量的现值。而公司价值评估就是对企业持续经营价值进行判断。估计的过程，即对公司未来效益水平进行科学量化的过程。公司价值评估是市场经济和现代企业制度相结合的产物，随着市场经济的发展和企业产权日益商品化，企业价值评估日益受到重视。企业价值评估广泛应用于企业自身生的业绩评估、价值分析和投资分析中。企业价值正在成为衡量一个企业成功与否和整体质量好坏的最全面、最准确的指标。风险投资是推动高新技术产业发展的重要力量，处于创业阶段的高新技术，一旦离开风险投资的风险资金的支持，想进一步发展壮大几乎是不可能的。而处于创业期的高新技术企业，尤其是创业板企业想要获得广大投资者的资金，就要获得他们的认可。广大投资者对高新技术企业的价值判断，一是依靠自身的职业判断，另一个途径就是借助于中介机构的力量，价值评估的作用就体现出来了。 三、当代企业价值评估的方法 价值反映了企业的发展潜力和未来盈利能力。现金流量折现法是价值评估的 基础和核心。但该模型在运用上存在许多局限性，加上估价的着眼点不同，在企业价值评估的实践中，人们并不拘泥于一种方法，而是在不同的环境下，根据评估对象的特点，系统地运用多达十几种的企业价值评估方法。这些方法可以归纳为几个价值评估方法。 （一）帐面价值调整法 评价一个公司，简单直接的方法是根据该公司的资产负债表进行估算：对所有资产和负债的账面价值参照市场进行调整，反映它们的公允价值。这种方法起源于传统的实物资产评估，它的假设是：企业的价值等于所有有形资产和无形资产的公允价值之和，从中减去负债的价值，得到企业净资产的公允价值。对企业的资产负债表进行调整，首先是因为资产和负债均按历史成本列示，随着时间的推移，历史成本无法反映通货膨胀和物价的变动。严格来说，对资产应当提取跌价或减值准备，但这种估计往往流于形式，能真实反映资产的功能性贬值和经济性贬值。在资产升值的情况下，市场价格更与账面价值相去甚远。其次，财务报表是会计政策和会计估计的产物，企业通常会选择对自己有利的会计处理方法，或对报表数据进行粉饰，使数据偏离客观实际。因此，投资者出于评价真实价值、进行投资决策的需要，应对报表数据进行一定程度的修正。调整账面价值，原则上应以资产的公允价值为标准。由于公允价值只有在实际买卖时才能实现，因此可用模拟交易的方法，在同类市场找出与评估资产可比的参照物的价格。这种模拟市场价值的准确度，取决于市场的完善度和资产的通用性。市场的竞争性越强，资产的通用度越高，模拟市场价值越容易确定；反之，则不容易确定。对没有活跃交易市场、可比性差、专用性高的资产，应结合重置成本法计价。如果企业已不能持续经营，评估的价值就是清算价值，不再考虑企业的未来收益。 （二）比较估价法 比较估价法，是在企业的现金流量难以计算时，将目标公司与类似的上市公司进行比较，选用合适的“乘数”来评估目标企业的价值。乘数通常是参照企业的价值与某一指标，如每股收益、现金流量、账面净值等的比率，参照企业的价值可根据其股价确定。运用这种方法，要寻找与目标企业相似的参照企业，通过乘数确定目标企业的市场价值。
真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将
建立以人为本的学生评价机制 摘要：建立促进学生全面发展的评价体系，是当前学生评价改革的重要任务。而对学生的日常评价改革是学生评价改革的关键，对学生全面发展有着举足轻重的作用。把标杆管理的原理应用于学生评价，在学校推行标杆管理和学生的评价机制，不仅有其可行性，而且是学校绩效提升的杠杆。 关键词：以人为本；学生评价；日常评价；标杆管理；全面发展1.问题的提出 学生评价历来是学校、教师和学生家长最关心的问题，尤其是新课程实施以来，学生评价受到所有关心教育发展人士的重视。《基础教育课程改革纲要（试行）》明确提出：”评价不仅要关注学生的学业成绩，而且要发现和发展学生多方面的潜能，了解学生发展中的需求，帮助学生认识自我，建立自信。发挥评价的教育功能，促进学生在原有水平上的发展。”2002年12月，教育部颁发的《关于积极推进中小学评价与考试制度的通知》也明确提出：“中小学评价与考试制度改革的根本目的是为了更好地提高学生的综合素质和教师的教学水平，为学校实施素质教育提供保障，充分发挥评价的促进发展的功能，使评价的过程成为促进教学发展与提高的过程。”可见，以“为了每一位学生的发展”为核心理念的新课程，在学生评价改革方面，强调的是评价的本体性功能，反对以评价的附加性功能取代评价的本体性功能，反对以选拔性评价代替日常性
评价，这就要求教师必须把日常学生评价和选拔性的考试区分开来，使学生评价回归学生的日常生活，发挥其最原始的本真功能。长期以来，在教育实践中，学生评价的选拔性功能被当作了学生评价的主要功能，致使学生评价成了实施素质教育的最大障碍，不但严重影响了学生的健康发展，而且影响了我国教育质量的整体提高。新课程倡导的日常学生评价和选拔性的考试是性质不同的两种评价。日常学生评价是一种发展性评价，它强调的是评价的发展性功能，促进学生发展是其最终目的。它要求学生评价改变以往过分强调甄别与选拔的做法，把评价定位于促进学生的全面发展，在评价主体、评价内容、评价方法、评价工具、评价反馈等方面都要凸显并发挥评价的激励功能、诊断功能和发展功能。这既是新课程学生评价的出发点，也是衡量学生评价改革成败与好坏的标准。学生评价中每一个具体措施的提出与落实，都要服务于这一目标。建立促进学生全面发展的评价体系，是当前学生评价改革的重要任务。而对学生的日常评价改革是学生评价改革的关键，对学生全面发展有着举足轻重的作用。因此，教师必须从理论上认清日常评价在学生评价中的作用，在实践中摸索日常评价的操作措施和实施方法，以推动学生评价改革的深入进行，确保课程改革的成功。 基于这一认识，笔者在多年的学校管理工作中，不断尝试学生的评价机制，从2003年开始，在长乐初中进行农村初中“标杆管理”的研究与应用，同时，大胆改革了学生的评价机制，实施了学生标
原核表达遇到瓶颈怎么 办 TPMK standardization office【 TPMK5AB- TPMK08- TPMK2C- TPMK18】
我想表达遇到的第一个瓶颈估计就是为什么我的外源片段插到载体里面，PCR鉴定没问题，双酶切也OK，可是就是不见表达。一般我们是如何判断没有表达呢？大多都是首先进行SDS-PAGE。在跑胶的时候一定要设对照，比较严谨的电泳对照，应该是：Marker，标准品阳性对照（如果有，且打算做Western的话），以及空白载体（诱导）和重组载体（不诱导）2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。Marker用于判断条带大小，标准品用于判断Western体系包括抗体显色剂和操作的可靠性，以及精确判断大小；空白载体（诱导）负对照有助于判断在非诱导条件下的本底表达；而重组载体（不诱导）负对照则有助于判断诱导的效果以及排除诱导剂对宿主菌潜在的干扰，或者是区分细菌内源和外源表达产物——偷懒可不是好习惯，会影响结果判断。注意，接种表达和接种做感受态都类似，一定要用挑单克隆、加足量抗生素、过夜培养的新鲜菌液转种最好，在筛选压力下生长旺盛的种子液远比经过4℃保存的菌液要好得多，也许是因为保存时间长会导致抗生素失效部分细菌丢失质粒或者其他变化。反正就是一种经验做法。 跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做Western了。银染的灵敏度在0.1～1 ng；有钱还可以用Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western。WesternBlot是蛋白质定性和半定量的最通用的技术，具体细节可参考生物通WesternBlot技术专题，我们有详细介绍的。 在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要开始进行下一步的分析了。首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。有时载体几经多个实验人员的周转，反复插入片断，或者是粘端
信息技术学科教学评价体系 评价是信息技术教学的有机组成部分，对信息技术的学习具有较强的导向作用。应围绕信息技术课程标准规定的培养目标评价教与学，保证信息技术课程目标的达成。应通过评价的合理实施，持续提升信息技术教师的教学水平，激发学生学习、应用信息技术的兴趣，协助学生逐步提升信息素养。 （一）评价原则 1.强调评价对教学的激励、诊断和促动作用，弱化评价的选拔与甄别功能 在信息技术教学过程中，应通过灵活多样的评价方式激励和引导学生学习，促动学生信息素养的全面发展。教师应注意观察学生实际的技术操作过程及活动过程，分析学生的典型信息技术作品，全面考察学生信息技术操作的熟练水准和利用信息技术解决问题的水平。教师在向学生表现评价结果时应多采用评价报告、学习建议等方式，多采用鼓励性的语言，这个方面有利于激发学生的内在学习动机，另一方面也能够协助学生明确自己的不足和努力方向，促动学生进一步的发展。要慎用定量评价，表现评价结果时要尽量避免给学生贴标签或排名次，弱化评价对学生的选拔与甄别功能，减轻评价对学生造成的压力。教师在了解学生的学习和发展状况的同时，也要利用评价结果反思和改善自己的教
学过程，发挥评价与教学的相互促动作用。 2.发挥教师在评价中的主导作用，创造条件实现评价主体的多元化 教师应注意发挥在信息技术评价中的主导作用，同时充分利用学生的评价水平，适时引导学生通过自我反思和自我评价了解自己的优势和不足，以评价促动学习；组织学生展开互评，在互评中相互学习、相互促动，共同提升。 3.评价要注重学生的个别差异，鼓励学生的创造实践 小学生学习和应用信息技术的水平水平、学习风格和发展需求等方面的差异很大，信息技术课程的评价要正视这种个别差异。同时，学生个性特征分化更为明显，实行信息技术创造的欲望也更为强烈，评价时要充分尊重学生的个性和创造性。信息技术课程的评价标准和评价方式的确定和选用，要在保证达到最低教学要求的基础上，允许学生通过不同的方式展示自己。一方面，不同起点学生在已有基础上取得的进步都应该得到认可，使每一个学生都能获得成功的体验；另一方面，要尊重学生在学习和应用信息技术过程中表现出的个性和创造性，对同一信息作品的不同设计思路和不同设计风格、对同一问题的不同技术解决方案等，都应给予恰当的认可与鼓励。 （二）评价内容与评价方式 1.综合使用各种过程性评价方式，全面考察学生信息素养的养成过程 信息技术课在实行过程性评价时，应针对不同评价内容和相对应的课程目标，适当选择和灵活使用评价方式，适当渗透表现
pET 原核表达 pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。 有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码
浅谈对客户价值认识的重要性 内容摘要 客户对于企业来说是利润的来源，是企业竞争的基础，是企业持续发展的重要因素，而对于企业来说，客户的价值可影响到企业的发展规模，发展状况，发展前景等，每一个好的客户价值养成可以为企业带来可观的利润收益，促进企业的不断壮大，可以说企业与客户之间是相辅相成的状态。 关键词：利润来源发展基础价值体现相辅相成 Abstract The customer is the source of profit for the enterprise, is the basis of competition, is an important factor for the sustainable development of enterprises, for enterprises, customer value can be the scale of development, affect the enterprise's development status, development prospects, every good customer value to enterprises that bring considerable profit, promote the continuous growth of enterprises, between enterprises and customers can be said is the complement of the state Keywords: source of profit development of basic value complement each other
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体 标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。
科技人才评价体系 2003年我国实行人才强国战略以来，为了调动人才的积极性，各级政府、行业和单位相继采取了多方位的特殊措施，出台了各种各样的奖励政策和多种形式的评价活动。去年某市组织的政府年度奖励评审，要从申报的600项申请中评选出200项左右的一、二、三等奖，评审过程包括一次书面评审和两轮的会议评审，涉及评审专家及工作人员300余人。 我国目前科技人才评价体系存在着很多问题，主要表现在评价程序不规范，重形式走过场，没有公信力；评价活动泛滥，质量低下。人才是“干”出来的，不是“评”出来的。但是科技是需要评价的，不评价不行，只是评价体系必须要科学合理。我认为，对于基础性研究，要看人才是不是做了实实在在的工作，是不是发现新的真理或新的规律。对于应用性方面人才的评价，要看他研究成果的质量，技术创造的新方法、新成果在现实中有没有用；看在国际上的承认程度，看以后在技术进步上起什么作用。 现在，各类人才“计划”、“工程”、“项目”等，真是名目繁多，但用处寥寥无几。去年，我曾参加了全国政协教科文卫体委员会组织的“科技人才队伍建设”专题调研，发现不少问题，有些单位为了自身荣誉，将多项科技成果堆砌在一人身上，“包装”和“制造”人才，太不正常了。我建议国家要清理各种人才工程、计划，除少数确实发挥了实实在在作用并被广泛认可的以外应坚决制止，并停止设立新的人才计划和工程。 中国科学院文献情报中心在一份报告中指出，上世纪90年代以来，在影响力排名前10％的国际一流期刊上发表的中国论文，每两年以45％的速度增长；国内有些大学每年发表的SCI(科学引文索引)论文数量，甚至超过始终位列美国前五名的名校。不过，我国80％左右的国际论文分布在低被引用区和零被引用区。尽管受关注程度低，但我们科技评价体系依然偏重论文，甚至到了“唯SCI 论”的地步。这一国际普遍认可的学术评价标准正在异化为国内某些人换取学位和职称的捷径。 现在我国对科研成果和人才的评价简单量化，偏重论文，只看重科研成果数量而不注重其质量和科学意义，导致部分科研人员急功近利，还有的为发表论文而交纳“版面费”。这样的论文，大多数没有原创性，毫无价值可言。我觉得，科研人员应该潜心搞研究，淡泊名利，以科学家的良心来从事科学研究。建议国内在有关评比和晋级时把SCI与国内一级刊物结合起来，而且SCI文章必须要有引用，没有引用就不能参评。 因为学科特点和研究方向的不同，评价体系也需要多元化。现在一些年轻人，已经分不清自己努力做实验、作研究，究竟是为了探究科学真理，还是为了发表论文。我认为完善科研评价体系是当务之急，论文不是唯一的评价标准，只是一个重要的参考依据，而且评价时一定要做到公正客观，摒弃“人情”。 对人才做出的成绩怎么肯定？ 背景：目前，我国设立了国家科学技术奖、国家最高科学技术奖、国家自然科学奖、国家技术发明奖、国家科学技术进步奖和中华人民共和国国际科学技术合作奖等奖项。温家宝总理2003年12月20日签署的《国家科学技术奖励条例》规定，国家最高科学技术奖每年授予人数不超过两名，国家自然科学奖、国家技术发明奖、国家科学技术进步奖分为一等奖、二等奖两个等级，每年获奖项目总数从原有的800多项减少到不超过400项。
商业银行全球系统重要性评估指标披露指引 第一章总则 第一条为加强市场约束，规范商业银行全球系统重要性评估指标的信息披露，根据《中华人民共和国银行业监督管理法》、《中华人民共和国商业银行法》和《商业银行信息披露办法》，制定本指引。 第二条本指引适用于在中华人民共和国境内设立的商业银行，包括中资商业银行、外商独资银行和中外合资银行。 第三条下列商业银行应当根据本指引要求披露相关信息： （一）上一年度被巴塞尔委员会认定为全球系统重要性银行的商业银行； （二）上一年年末调整后的表内外资产余额为1.6万亿元人民币以上的商业银行。 第四条全球系统重要性是指商业银行由于在全球金融体系中居于重要地位、承担关键功能，其破产、倒闭可能会对全球金融体系和经济活动造成损害的程度。 全球系统重要性评估指标是指巴塞尔委员会用于评估商业银行全球系统重要性的指标。 第五条本指引规定为商业银行全球系统重要性评估指标信息披露的最低要求，信息披露银行可以自行披露更多信息。 第六条中国银行业监督管理委员会（以下简称银监会）对本指引所规定的商业银行全球系统重要性评估指标的信息披露实施监督管理。 第二章信息披露的内容 第七条信息披露银行应当按照本指引规定，披露调整后的表内外资产余额、金融机构间资产、金融机构间负债、发行证券和其他融资工具、通过支付系统或代理行结算的支付额、托管资产、有价证券承销额、场外衍生产品名义本金、交易类和可供出售证券、第三层次资产、跨境债权和跨境负债等12个指标。 第八条调整后的表内外资产余额是指作为杠杆率分母的调整后的表内资产余额和调整后的表外项目余额之和，按照《商业银行杠杆率管理办法》规定的口径计算。 第九条金融机构间资产是指商业银行与其他金融机构交易形成的资产余额。 第十条金融机构间负债是指商业银行与其他金融机构交易形成的负债余额。 第十一条发行证券和其他融资工具是指商业银行通过金融市场发行的债券、股票和其他融资工具余额。 第十二条通过支付系统或代理行结算的支付额是指商业银行作为支付系统成员，通过国内外大额支付系统或代理行结算的上一年度支付总额。 第十三条托管资产是指商业银行托管的资产余额。 第十四条有价证券承销额是指商业银行上一年度在境内外承销的债券、股票等各类有价证券总额。 第十五条场外衍生产品名义本金是指商业银行持有的场外交易的金融衍
贺兰一小信息技术学科教学评价体系 评价是信息技术教学的有机组成部分，对信息技术的学习具有较强的导向作用。应围绕信息技术课程标准规定的培养目标评价教与学，保证信息技术课程目标的达成。应通过评价的合理实施，不断提高信息技术教师的教学水平，激发学生学习、应用信息技术的兴趣，帮助学生逐步提高信息素养。 （一）评价原则 1.强调评价对教学的激励、诊断和促进作用，弱化评价的选拔与甄别功能 在信息技术教学过程中，应通过灵活多样的评价方式激励和引导学生学习，促进学生信息素养的全面发展。教师应注意观察学生实际的技术操作过程及活动过程，分析学生的典型信息技术作品，全面考察学生信息技术操作的熟练程度和利用信息技术解决问题的能力。教师在向学生呈现评价结果时应多采用评价报告、学习建议等方式，多采用鼓励性的语言，这一方面有利于激发学生的内在学习动机，另一方面也可以帮助学生明确自己的不足和努力方向，促进学生进一步的发展。要慎用定量评价，呈现评价结果时要尽量避免给学生贴标签或排名次，弱化评价对学生的选拔与甄别功能，减轻评价对学生造成的压力。教师在了解学生的学习和发展状况的同时，也要利用评价结果反思和改善自己的教
学过程，发挥评价与教学的相互促进作用。 2.发挥教师在评价中的主导作用，创造条件实现评价主体的多元化 教师应注意发挥在信息技术评价中的主导作用，同时充分利用学生的评价能力，适时引导学生通过自我反思和自我评价了解自己的优势和不足，以评价促进学习；组织学生开展互评，在互评中相互学习、相互促进，共同提高。 3.评价要关注学生的个别差异，鼓励学生的创造实践 小学生学习和应用信息技术的能力水平、学习风格和发展需求等方面的差异很大，信息技术课程的评价要正视这种个别差异。同时，学生个性特征分化更为明显，进行信息技术创造的欲望也更为强烈，评价时要充分尊重学生的个性和创造性。信息技术课程的评价标准和评价方式的确定和选用，要在保证达到最低教学要求的基础上，允许学生通过不同的方式展示自己。一方面，不同起点学生在已有基础上取得的进步都应该得到认可，使每一个学生都能获得成功的体验；另一方面，要尊重学生在学习和应用信息技术过程中表现出的个性和创造性，对同一信息作品的不同设计思路和不同设计风格、对同一问题的不同技术解决方案等，都应给予恰当的认可与鼓励。 （二）评价内容与评价方式 1.综合运用各种过程性评价方式，全面考察学生信息素养的养成过程 信息技术课在进行过程性评价时，应针对不同评价内容和相应的课程目标，适当选择和灵活运用评价方式，适当渗透表现性
如何建立价值评价体系？ 题目一：企业如何建立评估体系？ 替换关键词：评价替换为评估 题目二：企业如何建立价值评估系统？ 替换关键词：体系替换为系统 题目三：价值评价系统的重要性 企业绩效评价体系是指由一系列与绩效评价相关的评价制度、评价指标体系、评价方法、评价标准以及评价机构等形成的有机整体。企业的评价系统大致可以分为以下四个层次：第一、岗位评价系统，主要针对不同岗位之间的评估。例如，企业中一般业务部门的薪酬要高于职能部门，采取的便是这种评价系统。常见分支有岗位参照法、分类法、排列法、评分法和因素比较法。岗位评价技术性强、涉及面广、工作量大，是岗位工资的重要基础，可以更好地体现同工同酬和按劳分配的原则，但是它忽略了同一岗位的不同个体付出努力的大小。 第二、任职评价系统，主要针对岗位胜任的评估。从称职胜任角度出发，对员工能力进行分等分级，以任职资格标准体系规范员工的培养和选拔，建立员工职业发展通道，牵引员工不断学习，同时为晋升、薪酬等人力资源工作提供重要的依据。例如，当业务部人员比较年轻，相对经验不足，而职能部员工经验丰富时，此时采用岗位评估系统进行评价就会存在一些问题，任职评价系统就可以解决这些问题。目前我国有些企业关键岗位的用人决策的依赖直觉与个人经验，缺乏有效的标准和方法，甚至存在“试人”的现象，数据显示国内管理人员招聘成功率不足50%，跳槽和中途离职现象频频发生，导致公司和被招聘员工都遭受了巨大的损失。 第三、业绩评价系统，主要针对同岗位人员的评估。同一岗位上由于个人能力的差异，员工业绩水平也不相同，该系统更侧重对同岗位多劳多得的评价。人类存在比较的心理，如果一个人付出的努力比别人多，获得的报酬却是无差别的，往往很容易产生心理失衡，进而
标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris 应用最多。
质量管理体系评价 (1)质量管理体系过程的评价由于质量管理体系是由许多相互关联和相互作用的过程构成的，所以对各个过程的评价是体系评价的基础。在评价质量管理体系时，应对每一个被评价的过程，提出如下四个基本问题：①过程是否已被识别并确定相互关系?②职责是否已被分配? ③程序是否得到实施和保持?④在实现所要求的结果方面，过程是否有效? 前两个问题，一般可以通过文件审核得到答案，而后两个问题则必须通过现场审核和综合评价才能得到结论。对上述四个问题的综合回答可以确定评价的结果。 (2)质量管理体系审核审核用于评价对质量管理体系要求的符合性和满足质量方针和目标方面的有效性。审查的结果可用于识别改进的机会。 第一方审核用于内部目的，由组织自己或以组织的名义进行，可作为组织自我合格声明的基础。 第二方审核由组织的顾客或由其他人以顾客的名义进行。 第三方审核由外部独立的审核服务组织进行。这类组织通常是经认可的提供符合(如IS09001)要求的认证或注册。 ISO19011提供了审核指南。 (3)质量管理体系评审管理者的一项任务是对质量管理体系关于质量方针和目标的适宜性、充分性、有效性和效率进行定期的、系统的评价。这种评审可包括考虑修改质量方针和目标的需求以响应相关方需求和期望的变化。评审包括确定采取措施的需求。 在各种信息源中，审核报告用于质量管理体系的评审。 (4)自我评定组织的自我评定是一种参照质量管理体系或优秀模式对组织的活动和结果所进行的全面、系统和定期的评审。 使用自我评定方法可提供一种对组织业绩和质量管理体系的成熟程度总的看法，它还能帮助组织识别需要改进的领域并确定优先开展的事项。 [例题]：在GB/T19000--2000标准的"质量管理体系基础"中将由组织的顾客或由其他人以顾客的名义对质量管理体系所进行的审核称为( 第二方 )审核。
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
附件1 商业银行全球系统重要性评估指标定义说明 商业银行全球系统重要性评估各项指标定义如下： 一、调整后的表内外资产余额 调整后的表内外资产余额是指作为杠杆率分母的调整后的表内资产余额和调整后的表外项目余额之和，按照《商业银行杠杆率管理办法》规定的口径计算。 二、金融机构间资产 本指引所称金融机构是指商业银行、农村合作银行、村镇银行、农村信用社、农村资金互助社、贷款公司、资产管理公司、信托公司、企业集团财务公司、金融租赁公司、汽车金融公司、货币经纪公司、消费金融公司、证券公司、基金管理公司、期货公司、证券交易所、保险公司、登记结算类机构和中央交易对手等各类金融机构，不包括多边开发银行、中央银行和政策性银行。 金融机构间资产是指商业银行与其他金融机构交易形成的资产余额。包括： （一）存放同业和拆放同业款项。
（二）对其他金融机构的未提取承诺。 （三）普通债券。 （四）次级债券。 （五）商业票据。 （六）大额可转让存单。 （七）持有的股票，包括普通股和优先股的股本与股本溢价，扣除用于对冲股票空头头寸发生的银行集团负债的公允价值。 （八）与其他金融机构的证券融资交易净正敞口，包括： 1.逆回购融出资金与质押证券公允价值轧抵后的净正敞口。 2.正回购质押证券公允价值与融入资金轧抵后的净正敞口。 3.证券借贷交易借出证券的公允价值与交易对手质押现金的价值或质押证券的公允价值轧抵后的净正敞口。 4.证券借贷交易借入证券所质押现金的价值或质押证券的公允价值与借入证券的公允价值轧抵后的净正敞口。 在计算证券融资交易时，可以根据银监会资本监管规定的合格净额结算方法对证券融资交易的敞口余
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
中国科技评价体系的特点、模式及发展 ―― ←―― → 一、前言 科学技术评价是推动国家科技事业持续健康发展，促进科技资源优化配置，提高科技管理水平的重要手段和保障。合理有效的科技评价体系对于更好地激发科技人员的创新潜力，营造科技创新环境，促进我国科学技术研究开发与国际接轨，推进国家科技创新体系的建立和发展有着重要意义。多年来，我国学者和政府管理部门对科技评价理论方法进行了很多有益的探索和研究。如国家自然科学基金委1999年资助项目“科学研究的综合绩效评价方法研究及应用”（项目编号79970105），国家软科学研究计划1996年项目“我国科技成果评价方法与管理模式研究”（项目编号k96-10-14），国家软科学研究计划2000年指导性计划项目“我国基础研究评价存在的问题及对策研究”（项目编号Z00006），等等。但由于科技工作的多样性，以往我国科技评价标准和方法过于简单化，难以满足不同类型科技工作的特点，因而存在不少矛盾。近年来，我国科技评价制度不健全、评价体系不完善、评价分类不明确、评价方法不规范、评价结果使用不当等问题，已引起了我国科技界的广泛关注。 为了进一步规范科技评价工作，完善科技评价体系，2003年5月15日科技部、教育部、中国科学院、中国工程院和国家自然科学基金委员会联合印发了《关于改进科学技术评价工作的决定》。《决定》针对当前评估工作中存在的问题提出了原则性、指导性和规范性的意见和决定，给科技评价工作指出了明确的导向。随后，为了切实有效地把《决定》精神贯彻落实到科学技术评估工作中，规范科技评价工作，完善科学技术评估体系，2003年9月22日科学技术部印发了《科学技术评价办法》（试行）。《办法》主要明确了评估的目的、原则、分类方法、评价准则及监督机制等，针对各类科学技术活动较为系统地回答了如何评、依据什么评等重要问题。《决定》将用于指导各级科技管理部门制定和完善各类科学技术评估工作的具体管理办法与实施细则。这两个科技评价政策法规的出台，显示出国家在扭转前一段出现的问题的决心。 然而在规范评价活动、净化学术空气、培养优良学风的同时，我们也应该看到，从国家宏观决策角度来看，我国科技评价体系和理论方法尚存在结构性的缺陷，问题之一就在于多准则、多层次的面向公共决策技术评价活动的滞后。科技部部长徐冠华认为：“对科学技术活动开展评价是社会民主化的要求，是政府实现预算和管理透明的必然趋势，客观上促进了对科学技术在社会和经济发展中重要作用的认同。由于评价强调了对研究开发活动的长期效益，因此也有助于将具体科学技术活动与国家目标结合，并有效地服务于国家利益。”随着经济、社会和技术的发展，可持续发展已成为政府科技决策的基点，因此有必要从多个角度、多个方面对技术进行评价，确定该技术的投入、产出以及对社会、环境、伦理道德等方面的