DNA的提取实验
质粒dna的提取是DNA技术中的必备实验技能。
质粒DNA上携带的基因信息可经过基因表达实验后表现出相应的性状。质粒DNA的分离提取包括了培养细胞——收集——分离纯化三大步骤。质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒dna上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
分离质粒DNA有三个步骤：
1、培养细菌使质粒扩增
2、收集和裂解细菌
3、分离和纯化质粒
DNA碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高，适合于大多数的和菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。此法采取酸碱度高达Ph12.6的碱溶液使DNA 发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开;而后者完全变性分，甚至出现断裂。因此，当加入中和液时，溶液Ph值恢复较低的近中性水平，此时，质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体DNA则无法复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。
所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA(cccDNA)：质粒的两条链没有断裂;超螺旋开环DNA(ocDNA)：质粒的一条链断裂;松弛的环状分子线形DNA(lDNA)：质粒的两条链均断裂;线性分子质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图(a)松弛线性的DNA；(b)松弛开环的OC构型；(c)超螺旋的SC构型由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。(a)道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；(b)道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和SC DNA 之间
三、材料、试剂及器具
1、材料
E.coliDH 5α(pUC 19 vector)
2、试剂
1)LB培养基
2)TE缓冲液
3)裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ
4)酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)
5)无水乙醇
6)70%乙醇
7)氨苄青霉素50mg/mL3
3、器具：离心机、离心管、吸嘴
四、操作步骤
以1%比例把E.coliDH5α(含PUC18)接种于含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml)的LB培养基中37℃振摇过夜(12-18h)↓取1.5ml培养物置离心管中↓10000rpm,离心1min，或4000rpm，离心5-10min↓去上清，倒扣干净吸收纸上吸干↓沉淀+100μL溶液Ⅰ↓加或不加入少量溶菌酶粉末;混匀，室温放置10min↓+加200μL溶液Ⅱ(新鲜配置)↓温和颠倒数次，混匀，冰上放置5min↓+150μl溶液Ⅲ→颠倒混匀，冰上放置15min↓离心12000rpm,15min↓上清液+等体积酚：氯仿：异戊醇振匀，12000rpm,离心5min↓小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质↓上清液+2倍体积无水乙醇混匀，室温5min-10min↓12000rpm,5min-15min↓弃上清沉淀+1mL70%乙醇↓12000rpm离心5min-15min↓弃上清;并倒扣离心管使液体流干↓+自然干燥或真空抽干(看不到液滴为宜)↓加50μlTE缓冲液(20μg/mlRNaseA)溶解质粒粗取物↓-20℃保存
六、实验报告检查、保存提取的质粒，要求记录实验现象并说明原因。
七、思考题分析以下试剂的作用原理：溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖5mmol/Ltris HCL (Ph
8.0)10mmol/L EDTA(PH8.0)溶液Ⅱ:0.4mol/L NaOH2% SDS使用前新鲜配制溶液Ⅲ：5mol/L Kac 60 mL冰醋酸11.5 mL水28.5 mLRNase A酶：将粉末溶于10mmol/L tris HCL (Ph7.5)、15mmol/L NACL中，配成10 mg/mL浓度的酶液，于100℃水浴加热15 min，缓慢冷却至室温，-20℃保存氯仿无水乙醇附注：
1.溶液Ⅰ---溶菌液溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中PH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。EDTA的作用：(1)螯合Mg2+ 、Ca2+ 等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时一定的金属离子作辅基)。(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2.溶液Ⅱ--NaOH-SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2mol/L，加抽提液时，该系统的PH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS：SDS 是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3…R┿-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。
3.溶液Ⅲ--3MOL/L NaAc(pH
4.8)溶液NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-Hac的缓冲液。用PH4.8的NaAc溶液是为了反pH12.6的抽提液，调回PH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3MOL/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA，RNA，以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
4.为什么用无水乙醇沉淀DNA?用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会
