大鼠灌注取脑
大鼠灌注取脑
用途：
1.用于常规HE染色，免疫组化分析。
2.冰冻切片可以不做脑组织固定。
3.不可用于western blot和PCR。
4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。
原理：
心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。
必要性：
1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。
2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。
3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。
大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：
流程：
1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)
保存或切片.
具体过程：
大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。
Tips：
1.多聚甲醛的配置：
一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有
500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。
简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。
2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。
3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔注射麻醉动物。
4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌
及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。
5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的有效观察指标。
6.继续用4%多聚甲醛灌流250ml固定。
7.后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。
补充：
还有一种省时省剂的方法。
夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用
100ml以下即可。
灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。
注意事项：
1.多聚甲醛气味刺激，配置时做好自我保护。
2.暴露心脏这一步骤，容易损伤肺、心脏或者肝脏，“夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸”，人工气胸后，肺萎缩，胸腔里的空间增大，提拉剑突后，不容易损伤肺、心及肝脏，出血少。
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备 前言 相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型，都有一个从查文献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程，在模型制作的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦（我们是有这样的感觉）。为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO模型的战友的摸索过程，提高模型制作的成功率，我们愿意将自己的经验与大家分享，相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识，并以其为乐趣，同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。 第一部分线栓模型制备理论及经验 ⒈ 插线法局灶性脑缺血模型简介 八十年代 Koizumi 和 Longa 创用了不开颅的大鼠 MCA 可逆性脑梗塞模型，此后，应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善，已渐趋成熟，目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。该模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。从 ECA 插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到 大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。 1994 年 Huang 等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。1997 年 Hara 等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。国内蒋晓帆等[59]，王芙蓉等[60] 也对该方法进行了研究。线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元 对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。但线栓造模也并非完美无缺，存在着下列不足：①线栓造模过程是非直视下的手术，血流是否完全阻断不能即刻得知。②动物品系、体重、批次会影响结果。动物饲养条件好的单位所繁育的动物，可以使影响程度降低。③操作者的科研训练影响结果。严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果。④血管破裂出血。操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血。轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。
SD大鼠饲养管理 操作规程 2007年11月 目录 一、SD大鼠概述 (2) 二、SD大鼠日常饲养管理 (5) 1、进入屏障及准备工作 (5) 2、饲养环境 (6) 3、饲喂 (6) 4、给水 (7) 5、换窝 (7) 6、离乳 (8) 7、留种交配 (9) 8、动物发放 (10) 9、引种 (11)
10、处死 (13) 11、SD大鼠常见疾病 (13) 12、清洁与消毒 (16) 13、退出屏障 (17) 14、常见突发事件的应急处理 (17) 一、SD大鼠概述 大鼠(Rat)，啮齿目、鼠科、大鼠属，属野生褐色大鼠(Rattus norvegicus) 的变种。原产于亚洲中部及原苏联部分的温暖地区。十八世纪后期开始人工饲养，十九世纪中叶首次用于心理学的研究，二十世纪以后，大鼠应用于生命科学研究的各个领域，尤其在肿瘤学、药理学、内分泌学、营养学方面应用最为广泛。 1925年美国Sprague dawley农场用Wistar培育而成。其特点为头部狭长，尾长接近身长，产仔多，生长发育较Wistar快，抗病能力尤以对呼吸系统疾病的抵抗力强；自发肿瘤率低，对性激素感受性高； 10 周龄雄鼠体重可达300-400g，雌鼠可达180-270g。SD大鼠常用作营养学、内分泌学和毒理学研究。 行为和习性 （1）SD大鼠性情温顺，易于捉取，一般不会主动咬人，但当粗暴操作或营养缺乏时可攻击人或互相撕咬，哺乳母鼠更易产生攻击人的倾向，配种后的成年雄鼠同笼饲养互相撕咬，严重的甚至咬死。
（2）SD大鼠是杂食动物，有随时采饮的习惯。喜食煮熟的动物肉(如兔肉)，甚至是同类的肉。对营养缺乏敏感，特别是维生素和氨基酸缺乏时可出现典型症状。如核黄素缺乏时出现皮炎、脱毛、体质虚弱和生长缓慢，还可引起角膜血管化、白内障、贫血和髓质退化；维生素E缺乏可导致雌大鼠生育能力降低，严重缺乏时雄鼠可终生丧失生殖能力。 （3）SD大鼠的活动多集中在黄昏到清晨这一段时间，白天常在笼内闭目休息，交配多在夜间发生。 （4）SD大鼠对空气中的粉尘、氨气、硫化氢等极为敏感，易引发呼吸道疾病，一般开放饲养的大鼠主要死因为呼吸道疾病。 （5）SD大鼠对各种刺激很敏感，环境条件的微小变化也可引起大鼠的反应，强烈的噪音可导致大鼠恐慌、互相撕咬，带仔母鼠可出现吃仔现象。 （6）SD大鼠具有群居优势，同笼多个饲养比单个饲养的大鼠体重增长快、性情温顺、易于捉取，单个饲养的则胆小易惊、不易捕捉。解剖学特点 （1）大鼠较小鼠个体较大。一般成年大鼠体长不小于18-20cm。尾上覆有短毛和环状角质鳞片，数量多于200片。上下颌各有两个切齿和六个臼齿，共16颗牙齿。齿式为（1003/1003）×2。 （2）大鼠骨骼约105-108块，大鼠的生长发育期长,长骨长期有骨骺存在，不骨化。切齿终生不断生长，大鼠需不断啃咬磨牙以维持其长度恒定，故垫料中应有部分小木块供其啃咬。
第一章皮肤 一、皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成。 二、皮肤腺有皮脂腺、汗腺和乳腺。 1、皮脂腺分布在毛囊周围。口角部、肛门、包皮和乳头周围有特化的皮脂腺。 2、汗腺，大鼠的汗腺只局限于足垫的皮肤。 3、乳腺 数量大鼠的乳腺共有6对，胸部3对，腹部1对，鼠蹊部2对。个别的大鼠有5对或者7对。 大小和形态随大鼠的年龄和性周期有明显的变化。 部位包埋在皮下组织中，由结缔组织隔与胸壁和腹壁松松地相连。 第二章骨 一.脊柱大鼠的脊柱由57 —61块脊椎骨组成，包括颈椎7、胸椎13、腰椎& 荐锥 4、尾锥27 —31块。锥式C7T13L6S4Cy27—31。骨性标志为第二胸椎，其棘突最高，超过其它脊椎骨。 1、颈椎和其它哺乳动物一样，恒为7块，全无肋骨相连，横突上具有横突孔，供锥动脉通过。 2、胸椎13块，椎骨的长度由前向后逐渐增加（由2毫米增加到4毫米），锥管的直径平均为3.3毫米，较颈部的锥管为狭窄。 3、腰椎6块，每块锥体的长度比较一致，约 6 —7毫米。锥管直径由前面的 4 毫米向后逐渐缩小至2毫米。 二、胸骨 共分为6节，最前一节为胸骨柄，第二到第五节称为胸骨体，最后一节为剑突，棒状的剑突后面接一盘状的剑状软骨。胸骨柄长约10毫米。 第三章肌肉系统（省略） 第四章消化系统 消化系统包括消化管及附属消化器官。消化管可分为口腔、食管、胃、小肠和大肠等部。附属消化器官有齿、舌、唾液腺、肝和胰。 第一节消化管
、口腔1、舌全长约30毫米，不具有正中系带，但是有两条侧系带。 一、食管 分为颈、胸、腹三部。成年大鼠食管的颈-胸段长度约75毫米，腹段通过膈的食管裂孔在膈后的长度约15毫米，食管外径约2毫米。 位置：食管主要是沿气管背侧走行，仅在颈部稍偏左侧。 一、胃 位置：横位于腹腔的左前部，其壁面几乎完全为肝的左叶所覆盖。 大小：胃重为体重的0.5% ,属单室胃。 形态：胃小弯朝向背前方，食管在其中部入胃。胃大弯朝向腹后方，其边缘 有双层的口袋状大网膜。贲门部外观呈半透明状，内壁有粘液腺。 三、小肠 1、十二指肠 长度：长约100毫米。 位置：从幽门发出向右后行，再折向前终于右侧。可分为降支（向右后行）、横支（水平部）、升支（向前行），它们构成一个不完全的环，包围着部分胰腺。 颜色：淡红色。 2、空肠 长度：为小肠的最长部分，大约有700—1000毫米。 位置形态：盘旋在腹腔的右方腹侧部。 3、回肠 长度：较短，约有40毫米。 位置形态：以三角形的系膜回盲褶与盲肠的末端相连，向盲肠的开口与结肠的起始部紧密相接。 二、大肠 1、盲肠 长度：是介于小肠与盲肠之间的一个大的盲囊。长约60毫米，直径约10毫米。位置：通常位于腹腔的左后部。盲肠呈锥体形，分为基部、体部和尖端。 2、结肠 长度：长约100毫米。
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。 其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨； 用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线； 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨； 当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管； 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部； 用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部； 去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑； 取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高； 若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠 剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5) 将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。
图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone
图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect
图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect
1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process
图Ⅷ-31左心房与左心室The left atrium and left ventricle 11左心房left atrium 12左心室left ventricle 13肺动脉右支right branch of pulmonary artery 14肺静脉pulmonary vein 15前腔静脉precavalvein 16肺动脉左支left branch of pulmonary art 7tery 17后腔静脉postcaval vein 18心中静脉 middle cardiac vein 19头臂动脉brachiocephalic artery 20主动脉弓aortic arch 21乳头肌papillary muscles 22左颈总动脉left common carotid artery 23左锁骨下动脉left subclavian artery 24右前腔静脉right precaval vein 25心外膜extracardium
图Ⅷ-56前肢内侧面The anterior limb. Medial aspect
图Ⅷ-57后肢内侧面(1)The posterior limb. Medial aspect（1） 1腋神经axillary nerve 2桡神经radial nerve 3头静脉cephalic vein 4正中神经median nerve 5正中动脉median artery 6肌支muscular branch 7尺神经ulnar nerve 8臂动脉brachial artery 9胸长神经long thoracic nerve 10胸外侧动脉external thoracic artery I1颈总动脉common carotid artery 12主动脉弓aorta arch 13左心耳left auricle 14右心耳right auricle 15食管esophagus 16胸主动脉thoracic aorta 17腹壁浅动脉superficial epigastric artery 18腹壁浅静脉superficial epigastric vein 19隐动脉saphenous artery 20隐大静脉great saphenous vein
大、小鼠灌注固定的方法 准备物品： 1、灌注针（灌注用的针可以是临床上的静脉套管针，便于穿刺） 2、医用输液器 3、500ml输液用玻璃瓶 4、血管钳 5、剪刀 6、生理盐水 7、4%多聚甲醛（4℃）,0.1M的PB配制 大鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，此时注意用血管钳钝性分离心包及周围软组织以便充分暴露心脏。左手持镊子捏住心脏，右手持套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉。取出套管针内芯，连接生理盐水，打开输液开关，快速灌注，同时用剪刀在右心耳处剪一小口，待流出的液体无色后（约60ml即可）更换为多聚甲醛。多聚甲醛灌注速度为先快后慢，快速灌注50ml后放慢速度，缓慢滴注维持即可，每只大鼠约需100ml。如果多聚甲醛灌注充分，则动物四肢和全身肌肉会不停抽动。如此灌注约需1小时时间。 充分暴露升主动脉
套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉 1、暴露心脏时要小心，速度要快，但不可损伤心脏及大血管，如果出现血液凝固或大血管损伤，灌流将失败。 2、最好是剖开右心室，但是因为暴露的问题，有误剪到左心室的可能。相对来说，剪开右心耳更为方便。我们就是这样做的。 3、灌流的效果：PBS或NS灌流时，血流丰富的脏器如肝脾肾等的颜色会迅速转为灰白，此为灌流正常。另外，大鼠耳尖，口唇，四肢掌部也会变苍白。 4、PBS或NS灌流需缓慢而持续，防止血液血管内凝固。有条件的话可加点肝素。 5、先主动脉插管，再右心耳放血，这样插管容易些。先剪右心耳的话，心脏会瘪下去的。小鼠灌注固定方法： 采用水合氯醛麻醉后剪开胸腔，动作要快，经左心室插入头皮针连接的20 mL注射器（头皮针磨钝，从与身体纵轴成45°角的方向进针，针尖插入升主动脉内，可以看见，动作要轻柔），同时剪开右心耳，推入20 mL 生理盐水。推完以后迅速换4 ℃多聚甲醛20 mL，灌完以后取材基本就可以了。
大鼠灌注固定取脑 准备物品： 37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500 ml、500 ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤 1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。 2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。 3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。 4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。 5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20 ml/分钟。时,剪开右心耳,使血液排出。观察肝脏逐渐变为白色为止 6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。 7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。 8)保存或切片注意事项： 1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。插入时动作要慢,针尖方向不要偏向右侧,以免刺入右心房,如果感到有阻力,则将针退后、调整方向重新进针,直到进入主动脉,灌注针进入主动脉后可在心脏的上方看到其位置,灌注针进入主动脉的长度最好为3~5毫米,然后用丝线扎紧。切勿将灌注针放在左心室内,这样由于主动脉瓣的关闭,灌注液很难进入主动脉,而是沿着心室的切口流出,致使灌注失败。另外,灌注针插入成功后,一定要用剪刀剪开右心耳而不是右心室,这是灌流液的出口。剪开心尖的位置一定要掌握好,不能偏右使灌注针插入右心室。 2、配4％多聚甲醛PBS缓冲液：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH直至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。 加热至60～65℃固然融解的快，只需要15分钟左右，不过容易挥发，气味难闻，需配置的量比较大的时候是较合适的方法。如果有通风厨的可在通风厨内配置，就基本没有气味散发的问题。在通风较好的地方配置也可以，但配置的时候配溶液的人一定要注意自我防护，味道确实很刺激！。如果不着急，可先配好pbs，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密
大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养 南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月 一、试剂 1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636） 2)DMEM（Invitrogen,11995-065） 3)FBS（Invitroge,10099-141） 4)Neurobasal（Invitrogen,21103-049） 5)B27（Invitrogen,17504-044） 6)GlutaMAX（Invitrogen,35050-061） 7)HBSS,noCalcium,noMagnesium（Invitrogen,14170-112） 8)0.25%Trypsin-EDTA（Invitrogen,25200-056） 9)DPBS（HyClone，SH30028.01B） 10)ddH2O 11)10％水合氯醛 12)75％酒精 二、器械 1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟， WA3050）、显微剪x1 2)200ml小烧杯（盛放胎鼠） 3)200目不锈钢筛 4)细胞计数器（求精） 5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）
6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599） 7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010） 8)3ml移液管（Biologix,30-0138A1） 9)过滤器（Millex-GP,SLGP033RB） 10)注射器：50ml、5ml各1 11)Pipetteandpipettetips 12)冰袋、手套、棉球、棉签
题目：不同药物对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用 目的：观察抑制氧自由基生成药物（5-甲酰尿嘧啶）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 观察钙离子拮抗剂（硝苯地平）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 观察抗脂质过氧化制剂（维生素C或维生素E）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 原理：多数情况下，缺血后再灌注可使组织器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复，患者病情好转康复；但有时缺血后再灌注．不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤。 心缺血再灌注损伤是指心肌缺血后再灌注期间导致的心机细胞损害，其损害程度较心肌缺血本身严重，常表现为心肌细胞收缩功能减弱和心室顺应性改变，出现心律失常，心功能低下等现象。 心肌缺血再灌注损伤与氧自由基产生增多、钙超载、及白细胞的作用有关。 抑制氧自由基生成药（黄嘌呤氧化酶抑制剂——5-甲酰尿嘧啶）具有抑制氧自由基生 成的作用，减少氧自由基生成。钙离子拮抗剂（硝苯地平）可以阻断钙的慢通道，使细胞外钙的内流减少，从而降低胞浆钙离子，可起到减少MIRI的作用。抗脂质过氧化制剂（维生素C或维生素E）可以阻断脂质过氧化可1）抗白细胞粘附;（2）保护内皮功能;（3）抗血小板粘附、聚集及脱颗粒反应。有研究证实外源性维生素E可增加心肌梗死后大鼠血浆、心脏的维生素E含量，改善心功能，并减少大鼠的再灌注心律失常。 实验对象：大鼠4只，120-200g，体格健康雌雄不限。 器材和药品：手术刀，动脉夹4个，棉线，剪子，镊子2把，玻璃分针2个，注射器及针头2个，动脉插管器械，BL-420生物机能实验系统 药品：20%氨基甲酸乙酯0.5ml/g，5-甲酰尿嘧啶注射液，硝苯地平注射液，维生素C或维生素E注射液，肝素。 方法步骤：1、大鼠心再灌注损伤再灌注模型的制备 （1）取大鼠，称重，用20%氨基甲酸乙酯0.5ml/g腹腔注射麻醉，仰卧位固定。 （2）1%肝素0.2ml/100g从尾静脉注射。 （3）前胸，上腹部剪毛，沿肋缘下剪开腹前壁皮肤皮下筋膜，肌肉，纵向剪开胸前壁和横向剪开胸前壁暴露心脏。 （4）经主动脉插管 （5）找到左冠状动脉用动脉夹夹闭1分钟。打开动脉夹，血液重新供应，用BL-420实验技能系统记录，观察心律心室内压等的改变。
第一部分 线栓模型制作 1、实验器材（从左到右）： 第一行：干棉球、酒精棉球、10％水合氯醛＋注射器、碘伏＋棉签 第二行：三种不同粗细的鱼线（鱼线最好在2.0、2.5mm处各用记号笔作好标记，便于观察进入距离）、弯盘内为手术器材 第三行：记号笔、自制拉钩（皮筋+曲别针＋大头针） 2、麻醉： 可用饮料瓶自制捕鼠器（适用于不敢手抓大鼠的），用于打麻药，根据大鼠的重量选择不同粗细的饮料瓶（太粗了大鼠可在瓶中回头）。 效果图
3、麻倒后绑在手术台上。 4、剪去颈前的鼠毛，碘伏消毒。 5、沿经部正中切开皮肤。 说明：切开皮肤前最好将结扎动脉的线事先剪好（后面会用到）。
6、钝性分离皮下组织。 如图：大鼠腹侧可见事先剪好的结扎线。 7、分离到气管前肌后，沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离，见到颈动脉鞘后可上拉钩。
8、分离动脉鞘。 如图：分离好后见光滑的颈总动脉。 9、分离出颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉，注意中间那根线不要系紧，用来插鱼线时防止出血的。
10、夹闭颈内动脉，用眼科剪将颈总动脉剪一小口。 11、插入鱼线，鱼线进入颈内动脉后按图中注释方法插（成功率在90%以上）。 说明： （1）这一步鱼线选择是关键，根据大鼠重量（作的多了后根据动脉粗细就可选择了）选鱼线。我们的经验是：250g以
下的选0.26mm的线，250-300g的选0.26mm蘸腊的或0.28的都可以。 （2）如果遇到鱼线怎么也查不进去的情况，可让大鼠休息一会，换细点的鱼线再试，这种情况不一定都是进到翼腭动脉了，我曾解剖过4例这种情况的大鼠，有三例都是在如颅的地方卡住了，可惜我们手里没有0.24mm的鱼线。 （3）通过实践，我们认为结扎或夹闭翼腭动脉没有必要，按我们的方法，熟练的话，从切开到缝合完毕也就是15分钟，算上准备工作（如麻醉、消毒等）半小时也可以搞定了，这样一上午两人作10只大鼠不成问题。 （4）我们体会最好用蘸腊的鱼线作模型，好处是进线深度控制的好，不容易出现蛛网膜下腔出血。我们曾试过0.26mm 的鱼线（不带腊）在250g以下的大鼠进入深度足有2.5cm 12、成功后结扎中间那根线，可见第一个标记距动脉分叉约2mm。 13、缝合。
大鼠和小鼠解剖图谱
图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone
图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect
图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect
1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process
小鼠全脑高分辨率图谱 据华中科技大学报道美国当地时间11月5日，第330期《科学》（Science）刊发了题为“显微光学切片层析成像获取小鼠全脑高分辨率图谱”的论文。该论文由华中科技大学武汉光电国家实验室（筹）生物医学光子研究中心骆清铭教授带领的科研组在校完成。 该论文由武汉光电国家实验室（筹）生物医学光子学研究中心的李安安、龚辉、张斌、王青蒂、严程、吴景鹏、刘谦、曾绍群、骆清铭组成的科研组完成。其中，骆清铭教授为责任作者，李安安、龚辉、张斌为共同第一作者。 据介绍，2002年3月，骆清铭就开始带领其科研组，研制显微光学切片层析成像系统，以获取小鼠全脑神经元连接信息。2006年，李安安等人加入研究团队。经过八年的潜心研发，科研组建立了可对数厘米大小样本进行亚微米水平精细结构三维成像的方法和技术，发明并研制了一台显微光学切片层析成像系统。 科研组使用研制的系统，对制备好的鼠脑为样本，全自动连续242小时进行了数据采集，共获得15380层像素分辨率为0.3×0.3微米的冠状断面图像。同时，科研组利用高定位精度的三维移动平台，及在切片中采用对先采取到的信息进行验证分析的方法，对图像准确定位和预处理，实现了突起水平的小鼠全脑结构成像，获得了一套来自同一只老鼠的全脑组织切片图谱。这种介观水平的小鼠全脑神经解剖图谱，为数字化鼠脑结构和脑功能仿真研究提供了重要的基础性实验数据参考。 审稿人评价说，此篇论文内容新颖，会引起从事连接领域研究人员的高度兴趣，论文以方法为主要中心，同时描述了鼠脑高尔基结构三维数据集，是目前最大的也是分辨率最高的鼠脑突起结构数据集。 显微光学切片层析成像系统有望用于构建不同脑疾病鼠全脑的图片，及鼠全脑内血管微循环的精细结构网。结合荧光鼠脑样本技术的进展，还可以高分辨地获得鼠脑功能连接图谱。此外，显微光学切片层析系统可以推广应用到对其他数厘米大小的昆虫、动物的胚胎、局部器官、植物、甚至某些材料等进行高分辨率三维结构成像。 Science DOI: 10.1126/science.1191776 Micro-Optical Sectioning Tomography to Obtain a High-Resolution Atlas of the Mouse Brain Anan Li,* Hui Gong,* Bin Zhang,* Qingdi Wang, Cheng Yan, Jingpeng Wu, Qian Liu, Shaoqun Zeng, Qingming Luo The neuroanatomical architecture is considered to be the basis for understanding brain functions and dysfunctions. However, existing imaging tools have limitations for brainwide mapping of neural circuits at a mesoscale level. We developed a Micro-Optical Sectioning Tomography (MOST) system that can provide micron tomography of a centimeter-sized whole mouse brain. Using MOST, we obtained a 3D structural dataset of a Golgi-stained whole mouse brain at the neurite level. The morphology and spatial locations of neurons and traces of neurites can be clearly distinguished. We found that neighboring Purkinje cells are sticking to each other.
大鼠系统解剖简述 第一章皮肤 一、皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成。 二、皮肤腺有皮脂腺、汗腺和乳腺。 1、皮脂腺分布在毛囊周围。口角部、肛门、包皮和乳头周围有特化的皮脂腺。 ２、汗腺,大鼠的汗腺只局限于足垫的皮肤。 3、乳腺 数量大鼠的乳腺共有6对，胸部3对，腹部1对,鼠蹊部2对。个别的大鼠有5对或者7对. 大小和形态随大鼠的年龄和性周期有明显的变化。 部位包埋在皮下组织中,由结缔组织隔与胸壁和腹壁松松地相连。 第二章骨 一。脊柱大鼠的脊柱由57-６1块脊椎骨组成,包括颈椎7、胸椎1３、腰椎6、荐锥４、尾锥2７—３1块。锥式C7T13L6Ｓ4Cy27－31.骨性标志为第二胸椎，其棘突最高，超过其它脊椎骨。 1、颈椎和其它哺乳动物一样，恒为7块,全无
肋骨相连,横突上具有横突孔，供锥动脉通过。 2、胸椎１3块，椎骨的长度由前向后逐渐增加 （由2毫米增加到4毫米）,锥管的直径平均为 3。3毫米，较颈部的锥管为狭窄。 ３、腰椎 6块,每块锥体的长度比较一致,约6-7 毫米。锥管直径由前面的４毫米向后逐渐缩小至2 毫米。 二、胸骨 共分为6节,最前一节为胸骨柄，第二到第五 节称为胸骨体,最后一节为剑突，棒状的剑突后面 接一盘状的剑状软骨。胸骨柄长约10毫米。 第三章肌肉系统(省略) 第四章消化系统 消化系统包括消化管及附属消化器官。消化管可 分为口腔、食管、胃、小肠和大肠等部。附属消 化器官有齿、舌、唾液腺、肝和胰。 第一节消化管 一、口腔 1、舌全长约3０毫米，不具有正中系带，但是有两条侧系带。 一、食管 分为颈、胸、腹三部。成年大鼠食管的颈-胸段
长度约75毫米，腹段通过膈的食管裂孔在膈后的长度约15毫米,食管外径约2毫米. 位置：食管主要是沿气管背侧走行，仅在颈部稍偏左侧。 一、胃 位置: 横位于腹腔的左前部，其壁面几乎完全为肝的左叶所覆盖。 大小：胃重为体重的０.5％，属单室胃。 形态：胃小弯朝向背前方，食管在其中部入胃.胃大弯朝向腹后方，其边缘有双层的口袋状大网膜.贲门部外观呈半透明状，内壁有粘液腺. 三、小肠 1、十二指肠 长度：长约100毫米. 位置：从幽门发出向右后行，再折向前终于右侧.可分为降支（向右后行）、横支(水平部）、升支（向前行)，它们构成一个不完全的环，包围着部分胰腺。 颜色：淡红色。 2、空肠 长度：为小肠的最长部分，大约有７0０－1000毫米。
万方数据
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线栓法大鼠脑缺血再灌注模型改良与评价 作者：吴远华， 朱广旗， 胡蓉， 仲秀艳， 苏红梅， 欧阳泠星， 吴帮启， 舒遵华， 王强 作者单位：吴远华,朱广旗,胡蓉,仲秀艳(贵阳中医学院第一附属医院神经内科,贵阳,550002)， 苏红梅(山东临沂市人民医院中医科,临沂,276000)， 欧阳泠星(广东清远市人民医院中医科,清远 ,511500)， 吴帮启(天津中医药大学第一附属医院针灸科,天津,300193)， 舒遵华(长春中 医药大学附属医院,长春,130021)， 王强(湖北襄樊市中医院,襄樊,441000) 刊名： 中国实用神经疾病杂志 英文刊名：CHINESE JOURNAL OF PRACTICAL NERVOUS DISEASES 年，卷(期)：2010,13(18) 参考文献(11条) 1.Garcia JH A reliable method to occlusion a middle cerebral artery in wistar rats 1993(09) 2.Zea Longa E;Weinsten PR;Carlson S Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats 1989 3.Koizu mi J;Yoshida Y;Nakazawa T Experimental studies of ischemic brain edema:A new experimental model of cerebral embolis m in rats in which recirculation can be induced in the ische mic area[外文期刊] 1986 4.刘亢丁实验性局灶性脑缺皿再灌注动物模型的改进及评价 1997(02) 5.关云谦;孙明;徐超大鼠颈内动脉线栓法制备局灶性脑缺血模型及影响因素[期刊论文]-国外医学(脑血管疾病分册) 2001(03) 6.Belayev L;Alonso OF;Busto R Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture.Neurological and pathological evaluation of an improved model 1996(09) 7.Memezawa H;Minamisawa H;Smith ML Ischemic penumbra in a model of reversible middle cerebral artery occlusion in the rat 1992(01) 8.李小凤;孙圣刚;童萼塘大鼠可逆性局灶性脑缺血模型复制方法的改进[期刊论文]-华中医学杂志 2000(04) 9.何学令插线法制作大鼠局灶性脑缺血再灌流模型方法的改进[期刊论文]-四川动物 2003(03) 10.王春霞;刘春风;包仕尧大鼠局灶脑缺血再灌注模型改良后的实验研究[期刊论文]-苏州医学院学报 1999(02) 11.Holland JP;Sydserff SGC;Taylor WAS Rat models of middle cerebral artery ischemia 1993(09) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/f95610427.html,/Periodical_hnsysjjbzz201018002.aspx
线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究 马贤德1孙宏伟1 柴纪严1 赵金茹1 （1 辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110032；） 摘要①目的建立一种比较系统，操作简单，成功率高的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型，达到只要读者根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型的目的。 ②方法成年健康雄性 SD大鼠40只，参照Longa法并适当改进建立MCAO模型20只，假手术组20只。本文将详细叙述手术过程以及再灌注时间点的合理选择。最后利用行为学测试、四氮唑(TTC)染色对模型成功与否进行判定。③结论线栓法是一种操作简单的制备MCAO 再灌注动物模型的方法，并且此方法的再灌注效果较为明显。 关键词动物模型；脑缺血；再灌注；线栓法 Establishment a model of rat ischemia-reperfusion injury with intraluminal suture Ma Xian-de1 Sun Hong-wei1 Chai Ji-yan1 Zhao Jin-ru1 (1.Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang, 110032) Abstract: Objective To establish a model of rat ischemia-reperfusion injury, in terms of the model, the operation will be simple, and the achievement ratio will be high. Methods: 40 Male Sprague-Dawley ( SD ) rats were separated into two groups randomly: 20 were model of rat ischemia-reperfusion injury based on Longa method, and the other 20 were sham-operated group. The process of the operation and the selection of different time point following ischemic-reperfusion were discussed in the paper. What’s more , the model was appraised by behavioral test and Triphenyl Tetrazolium Choloride（TTC）Staining. Conclusion: The operation of intraluminal suture method is very simple for the establishment of model of rat ischemia-reperfusion, what’s more, the effect of reperfusion is very obvious. Key words: Animal Model, ischemia, reperfusion, intraluminal suture 脑缺血再灌注动物模型是研究缺血性脑血管病的一条重要途径，因为脑缺血再灌注动物模型具有很好的重复性并能最大程度模拟人类缺血性卒中的发生。早在1986年，日本学者Koizumi发明了线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型。1995年，我国也出现了相关的报道。目前人们比较公认的是Longa等建立的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型。国内一些学者对此方法又进行了改进，但仍存在一些问题，例如：手术操作过程复杂，实验动物死亡率较高，而模型成功率较低，并且在所发表的文章中普遍存在一个缺点，就是对该模型的制作过程描述得过于简单，读者往往不能按照此类文献完成模型的制备工作。本文旨在前人研究的基础上，建立一种操作简单，成功率高的 MCAO再灌注模型，并将此方法图文并茂的展现给读者，使读者只要根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型。 1 材料与方法 1.1 实验材料、动物及分组健康雄性SD大鼠40只，体重280-320g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。随机分为模型组和假手术组，每组20只。四氮唑红(TTC)染料，由沈阳市博尔美试剂公司提供。 1.2 栓塞线的制备栓塞线采用 2.5号钓鱼线，直径0.25-0.28mm。将其剪成4cm长，一端用细砂纸打磨成半球形（需在显微镜下筛选），再用记号笔分别在距打磨端0.6cm处、1.8cm