ACTA MEDICA LITUANICA. 2012. Vol. 19. No. 2. P . 75–79
? Lietuvos moksl? akademija, 2012
Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts
Gabrielis Kundrotas 1, 2
1 Biobank, Institute of Oncology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania
2
Department of Botany and Genetics, Faculty of Natural Sciences, Vilnius University, Vilnius, Lithuania
Human mesenchymal stem cells (MSCs) are widely used for treatment of various diseases. Clinical applications require large quantities of MSCs, therefore these cells must be expanded in the culture system. It is believed that contamination of MSC cultures with fibroblasts may lead to the de-crease of the stem cell differentiation potential. Moreover, such stem cell preparations are potentially unsafe to use for clinical applications since a few fibroblasts can become tumorigenic. Therefore, there is a need to separate MSCs from fibroblasts. However, studies show that MSCs and fibroblasts have much in common. These two types of cells share such properties as identical spindle-like morphology, plastic adherence and the same expression of most surface antigens. The aim of this review ar-ticle is to analyze the literature on the similarities and differences between the MSCs and fibroblasts, particularly in the expression of cell surface markers in order to determine which could be used for quick separat-ing of MSCs from fibroblasts. Interestingly, the results of recent studies suggest that the use of CD10, CD26, CD106, CD146 and ITGA11 could be helpful for the discrimination of MSCs from fibroblasts. Identification and elimination of fibroblasts from MSC cultures could improve the MSC yield and differentiation potential and also prevent possible tumor forma-tion after MSC transplantation.
Key words: mesenchymal stem cells, fibroblasts, surface markers, senes-cence, tumorigenicity
Correspondence to: Gabrielis Kundrotas, Institute of Oncology, Vilnius University, Santari?ki? 1, LT-08660 Vilnius, Lithuania. E-mail: gabrielis.kundrotas@vuoi.lt
INTRODUCTION
Human mesenchymal stem cells (MSCs) due to their regenerative and immunomodulatory prop-erties are widely used for the treatment of bone and
cartilage damage, cardiovascular, gastrointestinal, autoimmune, neurodegenerative diseases and can-cer (1). It is shown that the use of MSCs in therapy is safe and can be effective (2). In 2006, the Inter-national Society for Cellular Therapy (ISCT) pro-posed the minimal criteria to define human MSCs. First, MSCs must be plastic-adherent when main-tained in the standard culture conditions. Second,
76Gabrielis Kundrotas
MSCs must express CD105, CD73 and CD90, and lack expression of CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79a or CD19 and HLA-DR surface molecules. Third, MSCs must differentiate into osteoblasts, adi p ocytes and chondroblasts in vitro (3). Fibro-blasts are terminally differentiated stromal cells (4) that provide mechanical strength to tissues by producing extracellular matrix and play a critical role during tissue development, differentiation and repair in many organs (5).
It is believed that contamination of MSC cul-tures with fibroblasts may lead to the decrease of the stem cell differentiation potential because fib-roblasts undergo senescence and eventually die. Moreover, such stem cell preparations are poten-tially unsafe to use for clinical applications since a few fibroblasts survive the crisis of senescence and can become tumorigenic (6). Therefore, there is a need to separate MSCs from fibroblasts. Although MSCs and fibroblasts have been well studied, dif-ferences between these two cell types are not fully understood (7). MSCs and fibroblasts share much in common and the current definition suggested by the ISCT is thus incapable of separating MSCs from fibroblasts (8). The aim of this review article is to analyze the literature on the similarities and differences between the MSCs and fibroblasts, par-ticularly in the expression of cell surface markers in order to determine which could be used for quick separating of MSCs from fibroblasts. Similarities between mesenchymal stem cells and fibroblasts
Mesenchymal stem cells (MSCs) and fibroblasts exhibit a similar spindle-like morphology. In ad-dition to this, both types of cells adhere to plastic (7). Flow cytometry is a rapid method for sepa-ration of complex cell populations (9). However, MSCs and fibroblasts express the same surface markers. Alt E and colleagues (7) found that the expression of human adipose tissue-derived MSC surface markers CD44, CD90, CD105 was un-specific for these stem cells. Pure human embry-onic lung fibroblasts were also positive for these markers. Both hematopoietic cell markers (CD14, CD45) and the endothelial cell marker (CD31) were absent in MSCs and fibroblasts. Halfon and colleagues (10) reported coincidental results. It was shown that human bone marrow MSC (BM-MSC) surface markers CD9, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166 were also expressed on human dermal fibroblasts (10). Lorenz K and colleagues (11) showed similar expression pat-terns for CD14(–), CD29(+), CD31(–), CD34(–), CD44(+), CD45(–), CD71(+), CD73(+), CD90(+), CD105(+), CD133(–) and CD166(+) in human adipose tissue-derived stem cells and human der-mal skin-derived fibroblasts. Cappellesso-Fleury S and colleagues (4) compared the expression of 25 surface markers of human BM-MSCs and human dermal fibroblasts. They found the similar expres-sion patterns for 22 surface markers CD13(+), CD14(–), CD16(–), CD11a(–), CD33(–), CD34(–), CD43(–), CD45(–), CD49a(+), CD49b(+), CD54(+), CD86(–), CD90(+), CD105(+), CD117(–), CD146(+), CD164(+), CD166(+), CD138(variable), CD184(–), CD85k(–) and HLA-DR(–) in both types of cells.
Differences between mesenchymal stem cells and fibroblasts
Despite the fact that in the studies reviewed in this article the majority of the investigated cell surface markers were nonspecific, CD106, CD146 and ITGA11 have been identified as MSC-spe-cific surface markers and CD10, CD26 as fibrob-last-specific surface markers (10). ITGA11 is a member of integrins that binds to collagen and is involved in cell attachment, cell migration and collagen reorganization on mesenchymal non-muscle cells (12). Halfon S and colleagues (10) showed that only 16.7% of fibroblasts expressed ITGA11 on their surface compared with MSCs of early (51.4%) and late (28.6%) passages. CD106 (also known as vascular cell adhesion molecule-1 VCAM-1) is a member of the Ig superfamily which mediates leukocyte-endothelial cell adhe-sion and signal transduction during inflammation (13, 14). It was shown that CD106 protein was ex-pressed only on MSCs but not on fibroblasts (10). CD146 (also known as melanoma cell adhesion molecule MCAM) is important for endothelial cell migration and angiogenesis (15). It was shown that only 4.83% of fibroblasts were CD146 posi-tive compared with MSCs of early (91.7%) and late (79.8%) passages (10). Cappellesso-Fleury S and colleagues (4) reported different expression levels of CD10, CD106 and CD26 in comparison to 22 other markers. CD10 is a cell surface en-dopeptidase enzyme with neutral endopeptidase
77 MSCs vs. FBs
activity and the ability to degrade a variety of bio-logically active compounds (16). CD26 is a cell surface glycoprotein known as dipeptidyl pepti-dase (DPP) IV and is involved in T lymphocyte activation (17). All fibroblasts were strongly posi-tive for CD26 and CD10 whereas less than 35% of BM-MSCs expressed CD10 (range: 16–35%) and CD26 expression was variable (range 40–78%). By contrast, more than 70% of BM-MSCs expressed CD106 whereas all fibroblasts were negative (4). All studies of the MSC and fibroblast surface marker expression reviewed in this article are summarized in Table.
Other important specific features of MSCs in which these cells differ from fibroblasts are the co-lony-forming capacity and differentiation potential (7). Actually, the results of investigations of the fi-broblast differentiation potential are controversial. Some authors state that fibroblasts do not differen-tiate into other types of cells (18). While the others show that fibroblasts do have the differentiation potential and even are potent immunoregulatory cells and functionally equivalent to mesenchymal stem cells (19). However, lately it has been sup-posed that such reported effects might be attribut-able to a great extent to the stem cell content within fibroblast preparations (7).
The need for separation of mesenchymal stem cells from fibroblasts
Clinical applications require large quantities of mesenchymal stem cells (MSCs). Expansion of cells in cultures is an attractive strategy because it makes it possible to administer more stem / pro-genitor cells than the patient can generate on his or her own. However, the differentiation potential of MSCs at later passages is often low. This phenome-non could be explained by contamination of MSC cultures with fibroblasts. It has been known for a long time that if fibroblasts from mouse embryos are cultured for prolonged periods, they undergo senescence followed by a “crisis” phase in which many of the cells die. The few cells that survive the “crisis” first become immortal in the culture and then, after further expansion, can become tu-morigenic (6). Identification and elimination of fibroblasts from MSC cultures could improve the MSC yield and differentiation potential and also prevent tumor formation after MSC transplanta-tion (10)https://www.doczj.com/doc/f87566997.html,parison of mesenchymal stem cell (MSC)
and fibroblast surface marker expression
CD9++(10)
CD10±+(4)
CD13++(4)
CD26Vari-
able+(4)
CD29++(11), (10)
CD44++(7), (11),
(10)
CD49a++(4)
CD49b++(4)
CD54++(4)
CD71++(11)
CD73++(7), (11),
(10)
CD90++(4), (11),
(10)
CD105++(4), (7),
(11), (10) CD106+–(4), (10)
CD138Vari-
able
Vari-
able(4)
CD146+±(4), (10) CD164++(4)
CD166++(4), (11),
(10) ITGA11+–(10)
CD11a––(4)
CD14
––(7), (11),
(4)
CD16––(4)
CD31––(7), (11) CD33––(4)
CD34––(4), (11) CD43––(4)
CD45
––(4), (7),
(11), (10) CD86––(4)
CD117––(4)
CD133––(11)
CD184––(4)
CD85k––(4)
HLA-DR––(4) Note: +: expression; –: no or low expression.
78Gabrielis Kundrotas
CONCLUSIONS
It is believed that the contamination of mesenchy-mal stem cell (MSC) cultures with fibroblasts can be unsafe. However, MSCs and fibroblasts share much in common and the current definition of MSCs suggested in 2006 by the International So-ciety for Cellular Therapy is thus not capable of al-lowing us to discriminate between stem cells and fibroblasts any longer. Even then there were some thoughts that these criteria would probably require modification as new knowledge unfolded and that novel surface markers that might be identified in the future could lead to modifications of these cri-teria. The results of recent studies suggest that the use of CD10, CD26, CD106, CD146 and ITGA11 could be helpful for the discrimination of human bone marrow MSCs from human dermal fibro-blasts. However, there is a need to confirm these surface markers by investigating their expression on MSCs and fibroblasts isolated from other hu-man tissues. Eventually, such markers could be used for the quality control of MSC cultures after expansion, cryopreservation, gene transfection and other manipulations.
Received 29 March 2012
Accepted 18 June 2012 References
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MEZENCHIMINES KAMIENINES L?STELES NUO FIBROBLAST? ATSKIRIANTYS
PAVIR?IAUS ?YMENYS
Santrauka
?mogaus mezenchimin?s kamienin?s l?stel?s (MKL) pla?iai naudojamos ?vairioms ligoms gydyti. Klinikin?je praktikoje reikalingi dideli MKL kiekiai, tod?l ?ios l?ste-l?s turi būti padaugintos kultūrose. Manoma, kad MKL kultūrose esantys fibroblastai yra susij? su silpn?jan?iu MKL diferenciacijos potencialu. Tokius kamienini? l?s-teli? preparatus pavojinga naudoti terapijoje, nes dalis fibroblast? gali supiktyb?ti, tod?l fibroblastus i? MKL kultūr? reikia pa?alinti. Mokslini? tyrim? rezultatai rodo, kad MKL ir fibroblastai yra labai pana?ūs. ?ioms abiej? tip? l?stel?ms būdinga identi?ka verpst?s formos morfologija, adhezija prie plastikini? pavir?i? ir pana?i daugumos pavir?iaus ?ymen? rai?ka. ?io straipsnio tiks-las – ap?velgti literatūr? apie MKL ir fibroblast? pana?u-mus ir skirtumus, daugiausia d?mesio skiriant tyrimams, susijusiems su l?steli? pavir?iaus ?ymen?, pagal kuriuos būt? galima greitai atskirti MKL nuo fibroblast?, rai?ka. Fibroblast? atpa?inimas ir pa?alinimas i? MKL kultūr? tur?t? lemti didesnius auginam? MKL kiekius, stipres-n? ?i? kamienini? l?steli? diferenciacijos potencial? ir pad?t? i?vengti galimo navik? formavimosi po MKL transplantacijos. Nauj? tyrim? rezultatai rodo, kad l?s-teli? pavir?iaus ?ymenys CD10, CD26, CD106, CD146 ir ITGA11 gali būti naudingi siekiant atskirti MKL nuo fibroblast?.
Rakta?od?iai:mezenchimin?s kamienin?s l?stel?s, fibroblastai, pavir?iaus ?ymenys, sen?jimas, navik? for-mavimasis
间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多
间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞调控因子的制约。 （1）胞蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。
小鼠间充质干细胞 一、细胞复苏和接种 1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。 2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。 3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。 4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。 5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。 6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。 7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。 8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。 9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。 10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 二、细胞换液和培养 注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。 1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。 2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。 3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。 三、消化细胞 1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，
用前按1：1混合。 将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。 2．具体操作如下： （1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。 （2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。 （3）25℃消化2分钟，在显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部分细胞脱落。（4）向每个培养瓶中加3-5 ml 含10% FBS的基础培养液中和胰酶的消化作用。 （5）用移液管轻轻吹打培养瓶表面使细胞完全脱落后，吸至15 ml无菌离心管内。 （6）20℃，1 500 rpm 离心5分钟，弃上清。 （7）加入一定量的完全培养液，调整细胞数量后，抽样加入胎盘蓝计数，得到细胞数和活性后，按细胞数传代或冻存。 四、细胞传代 1．消化细胞（详见第三步）。 2．按10000-15000个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。 3．每个培养瓶中加完全培养液3-5ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 五、小鼠骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增 断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15％FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。当细胞生长融合达80%-90% 时，用1:1 的0.25% 胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.doczj.com/doc/f87566997.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.doczj.com/doc/f87566997.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
小鼠骨髓间充质干细胞培养 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 实验准备： 1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。 2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器 操作步骤 1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养 取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5?2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每两天换液1次，并观察细胞形态。待细胞长至80%-85%时传代（1传2） 2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速。 采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。 分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。
间充质干细胞移植治疗系统系性硬皮病 对一名安省的硬皮病（scleroderma）的患者来说，一个实验性的干细胞治疗方式为其健康状况带来180度的转变。安省圣托马斯（St. Thomas）的49岁居民慕斯卡特（Dan Muscat，图）于2014年患上系统性硬皮病，由于他皮肤胶原增生，导致他全身皮肤变硬变紧。作为一名珠宝商，他的工作也变得困难而痛苦。 他说：我的手卷成一团并且僵硬，我的脸上和脖子上的皮肤都变硬，我无法转动我的脖子，甚至不能转动身躯。步行超过20步几乎变得不可能。」他还失去了开车的能力，因为他的膝盖不能弯曲，无法踩到刹车或者油门。 之前没有任何治疗方法可以阻止这一疾病的发展。他的医生认为他只有几个月的活命时间。导致这种自身免疫性疾病原因不清楚，而疾病最终会袭击肺部和其他内脏。 慕斯卡特开始研究在加拿大、美国和欧洲进行的干细胞治疗测试。他通过加拿大干细胞基金会（Canadian Stem Cell Foundation）找到了艾金斯医生（Dr. Harry Atkins），艾金斯是渥太华医院（Ottawa Hospital）的干细胞治疗专家，他愿意为慕斯卡特治疗。 艾金斯表示，对于合适的病人来说，这一治疗方法确实对改善他们的生活质量有重要影
响。一旦免疫系统能够正常运作并且停止损伤皮肤，皮肤就会自愈。为硬皮病做干细胞移植在加拿大还是很新的事物。其他国家特别是在欧洲对此作出很多研究，而效果令人鼓舞。艾金斯医生曾经为其他自身免疫性疾病做过干细胞移植，例如多发性硬化病、僵硬人综合症、重症肌无力等。 慕斯卡特是加拿大首个运用在美国和欧洲得到测试的治疗方法的病例。该治疗方法从去年6月开始，医生们从慕斯卡特身上获取干细胞。然后使用强效的化疗药物，杀死导致他出现硬皮病的失效免疫系统。经过淨化的干细胞重新植入他身体内，目标是重新启动他的免疫系统，以便能够停止他的疾病。 慕斯卡特说，自从接受治疗以来，身体一天天好起来。他发现从6月以来，他的动作有所改善，紧绷情况已经消失。他逐渐可以恢复使用自己双手，现在又可以开始驾驶他心爱的赛车。 加拿大干细胞基金会的总裁兼首席执行官普莱斯（James Price）表示，对那些目前没有其他治疗方法的多种疾病患者来说，干细胞治疗能够给他们带来希望。普莱斯说，基金会的目标是能够在10年内令新的干细胞治疗方法得到运用。 该基金会指出，有证据显示，干细胞移植可以令其他严重自身免疫性疾病例如多发性硬化病、狼疮、类风湿关节炎等疾病的情况得到持续缓解。干细胞疗法现在也正在被研究用于治疗肌萎缩性侧索硬化、感染性休克、骨关节炎、糖尿病、黄斑变性等疾病。 在慕斯卡特的病情明显缓和之后，加拿大的其他干细胞治疗中心将会考虑为那些符合相关治疗条件的硬皮病患者提供这种治疗方法，为其他遭受这一疾病折磨的病人们带来希望。
骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提要:目的摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果以选用4～24ｈ贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ｍｌ的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4ｄ进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道ＭＳＣ在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1材料与方法 1.1骨髓ＭＳＣ的分离从胸骨无菌抽取约1～2ｍｌ的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ｍｌ,混匀,1200ｒ/ｍｉｎ,离心10ｍｉｎ;弃上清,用0.01ｍｏｌ/Ｌ的ＰＢＳ(ｐＨ7.2)洗2～3次,1200ｒ/ｍｉｎ,各离心10ｍｉｎ;计数,以2×109/ｍｌ种入10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基,青霉素100Ｕ/ｍｌ、链霉素100μｇ/ｍｌ,37℃,5%ＣＯ2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基。 1.2不同贴壁时间对ＭＳＣ增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72ｈ的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3不同浓度胎牛血清(ＦＢＳ)对ＭＳＣ生长的影响细胞按4×104/ｍｌ种入96孔培养板中,分别加入以下ＦＢＳ浓度的α ＭＥＭ培养基:0%、1%、 2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48ｈ后,加入20μｌＭＴＴ(5ｍｇ/ｍｌ二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4ｈ;尽量吸掉上清液,加入150μｌ二甲基亚砜,室温振荡10ｍｉｎ,ＨＴ7000ｐｌｕｓ多孔读数仪490ｎｍ处读取Ｄ490值,以培养液作空白对照。 1.4比较不同种植密度对ＭＳＣ生长的影响用含10%ＦＢＳ的α ＭＥＭ培养基;细胞按以下密度(×104/ｍｌ):0.3、0.6、1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48ｈ后,按上述方法测其Ｄ490值。 1.5培养细胞生长曲线细胞按0.5×104/ｍｌ种入24孔培养板,每孔培养液为1ｍｌ,每天取3孔测其Ｄ490值,连续测8ｄ,绘出培养细胞生长曲线。 1.6培养细胞分裂指数曲线按检测细胞生长曲线的细胞密度接种于放有小盖玻片的24孔培养板中,每24ｈ取出3块小玻片,连续8ｄ;用95%酒精固定,ＨＥ染色、封片。对每一时间组细胞进行计数,算出1000个细胞中分裂相细胞的百分比。 1.7ＭＳＣ的形态学观察在倒置显微镜下,直接观察第2、4、8代ＭＳＣ的活体形态;并分别用光镜及透射电镜观察其形态结构。 1.8统计学分析用哈佛统计软件,进行单因素方差分析及均数间的显著性差异检验,用Ｍｉｃｒｏｓｏ
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
小鼠骨髓间充质干细胞 小鼠骨髓间充质干细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠骨髓间充质干细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠骨髓间充质干细胞产品简介： 产品名称：小鼠骨髓间充质干细胞 组织来源：正常小鼠骨髓 产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠骨髓间充质干细胞简介： 小鼠骨髓基质系统内存在的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BM-MSCs）是一种除造血干细胞以外的、具有多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。 本公司生产的小鼠骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓，密度梯度离心，骨髓基质细胞专一性选择培养筛选获得，经检验细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
干细胞培养基的选择 研究背景： 小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点。小鼠的骨髓基质细胞成分复杂，间充质干细胞比率低，分离培养有一定的难度。广东医学院的博士研究生陈博士在培养过程中就遇到该问题。他曾成功饲养成人和大鼠骨髓间充质干细胞。但新近培养的小鼠间充质干细胞状态就很差。按照自己的分析：细胞培养操作没有问题，培养条件也不错，试剂来源可靠。问题应该出现在培养基配方上。陈博士以原来的骨髓间充质干细胞培养基为基础，按照导师的提点，修改了配方，但细胞不好不坏。为此他做了两次正交，结果缺总不理想，细胞状态并不稳定。陈博士为此焦头烂额，担心下一步的实验无法进行。经朋友介绍找到百恩维公司的技术支持。 解决方案： 百恩维的干细胞技术专家了解了陈博士的情况，培养技术、取材和试剂来源等，觉得不存在大问题；问题主要的原因是培养基的成分配比。建议陈博士重新配制培养基或使用现成的完全培养基。陈博士为了加快实验进度，直接选用了百恩维小鼠骨髓间充质干细胞培养基。 选用产品：小鼠间充质干细胞培养基（Catalog No.BW110014） 实施步骤： 1、使用百恩维的小鼠间充质干细胞培养基，进行原代的取材； 2、同样时间下，百恩维的培养基的MSC细胞状态明显优于自己配置的培养液； 3、经过传代，细胞的状态和增殖能力都很好； 4、成功获得了足够进行下一步实验所需的mouse MSC。 结果分析：细胞状态良好，成梭状、紧密分布，大小较均匀。目前已经传至20代。对于这次走的弯路，陈博士感慨良多。要高效的完成课题实验，就需要转变观念，合理利用和整合现有的各个优势资源，快速达到实验目标。 案例分析：目前成功的间充质干细胞培养液主要包含DMEM+FBS+谷氨酰胺+双抗。其中FBS的品牌和批次对细胞都会有不同的影响；无菌技术不成熟的新手，或者无菌条件不完善的实验室，最好使用双抗。最后，各成分的配比也有较大影响：大部分间充质干细胞适用低糖，加约10%的FBS等等，对不以寻找配方为目的的干细胞研究人员，我们建议直接使用经过不断优化和严格质量检测的百恩维干细胞培养基，提高科研效率。
人脐带间充质干细胞静脉输注小鼠的安全性 何君1,2，李洋1,2，陈威1,2，郝好杰3，李名烁1,2，韩瑞红1,2，武鑫1,2，卢星辰1,2，金翠英1,2，郭珣1,2，易辉1,2，李晓岑1,2，赵颖1,2，武岩1,2，徐玉环1,2 1.中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京，100021 2.中国医学科学院糖尿病研究中心，北京，100005 3.解放军总医院生命科学院基础医学所，北京，100853 【摘要】目的探讨C57/BL6J小鼠重复多次尾静脉输注人脐带间充质干细胞后的免疫反应和毒性。方法将SPF级别的32只C57/BL6J小鼠随机分为阴性对照组、细胞移植组，每组16 只，雌雄各半，细胞移植组小鼠尾静脉注射分离培养的第5代人脐带间充质干细胞，一次5×106/只，每周注射一次，连续注射4周；阴性对照组每次注射相同容积的PBS。注射后后观察小鼠的一般症状，末次注射后1周、4周进行血细胞计数、血生化、免疫反应指标、脏器质量测定和组织病理学检查。结果细胞移植组小鼠血细胞计数、血生化、脏器重量和脏器系数与对照组无显著性差异（P > 0.05），脏器组织病理学在光镜下检查结果与对照组无形态学差别，以及免疫结果测定（T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+）与对照组无显著性差异( P> 0.05)，较对照组有显著性差异（P 0.01）。结论人脐带间充质干细胞重复多次尾静脉输注C57/BL6J小鼠是安全可行的，对受者无明显免疫反应和毒副作用。【关键词】人脐带间充质干细胞；静脉输注；重复多次 【中图分类号】R332 A safety study of intravenous injection of human umbilical cord mesenchymal stem cells in mice HE Jun1,2, LI Yang1,2, CHEN Wei1,2, HAO Hao-jie3, LI Ming-shuo1,2, HAN Rui-hong1,2, WU Xin1,2, LU Xing-chen1,2, JIN Cui-ying1,2, GUO Xun1,2, YI Hui1,2, LI Xiao-cen1,2, ZHAO Ying1,2, WU Yan1,2, XU Yu-huan1,2, 1.Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Science，Beijing 100021，China 2.Diabetes research center，Chinese Academy of Medical Science，Beijing 100005，China 3.Institute of Basic Medicine Science, College of Life Science, Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China [Abstract]Objective: To study the toxicity of intravenous injection of human umbilical cord mesenchymal stem cells in C57/BL6J mice with repeated administrations. Methods: 32 SPF C57/BL6J mice were randomly divided into negative control group and HUMSC transplantation group, of equal gender. HUMSCs were isolated and subsequently cultured through 5 passages in