不同品种猪肠道微生物与体脂、ANGPTL4基因关系的研究
本研究以实时荧光定量TagMan-PCR和原代培养猪回肠上皮细胞技术，研究了不同品种猪肠道微生物与体脂、ANGPTL4基因的关系。研究包括六个试验。
试验一猪拟杆菌属-普雷沃氏菌属16SrDNATagMan-PCR实时荧光定量PCR方法建立通过对猪肠道30种细菌的16SrDNA序列进行比对分析，设计拟杆菌属—普雷沃氏菌属荧光定量的特异引物；以多形拟杆菌菌株（CDC1404-A）基因组的DNA为模板，用常规PCR引物扩增16SrDNA靶片断，将PCR产物纯化后作为DNA 标准品，按1.19×102—1.19×106copies／ul 5个稀释梯度的标准品作模板，建立定量标准曲线：用TaqMan探针建立25ul反应体系，对不同浓度的多形拟杆菌DNA样品进行检测，检测探针的敏感性；并以乳酸杆菌、大肠杆菌和双歧杆菌的基因组DNA模板作阴性对照，检测拟杆菌属—普雷沃氏菌属的特异性。结果表明：1)通过克隆测序，得到了拟杆菌属-普雷沃氏菌属细菌的16SrDNA部分共有片段序列，该序列与Genbank中发表的多形拟杆菌（基因序列号为M58763）和中间普雷沃菌（基因序列号为AY323522）16SrDNA基因序列相比，该片段为多形拟杆菌的792～1003和中间普雷沃菌的763—974位碱基的片段，同源性分别为92％和94％。
2)25ul PCR反应体系中Mg2+的最佳工作浓度均为5.0mM，探针最佳工作浓度为0.2μm，Taqman探针敏感性为3.73个／ul；3)本试验所制作的标准品稀释度在1.19×102—1.19×106copies／ul范围线性关系良好，标准品可用于后续试验的研究。试验二不同品种猪肠道微生物与体脂的关系试验通过选用在同一条件下饲养的0、1、2、3、4和5月龄的长白和太湖猪各4头，屠宰取后回肠和盲肠内容物，检测1、3和5月龄长白和太湖
猪回肠和盲肠内容物的总细菌、革蓝氏阳性细菌（Gram positive bacteria，
G+）、革蓝氏阴性细菌（Gram negativebacteria，G-）、革蓝氏阳性细菌／革蓝氏阴性细菌（G+／G-）、拟杆菌属-普雷沃氏菌属（Bacteroides-Prevotella, B. P）细菌数量、背膘厚度、脂肪率、脂肪细胞直径和肌内脂肪。
结果表明：1)太湖猪的回肠和盲肠内容物的G-及B．P细菌数量在不同年龄阶段均显著（p＜0.05）高于长白猪，G+／G-极显著低于（p＜0.01）长白猪，总细菌、G+与长白猪无显著差异（p ＞0.05）。2)猪回肠和盲肠的B．P和G-数量都与背膘厚度、脂肪率、脂肪细胞直径和肌内脂肪都有正相关关系，而G+／G-比例与背膘厚度、脂肪率、脂肪细胞直径和肌内脂肪有负相关关系。
试验三猪ANGPTL4基因的克隆及其实时荧光定量TaqMan-PCR检测方法的建立为了对ANGPTL4基因进行更为准确定量，本研究首先克隆长白和太湖猪的ANGPTL4和β-actin的DNA序列。根据所测定的序列，分别设计引物和探针，以回肠基因组的cDNA为模板，用常规PCR引物扩增，将PCR产物纯化作为DNA标准品，ANGPTL4和β-actin基因标准品分别按1.37×104－1.37×109和8.31×105－8.31×1010copies／mL的稀释梯度建立定量标准曲线，以TaqMan探针建立25ul反应体系，优化探针的最佳工作浓度，并检测探针的灵敏度。
结果表明：1)应用克隆测序方法获得了长白和太湖猪的目的基因ANGPTL4
和内参基因；β-actin的部分序列，所获得的长白和太湖猪的ANGPTL4的片断与参照序列（AY751522）的同源性分别为98％和92％，而B-actin与参照序列
（U07786）的同源性都为98％。2)ANGPTL4和β-actin探针在25ul体系中的最佳工作浓度分别为0.35μM和0.40μM，探针的灵敏度分别为13.7和83.1拷贝／ul；3)所构建的ANGPTL4和β-actin的标准曲线良好，反应体系中分别含有1.37×104－1.37×109和8.31×105－
8.31×1010copies／mL时，扩增反应ct值与拷贝数的对数呈线性关系，所得标准品可以用于后续试验。
试验四ANGPTL4基因在猪不同组织器官中的表达差异试验通过选用在同一条件下饲养的4月龄长白和太湖猪各4头，屠宰后取肝脏、脂肪、心脏、空肠、回肠、盲肠和结肠。根据试验三克隆的长白和太湖猪的ANGPTL4基因的序列，采用半定量RT－PCR技术检测ANGPTL4在不同品种组织中的表达差异。
结果表明：1)猪ANGPTL4基因在肝脏、脂肪、心脏、小肠和大肠四种组织中都有表达，其中在脂肪组织的表达最丰富，其次是肝脏、大肠、心脏、小肠。2)太湖猪的脂肪和肝脏组织ANGPTL4基因相对表达量都极显著（p＜0.01）高于长白猪，回肠和空肠中ANGPTL4基因表达量极显著低于（p＜0.01）长白猪，盲肠、结肠、心脏中ANGPTL4基因表达量与长白猪无差异（p＞0.05）。
试验五不同品种猪回肠微生物与ANGPTL4基因的关系选择0日龄健康正常的太湖猪和长白猪各24头进行150天的试验。每个品种设为一个处理，每个处理按体重一致原则设4个重复，公母各半，每个重复6头猪。
在同一环境条件下饲予相同的饲粮，分别在0、1、2、3、4、5月龄，每种猪各屠宰4头，测定回肠中ANGPTL4基因表达量和拟杆菌属-普雷沃氏菌属细菌数量。结果表明：1)1-5月龄的太湖猪回肠拟杆菌属-普雷沃氏菌属数量均高于长白猪，特别是在2、3和5月龄，极显著（p＜0.01）高于长白猪。
两品种猪的拟杆菌属-普雷沃氏菌属数量，都是随着年龄增加，呈现先增加，
2月龄下降，然后再上升的规律。2)1-5月龄太湖猪回肠ANGPTL4基因表达量均低于长白猪，特别是在1、2和5月龄极显著（p＜0.01）低于长白猪，但在0
日龄与长白猪的差异不显著（p＞0.05）；两品种猪ANGPTL4基因表达量与拟杆菌属-普雷沃氏菌属的变化成相反趋势，即先下降，后增加，再下降。
3)猪回肠拟杆菌、G-数量都与回肠ANGPTL4基因表达存在显著（p＜0.01）的负相关关系，而G+／G-比例与回肠ANGPTL4基因表达存在极显著（p＜0.01）的正相关关系。试验六多形拟杆菌及
代谢产物对猪回肠上皮细胞ANGPTL4表达的影响本试验以原代培养猪回肠上皮
细胞为研究模型，研究了多形拟杆菌及其代谢产物对猪回肠上皮细胞ANGPTL4
表达的影响。
试验设7个处理，多形拟杆菌-1（108Cfu／ml），多形拟杆菌-2
（107Cfu／ml）、多形拟杆菌-3（106Cfu／ml）、代谢产物-1（108稀释度）、代谢产物-2（107稀释度）、代谢产物-3（106稀释度）及对照组。108Cfu／ml多形拟杆菌和其相应代谢产物组都设20个重复，其它处理组设4个重复，每个重复1孔，在37℃培养96h后分别换为含多形拟杆菌108、107、
06Cfu／mlDMEM培养液和相应的代谢产物，分别于1、3、7、12和
26小时收集108Cfu／m多形拟杆菌和其相应代谢产物处理组的细胞，观察随浓度和作用细胞时间的变化，多形拟杆菌和其代谢产物影响ANGPTL4基因的表达情况。
试验结果表明：1)多形拟杆菌与肠细胞数目为1:1时。即可抑制回肠ANGPTL4
基因表达，这种抑制作用随多形拟杆菌的浓度增加和作用时间延长越明显。
2)多形拟杆菌产生的代谢产物不影响ANGPTL4基因表达，但随着时间的延长，ANGPTL4基因表达有提高的趋势（p＞0.05）。综合上面六个试验，可得出如下结论：1)太湖猪回肠和盲肠内容物G-及B．P的数量高于长白猪，而
G+／G-低于长白猪，总细菌数及G+与长白猪的差异不显著；随年龄的增加，总细菌数、G+、G-
的数量有增加的趋势，G+／G-有下降的趋势，B．P的
数量呈现上升-下降-再增加的趋势；2)太湖猪回肠ANGPTL4基因表达量低于长白猪，随年龄增加即先下降，后增加，再下降；3)多形拟杆菌可抑制回肠上皮细胞ANGPTL4基因表达量，而其代谢产物无明显作用；4)回肠和盲肠的拟杆菌属—普雷沃氏菌属及G-与体脂有正相关关系，G+／
G-与体脂有负相关关系。
肠道微生物与人类健康 转自中科院救星益生菌小组编辑 文章来源：武汉病毒研究所发布时间：2015-12-09 健康是人类永恒的话题。每个人都希望自己有一个健康的身体，但不可否认的现实却是各种各样的疾病一直困扰着大家，特别是由于饮食习惯的逐步变化及环境污染的影响，近年来各种慢性病更是呈井喷趋势。虽然人们常说吃五谷杂粮哪有不生病的，但问题是为什么我们吃的东西比以前营养丰富了，国人的健康水平却并没有明显改善，一些疾病特别是心脑血管疾病和恶性肿瘤已成为威胁人类健康的头 号杀手，医院往往是人满为患。大家不禁要问：健康的标准是什么？如何才能够拥有健康的身体？疾病特别是慢性疾病产生的真正原因 又是什么？真正健康的身体离我们究竟有多远？ 微生物与健康的关系一直是人们关注的话题，但长期以来我们对肠道微生物与健康关系的了解却非常有限。一百多年前，诺贝尔医学奖获得者、被尊称为“乳酸菌之父”的梅契尼科夫就认为：肠道健康的人身体才健康，肠道菌群产生的毒素是人体衰老和疾病产生的主要原因。他提出的人体自身中毒学说认为人体垃圾因为某些原因过量沉积在体内，导致慢性中毒，从而引发多种疾病。但由于缺少直接的证据，肠道微生物与人类健康之间的关系一直没有得到很好的解释。 近年来，随着高通量测序和宏基因组学等新的研究方法的不断开发和应用，肠道微生物对人类健康的影响重新引起重视，成为当前生命科学和医学的研究热点，一些国家相继实施了人体微生物组计划并
取得了突破性进展。现有数据表明，肠道是人体最大的微生态系统，栖息着总数约10的14次方、1000-2000 余种、重量约为1-2 公斤 的微生物。这些肠道微生物编码基因的总数超过330 万，约为人类 编码基因总数的100倍，因此肠道微生物又被认为是人体的第二基因组。肠道微生物基因组与人体基因组一起，通过与环境因素的相互作用，通过不同方式影响我们的健康。 肠道微生物从功能上可以分为共生、益生和病原微生物三大类，其中主要是细菌，也包括真菌、病毒和噬菌体，它们在人体肠道中保持着一种动态的平衡。如此庞大的肠道微生物群体通过与宿主的长 期协同进化，已经成为一个与人体密不可分的后天获得的重要“器官”。肠道微生物这一“器官”发挥的功能多种多样，包括物质代谢、生物屏障、免疫调控及宿主防御等，肠道微生物不仅帮助人体从食物中吸收营养，还能够合成氨基酸、有机酸、维生素、抗生素等供我们利用，并可以将产生的毒素加以代谢，减少对人体的毒害。不同的饮食习惯和生活方式对人体肠道微生物种类有很大的影响，例如高脂肪的饮食可以导致有益的双歧杆菌减少甚至消失。因此，肠道微生物和人体存在着互利共生的关系，对于维持人的健康发挥着重要的作用。 除物质合成与代谢功能外，肠道复杂的微生物生态系统与机体免疫系统之间的关系也极为密切。肠道微生物不仅可以作为天然屏障维持肠上皮的完整性，防止病原微生物入侵，还通过调节肠道粘膜分泌抗体作用于肠道免疫系统，并进一步影响天然免疫和获得性免疫，因此肠道微生物又被认为是人体最大的“免疫器官”。肠道微生物维持
微生物鉴别方法 一、微生物鉴别方法——传统方法 在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。 1、形态学特征 （1）细胞形态 在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。（2）群体形态 群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。 2、生理生化反应特征 （1）利用物质的能力
包括对各种碳源利用的能力（能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。 （2）代谢产物的特殊性 这方面的鉴定项目非常多，如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。 （3）与温度和氧气的关系 测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。 3、生态学特征 生态学特征主要包括它与其他生物之间的关系（是寄生还是共生，寄主范围以及致病的情况）。在自然界的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是否耐高渗、是否有嗜盐性等）。 4、血清学反应 很多细菌有十分相似的外表结构（如鞭毛）或有作用相同的酶（如乳酸杆菌属内各种细菌都有乳酸脱氢酶）。虽然它们的蛋白质分子结构各异，但在普通技术下
人体微生物与健康 编者按：人体内外存在着大量微生物，它们帮助人类消化吸收营养、合成维生素、参与代谢调节、调控免疫机能、甚至影响着我们的情绪和认知行为。每个人都携带着具有其个体特征的微生物群体，对个体微生物的研究将在医学领域提供许多新的治疗和诊断途径。 陈紫微编译 微生物在我们生活的环境中无处不在，但长久以来，它们总是作为致病源而引起人们的注意。实际上，我们的体表和肠道中也生活着大量微生物，它们并不会使我们生病，反而对我们的健康起着重要作用，然而，这些小生物与人类关系的密切程度却鲜为人知。 大量居住在人体的微生物都是人类的好朋友 人体微生物的种类有数千种，其数量是我们自身细胞总数的1到10倍。我们常说人体寄生着大量微生物，而更确切的说法是，它们与我们共生。早在人类在地球上行走之前，动物与微生物就建立起各种互利共生关系——动物体为微生物提供保护及营养丰富的生存环境，作为回报，微生物则发挥其基因优势，帮助动物分解营养物质、合成维生素等。在漫长的进化过程中，向微生物“借基因”是动物获得新技能的一条捷径。
有科学家把人体的微生物群落看做是一个新近发现而尚待探索的“器官”，因为它们参与着我们赖以生存的各项生理过程。比如，居住在大肠中的一些微生物能合成人类自身无法合成的B族维生素。维生素B1、B2、B7是细胞能量代谢所需的辅因子，维生素B6在氨基酸合成中扮演重要角色，维生素B9参与核酸的合成……这些生化反应对于微生物和人类来说都至关重要，所以，B族维生素是微生物和人类共同所需的。然而，还有一些微生物基因却是全心全意地为人类服务，比如，肠道微生物合成的维生素K可以帮助人类凝血，对微生物自身却用处不大，这也可以看做是一个微生物和人类共同进化的证明。 小肠中的微生物可以分解人类无法消化的营养物质，使其易于被人体吸收。肠道微生物们是分解淀粉、纤维素、蔗糖等碳水化合物的好手，据估计，人体吸收的卡路里中约有10%是在微生物的协助下完成的，如果没有它们，这些营养物质就只能穿肠而过。肠道微生物还会分泌信号分子到人体血液中，参与大范围的代谢调控。从肠道微生物释放的信号分子不仅参与调节肝脏和肌肉细胞对能量的储存和利用，还能影响人体对胰岛素的反应性，甚至参与调控我们的食欲和体重。一个具体的例子是我们大肠的细菌在分解食物中的纤维素时，会产生蚁酸，蚁酸通过血液系统到达肾脏，调节盐代谢，从而影响我们的血压。
【收稿日期】2009204221 【基金项目】福建省科技厅资助项目(2008F50205) 【作者简介】卢龙娣(19832),女,在读硕士研究生,从事肠道微生物学 研究,Email:linl ongdi @https://www.doczj.com/doc/f814458762.html,;江胜滔,通讯作者, Email:windt om 2jiang@https://www.doczj.com/doc/f814458762.html, 文章编号:10052376X (2009)0720588203 【论 著】 鸡肠道菌群总DNA 三种提取方法的比较 卢龙娣1 ,江胜滔2 ,林跃鑫 2 (1.福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108;2.龙岩学院生命科学学院,福建龙岩 364000) 【摘要】 目的 比较不同方法提取鸡肠道菌群总DNA 的差异,为分子方法分析肠道菌群组成提供质量较高的DNA 模板。方法 采用反复冻融法、酶裂解法和试剂盒法(E .N.Z .A St ool DNA Kit )来提取鸡肠道菌群的总DNA,并根据DNA 浓度及纯度、16S DNA 扩增产物和ER I C 2PCR 产物所反映的片段多态性4个指标,对这3种方法提取的DNA 质量进行比较。结果 3种方法均能提取DNA,所得DNA 都可以用于16S DNA 的扩增,但后2种方法所得DNA 的ER I C 2PCR 结果能反映出更高的菌群多样性。结论 试剂盒法和酶裂解法所提取的DNA 质量好,适合用于肠道菌群的分子生态研究。 【关键词】 肠道菌群;总DNA 提取;16S DNA;ER I C 2PCR 【中图分类号】R446.4 【文献标识码】A Com par ison of three m ethods for tot a l D NA extracti on from i n testi n a l m i croflora of the fowl LU Long 2di 1 ,J I A NG Sheng 2tao 2 ,L I N Yue 2xin 2 (1.The College of L ife Sciences,Fujian N or m al U niversity,Fuzhou 350108,China;2.The College of L ife Sciences,L ongyan U niversity,L ongyan 364000,China ) 【Abstract 】 O bjecti ve To screen a method that could p r ovide a higher quality DNA te mp late for molecular analysis of compositi on of intestinal m icr ofl ora .M ethod Repeated freeze 2tha w method,lys ozy me method and E .N.Z .A St ool DNA Kit method were used t o extract t otal DNA fr om intestinal m icr ofl ora of the f owl .The quality of DNA extracted by the three methods was compared based on the concentrati on,purity,16S DNA PCR p r oducts and length poly mor phis m of ER I C 2PCR p r oducts .Result Total DNA extracted by any of the three methods could be used t o 16S DNA a mp lificati on .But the result of ER I C 2PCR of DNA extracted by the last t w o methods showed more m icr ofl ora diversities .Conclusi on The quality of t otal DNA extracted by E .N.Z .A St ool DNA Kit method and lys ozy me method were better than that of repeated freeze 2tha w method,s o can both be used t o study molecular ecol ogy of intestinal m icr ofl ora . 【Key words 】 I ntestinal m icr ofl ora;Total DNA extracti on;16S DNA;ER I C 2PCR 动物肠道内的微生物种类繁多,数量巨大,它们与动物的健康紧密相连,所以有必要分析动物肠道菌 群的组成。传统微生物培养研究的方法不仅费时、费力,更为重要的是肠道中绝大多数微生物是严格厌氧或兼性厌氧,体外培养困难,再加上大量不可培养微生物的存在,采用传统培养技术事实上已经很难对肠道微生物进行更加全面而深入的研究。近年来,随着分子生物学的发展,总DNA 提取的分子生态学方法已被广泛应用于肠道菌群的研究中,其中细菌16S DNA 的分子鉴定为检测肠道不可培养微生物开辟了新的道路,而基于肠杆菌基因间重复共有序列(ER I C )2PCR 技术构建的DNA 指纹图谱则为研究肠道菌群的多样性提供了新的方法。通过分子学方法来研究动物肠道菌群的关键是样品总DNA 的提取,目前用于肠道菌群基因组总DNA 提取的方法较多,提取的效率也各不相同。本文比较了常用的3种总 DNA 提取方法:反复冻融法、酶裂解法及试剂盒法, 试图筛选一个适合提取鸡肠道菌群总DNA 的方法,为后续分子方法分析动物肠道菌群组成提供质量较高的DNA 模板。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 鸡盲肠 选取市场上健康的成年河田鸡,颈静脉放血处死,打开腹腔取出盲肠,-20℃保存备用。1.1.2 主要试剂与仪器 溶菌酶、蛋白酶K (Sig ma 公司);Tap 酶(Tiangen 公司);dNTP 、DNA Mark (TaKaRa 公司);引物(上海生工生物工程有限公司);E .Z .N.A St ool DNA Kit (Omega 公司);PCR 仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机(B i o 2Rad 公司);UV 23200扫描型紫外/可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。1.2 实验方法1.2.1 样品预处理 取盲肠内容物2.0g,置于50m l 无菌离心管中,加入10m l 无菌P BS (pH 7.4)振荡使其悬浮混匀,600r/m in 离心6m in,取上清液于另一无菌50m l 离心管中,10000r/m in 离心10m in 收集菌体,用P BS 离心洗涤菌体直至上清液清澈为止。 8 85Chinese Journal ofM icr oecol ogy,Jul 12009,Vol 121No 17
胃肠道微生物与人类健康 摘要胃肠道中的各种微生物存在着动态平衡，一旦打破这种平衡就可能会引起多种疾病。因此，胃肠道微生物与人类的健康生活息息相关。以下就胃肠道微生物的组成、影响因素以及饮食、胃肠道微生物与急性溃疡性结肠炎、急性坏死性胰腺炎、急性腹泻、慢性回肠末端炎、肠易激综合征、糖尿病、儿童孤僻症等急慢性疾病之间的联系进行详细地分析和阐述，从而引起人们对胃肠道微生物平衡的重视，也为预防和治疗这些疾病提供一个新的视角。关键词胃肠道微生物平衡：急性疾病：慢性疾病：预防和治疗 在正常情况下，肠道菌群、主与外部环境建立起一个动态平衡，而肠道菌群的种类和数量亦是相对稳定的，但它们易受饮食和生活环境等多种因素的影响而变动，引起肠道菌群失调，从而引发疾病或加重病情(1)。近20年的大量研究表明，人体内低度的、全身性的慢性炎症是肥胖、糖尿病、冠状动脉性心脏病、衰老和老年疾病以及很多癌症的重要诱发因素。最近有学者发现，饮食不当造成的肠道菌群结构失调可能是这些慢性炎症的根源（2）。由肠道菌群失调引发的疾病包括多种肠炎、肥胖、肠癌甚至肝癌。有数据显示，因肠道菌群失调而导致临床患病的概率约为2%-3%（1）。因此，饮食结构与人体肠道菌群之间存在一定的关系，并影响着人类的健康。以下我们拟队饮食结构或饮食中营养成分发生变化对人类肠道菌群的影响极其导致的人体健康变化进行探讨。 1 胃肠道微生物的组成 人体的消化道是一个通过食物与外部坏境频繁接触的器官，自口腔至直肠都有大量的微生物存在。从口腔接近中性的环境到胃的酸性环境（pH2.5-3.5）对多数微生物有破坏作用，此时每克消化道内容物中微生物的数量为10000，而且主要以革兰阳性的链球菌、乳杆菌和酵母菌为主。进入十二直肠后，由于消化液的增加（如胆汁、胰液)以及停留时间短，十二指肠的环境非常不利于各种微生物的生存，此时微生物的组成不稳定，仅以极低的限数存在（3）。进入空肠和回肠后，微生物的数量开始增加，而且种类也在不断增加。在小肠末端，除了乳酸菌，尤其是双歧杆菌的数量级增长外，其他一些革兰阳性兼性氧菌如大肠菌科的细菌以及专性厌氧菌群，如拟杆菌和梭杆菌也开始出现，甚至在回盲部之前严格厌氧微生物已开始出现，此后（即在盲肠之后）严格厌氧的微生物在数量上超出兼性厌氧的微生物100-1000倍，此时细菌的数量可达到10^12cfe/g（3）。研究表明，未成年人的肠道菌有7个门的细菌组成（4）。这种构成是肠道微生物群与其宿主（人）共同并且双向进化的结果。其中，宿主因自然选择压力要求肠道微生物群趋于稳定。这些压力包括宿主在生理方面的存活压力、外界生存条件形成的肠道环境压力等(5)。因此，人体成年后肠道中菌群的门类正常情况下都是相对稳定的，只是优势菌“种”存在个体差异。 2 食物中破坏胃肠道菌群平衡的因素 一些致病性微生物的摄入可能引起肠道菌群失衡，并致人体患病。目前，发现能引起食源性胃肠道疾病的致病菌有10种左右。另外，病毒也能引起肠道菌失衡。 残留在动植物产品中的兽药、抗生素、苯酚、对甲酚、吲哚等化学物质，也会对人体肠道的平衡长生影响，还会对肠道定植菌的屏障功能产生影响，从而引发肠道菌群失衡。Jeong等（5）研究表明，环丙沙星对大肠杆菌、芽孢杆菌均有一定的抑制效果。而梭杆菌和乳酸菌对黄霉素最为敏感，真菌和梭杆菌对奥奎多司最为敏感（奥奎多司为光谱抗菌药，对革兰阳性菌和格兰阴性菌中众多细菌
水生动物肠道微生物研究进展 作者：张美玲杜震宇 来源：《华东师范大学学报（自然科学版）》2016年第01期 摘要：动物体消化道栖息着一个数量庞大、种类繁多的微生物群落，肠道微生物与宿主生理代谢的相互关系已成为国际生物学界研究的热点之一.然而与高等动物相比，水生动物这方面的研究尚处于起步阶段.本文从水生动物肠道共生微生物形成的影响因素、水生动物肠道微生物的组成特点、肠道微生物对宿主的影响以及肠道微生物生态学研究策略方面综述了近年来国内外研究取得的进展，阐述了消化道微生物分子生态学研究在水生动物营养代谢、免疫及发育调控中的意义和发展前景. 关键词：肠道微生物；水生动物；益生菌；免疫调节；营养代谢 中图分类号：Q938.1 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1000-5641.2016.01.001 0引言 动物体消化道内栖息着一个数量庞大的微生物群落，约含1000～5000种微生物，并由此在宿主肠道内形成了一个复杂的微生态系统（micro-ecosystem）.目前已知，消化道菌群与宿主及消化道环境（如食物、体温、pH值等）三者之间构成了相互作用与依赖的“三角”关系，共同参与营养物质的消化、吸收及能量代谢的过程，在高等动物中，已有很多研究阐明肠道微生物参与宿主营养代谢或免疫调节.新近的研究工作发现，人体肠道内的拟杆菌具有独特的碳水化合物结合结构域，可以有效地提高细菌对于膳食纤维的结合能力，增强其降解多糖的效率，帮助宿主利用膳食中的多糖类物质，人体肠道内的柔嫩梭菌（Fae-calibacterium prausnitzii）通过分泌特定的代谢物阻断NF-κB的激活及IL-8的产生，从而抑制肠道炎症疾病的发生，随着对肠道微生物功能解析工作的逐步深入，现在学界已逐渐认识到，在动物生理学尤其营养代谢研究中，必须充分考虑肠道细菌的作用。当前，高等动物肠道微生物与宿主生理代谢的相互关系与调控机制已成为国际生物学和医学的研究热点之一.然而水生动物肠道微生物与宿主生理的关联与调控研究尚处于起步阶段。相比于陆生脊椎动物，水生动物处于更为复杂的生态环境之中，其肠道微生物结构和陆生动物相比具有更大的多样性和复杂性，这也给水生动物肠道微生物研究带来了挑战。尽管如此，国内外仍有一些学者对水生动物肠道微生物进行了初步研究，并取得了较好的进展。 1水生动物肠道微生物结构形成的影响因素 与其它动物相类似，目前的研究表明水生动物的遗传背景、饲养环境、饲料组分均可以显著影响其肠道微生物的结构组成.关于宿主的遗传背景对肠道微生物的影响目前在国内外均有报道，研究发现处于不同生长环境中的斑马鱼肠道存在一个核心菌群，而生活在同一淡水环境
如何解决猪的肠道问题 1、肠道问题首先是腹泻和便秘 1．1有时仔猪腹泻抗生素解决不了 断奶仔猪的腹泻是最让我们头痛的问题之一，幸好我们有好多抗生素可以解决，可是有一天我们突然发现以前屡试不爽的药物突然不见效了，打了针照样拉稀。其实不是药物不管用了，而是你遇到了另外一种情况：断奶的仔猪肠道菌群严重失调，功能出现了紊乱，在这种状况之下即使使用再多的药物也是无济于事，反而还可能更加破坏肠道的菌群平衡。这时你需要及时恢复肠道的微生态，使有益菌群快速的增殖从而改善肠道功能，这时腹泻的问题也就迎刃而解了。这也正是顽固性腹泻的仔猪使用润生康后快速治愈的原因，同时也是我们建议在断奶前后饲料中添加润生康防治菌群失调而发生腹泻的原因。 1．2病毒性腹泻更是束手无策 病毒性腹泻如传染性胃肠炎、流行性腹泻、轮状病毒等，往往会快速感染全群造成严重腹泻，并且有很高的死亡率，尤其对于仔猪。感染猪只肠道严重受损，会有肠粘膜脱落随粪便排出，对于病死猪的剖检可以看出肠管稀薄透明，几乎丧失了消化吸收的功能。但是对于这样烈性的疾病却没有特效的药物，我们也只是补盐补液防止继发感染为主。在治疗的过程中我们往往会忽视一个问题，那就是快速修复肠道粘膜和微生态平衡。即使对于耐受的猪只这同样也是重中之重，猪只肠道功能的恢复很大程度上决定于肠道粘膜和微生态平衡的恢复情况。所以对于感染病毒性腹泻疾病的猪只无论在治疗阶段还是恢复阶段，都要注意润生康的使用。 1．3母猪的便秘也不是不可以解决 母猪的便秘问题一直是困扰猪场的老大难问题。因为生产之前的母猪由于胎儿的压迫造成肠胃蠕动受阻，肠道排空时间延长从而出现便秘的情况。在此过程中消化机能显著减弱，肠道的菌群也处于失调的状态。通过补充微生态制剂来重新建立新的平衡，强化肠胃的功能可以很好的预防和解决母猪便秘的问题。 2、这些问题你想到了吗 2．1圈舍有害气体超标的危害与肠道的消化密切相关 我们经常会为猪舍里的异味和有害气体而困扰，尤其在冬季密闭的情况下这个问题就更加严重。猪舍的有害气体，包括氨气、硫化氢等不但气味难闻，更有很强的刺激性。对猪眼睛、呼吸道粘膜都有很强的腐蚀性。在这种环境中生存的猪群，出现呼吸道疾病的几率大大的提高。这些有害气体是肠道内和猪舍内没有消化的营养物质异常发酵转化而来的，没有消化掉的蛋白在肠道内异常发酵产生有害气体。 2．2粪便中残留的饲料在源源不断的侵蚀着你猪场的利润 由于肠道消化的不彻底，导致许多本来可以吸收的营养物质随和粪便被排出体外，白白的浪费掉了。许多猪场在清理猪舍的时候都会发现很多没有消化的饲料残渣冲洗之后留在了地面上。这些残存在粪便中的饲料正是猪场一笔不小的浪费，尤其在饲料价格大幅上涨的时
肠道微生物与人类健康 很多人认为，显微镜下才能看到的微生物和人们的生活关系不大，即便有关也不是我们需要了解的。但事实上，微生物和人类健康有着密不可分的关系。在我们身体的表面和内部，尤其是在肠道里，不为人知地“居住”着许多微生物。在人体内，渺小的微生物最有“发言权”。 我们体内有2公斤重的细菌，但是其中只有大约20%可以被培养和研究。绝大多数的“人体房客”至今还不为人所知，它们对人体的健康也还不被理解。 1、基本概念及综述 1.1 肠道微生物的定义：是一类生长在动物肠道中的微生物，它们构成了一个独特、多变的生态系统。这是在已发现的生态系统中细胞密度最高的系统之一。该系统中积聚着大量的微生物，同时细菌与宿主细胞之间紧密地接触在一起。 人类肠道微生物：即生长在人体内的肠道微生物。 1.2 肠道微生物的类别：分为两种，第一种称为正常菌群，第二种称为过路菌群，又称为外籍菌群。 正常菌群：数量是巨大的，约为1014左右，在长期的进化过程中，通过个体的适应和自然选择，正常菌群中不同种类之间，正常菌群与宿主之间，正常菌群、宿主与环境之间，始终处于动态平衡状态中，形成一个互相依存，相互制约的系统，因此，人体在正常情况下，正常菌群对宿主表现不致病。 过路菌群：是由非致病性或潜在致病性细菌所组成，来自周围环境或宿主其它生境，在宿主身体存留数小时，数天或数周，如果正常菌群发生紊乱，过路菌群可在短时间内大量繁殖，引起疾病。 1.3 肠道微生物的分布：在人类胃肠道内的细菌可构成一个巨大而复杂的生态系统，一个人结肠内就有400个以上的菌种。从口腔进入胃的细菌绝大多数被胃酸杀灭，剩下的主要是革兰氏阳性需氧菌。小肠微生物的构成介于胃和结肠的微生物结构之间。近端小肠的菌丛与胃内相近，但常能分离出大肠杆菌和厌氧菌。远段回肠，厌氧菌的数量开始超过需氧菌，其中大肠杆菌恒定存在，厌氧菌如类杆菌属、双歧杆菌属、梭状芽孢杆菌属，都有相当数量。在回盲瓣的远侧，细菌浓度急剧上升，结肠细菌浓度高达1011～1012 CFU/mL（CFU即colony forming unit，菌落形成单位），细菌总量几乎占粪便干重的1/3。其中厌氧菌达需氧菌的103～
2020肠道微生物与免疫的研究进展 人体正常的肠道微生物数量达1012~1014,其平均质量约为1.5 kg[1-2],约6~10个类群(3 000种)微生物组成[2-3]。婴儿在出生之后不久就有微生物在肠道定植,直到肠道微生物达到一个稳定的共生群[4]。肠道微生物对于宿主是有益的,在过去10年的研究中,已经发现肠道微生物在人体发育、肠道屏障、免疫调节、物质代谢、营养吸收、毒素排出，以及疾病的发生、发展等方面发挥着巨大的作用。肠道菌群的紊乱可能导致肥胖、肝硬化、糖尿病、心血管疾病，以及孤独症等各种疾病的发生。肠道微生物的主要功能是帮助宿主代谢,使能量和营养物质更好地被利用,为肠道上皮细胞提供营养,增强宿主免疫功能,帮助寄主抵抗病原菌[5]。最近，大量的研究表明,肠道微生物的代谢功能是非常重要的,并且效率远远超过肝的代谢功能。例如肠道微生物不仅可以影响视网膜的脂肪酸组成和眼睛晶状体、骨骼的密度、肠道血管的形成[6];而且可以提供必需的营养物质(生物素、维生素K、丁酸等)和消化食用纤维素[7]。肠道微生物同脊柱动物已经一起进化了几千年,因此，免疫系统正常功能(抵抗细菌病原体)的实施需要依靠肠道微生物。同时,肠道微生物是刺激“黏膜免疫系统”(mucosal immune system)和“全身免疫系统”(systemic immune system)成熟的重要因子[8-9]。许多实验研究发现肠道微生物的组成及代谢产物对免疫和炎性反应有很重要的影响。如果肠内部免疫系统
崩溃就会引起慢性肠炎疾病,例如克罗恩病和溃疡性结肠炎[10],然而,由于共生肠道微生物的多样性和很难断定哪种细菌是共生菌还是条件致病菌,所以对于肠道微生物定植反应的免疫调控是复杂的。近几年,肠道菌群与免疫的研究受到越来越多人们的关注。因此,本文就肠道微生物与免疫系统的关系做一综述。 1 肠道微生物群相关的疾病 近年来,大量肠道微生物与肠道生理功能关系的研究表明,肠道微生物在宿主健康与疾病方面有重要的作用[11],通过对炎性反应动物模型的研究已经确定肠道微生物与肥胖、糖尿病、过敏和哮喘等疾病的发展和变化有重要关系[12]。目前,已经有许多实验发现肠道微生物与肥胖和糖尿病有关,其中一个最新的研究表明，在遗传或者饮食诱导的肥胖小鼠肠道内Akkermansia muciniphila(一种存在于黏液层的黏液素降解菌,在健康情况下,它占肠道微生物菌群总数量的3%~5%)菌急剧减少,在饮食诱导的肥胖小鼠肠道内A. muciniphila的丰度比对照组小鼠低100倍,在饮食诱导的肥胖小鼠口服A. muciniphila后发现小鼠的体质量降低和身体指数得到改良;进一步研究发现,A. muciniphila可以降低胰岛素耐受性,控制脂肪储存、脂肪代谢、甘油酯和葡萄糖的稳态[13]。另一个研究通过比较Ⅱ型糖尿(T2D)和正常70岁欧洲妇女的肠道微生物组成,发现在有糖尿病的群体中,4个乳酸
１期印遇龙等：猪肠道健康的生物学机制及词控技术研究与应用仔ｔｏｉｎ，２００８，１８６：１０５１０２．３（） ２．３１５溶后２４ｈ悬浮率大于９％。该产品的消化吸收率５达９％，５而普通豆油的消化吸收率仅为４．％，３４棕榈油（肪粉）消化吸收率更低，脂的只有２％。在与３［ＷａｇＷ ９］ｎＣ，ＧｅｇＭ，Ｌ，ｔａ．ＴｅｐｏｎＭｉＪｅ１ｈｒ—Ｔｔｏｍｅｎａｙｉｅａｙｒｎｉｅｓｐｌｍｅａｉｅｓａｌｓｓｏｆｄｉｔｒａｇｉｎｕｐｅｎｔｔｏｎ饲料配合时可以提高油脂含量（高达３％～可Ｏ５％，液态油脂的添加量不超过８，配制高０而％）为ｉｒｖｎａｌｗｅｎｄｓｅｓｙｄｏ ｎｔｅｊｊ—ｍｐｏｉｇｅｒａｅｔｓｓｎｒｍｅｉｕｙｒ ｈｅｈｍｆｅｒ—ｅｎｄｐｇｅｓＣ］ｒｃｅｉｇｆｕｏａｌｗａｅｉｌｔｙ［．Ｐｏｅｄｎｓｏ４ＩｅｎａｔｏｎａＳｎｔｒｉｌｙｍｐｏｉｍｏＡｎｍａＮｕｔｉｉｓｕｎｉｌｒｔｏｎ，Ｈｅａｔａｄｅｄｄｉｉｅ，２９：６５—０．ｌｈｎＦｅｄＡｔ
ｖ００４６６能饲料提供了技术储备，别适应于寒冷和热应激特状态。［ＯＨｅＱ１］Ｈ，ＫｎＦ，ｅ１Ｍｅａｏｏｃ—ｏｇＸ．ＷｕＧ，ｔ．ｔｂｌｍｉａａｎｌｓｓｏｈｅｐｎｅｏｒｗｉｇｐｇｏｄｅａｙＬ—ａｙｉｆｔｅｒｓｏｓｆｇｏｎｉｓｔｉｔｒ５小结综上所述，过研究仔猪在断奶前后肠道变化通的规律，阐明其变化的机理，指导配方设计和研发对新型的功能性饲料具有十分重要的意义，其研究成果也必将具有广阔的应用前景。参考文献：［１］ＬｌｓＪＰｏｉＰｍｉｔＨ，ｅ１ａｌ，Ｂｓ，Ｓｄｅｔａ．Ｗｅｎｎ－Ａａｉｇｃａｌｇｏｇｔｐｙｉｌｇｓ［］Ｌｖｓｃｃ—ｈｌｎｅｔｕｈｓｏｉｓＪ．ｉｅｔｋＳｉｅｏｔｏｅｃ，２０ｎｅ０７，１８（／）：８—３．０１３２９ａｇｎｎｕｐｅｎａｉｎＪ．ＡｍｉｏＡｃｄ，２０，ｒｉｉｅｓｐｌｍｅｔｔ［］ｏｎｉｓ０９３（）：１９２８．７１９－０［１１］ＨｅＱＨ，Ｋｎ，ＴｎｏｇＸＦａｇＺＲ，ｅ１ｅｕｔａ．Ｓｒｍｍｅａｂｏｍｅｉａｔｒｄｉａｇｎｎｅｓｐｌｍｅｅｔｏｌｓｌｅｅｎｒｉｉ—ｕｐｅｎｔｄｇｏｎｉ［．ＰｏｅｄｎｓｏＩｔｒａｉｎｌｒｗｉｇｐｇｃ］ｒｃｅｉｇｆ４ｎｅｎｔａｓｏＳｙｍｐｉｍｎｉａ ｕｔｉｉｏｓｕｏｎＡｍｌＮｒｔｏｎ，ＨｅｔａａｌｈｎｄＦｅｅｄＡｄｄｉｉｅ，２９：４２４３ｔｖ００６—０．［２李铁军．哺乳仔猪发育血液成分及肠道功能性基因１］表达变化趋势研究［．博士学位论文．北京：中国Ｄ］科学院，０９２０．［３ ＷａｇＷ１］ｎＣ，ＧｕＷＴ，ＴｎＦｔａ．ＭｏｅｕａａｇＸ，ｅ１ｌｌｒｃｃｌｎｇ，ｔｓｕｄｓｒｂｕｉｎｎｄｎｔｅｔｃｘｅ?ｏｎｉｉｓｅｉｔｉｔｏａｏｏｇｎｅｉｅｐｒｓ［２］ＧｕＸ，ｉＳｅＲ．ｆｅｔｆａｉｇｏｌｉ．ＬＤ，ｈＥｆｃｏｎｎｎｓｌｎｗｅｍａｔｓｎｌｔｃｕｅａｄｆｎｔｎｉｈｉｌ［］ＡｒｅｔａｒｔｒｎｕｃｉｔｅｐｇｅＪ．—
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肠道菌群领域研究进展（完整版） 已有大量研究证实，肠道菌群与肥胖、糖尿病、高脂血症、高血压、心脑血管疾病、慢性肾病、神经系统疾病等相关，肠道菌群科学家们2019年在肠道微生物组研究领域取得了研究成果； 【1】Nat Biotechnol：突破！科学家在人类肠道微生物组中鉴别出100多种新型肠道菌群！ 近日，一项刊登在国际杂志Nature Biotechnology上的研究报告中，来自英国桑格研究院等机构的科学家们通过对肠道微生物组研究，从健康人群的肠道中分离出了100多个全新的细菌类型，这是迄今为止研究人员对人类肠道菌群进行的最全面的收集研究，相关研究结果获奖帮助研究人员调查肠道微生物组在人类机体健康及疾病发生过程中所扮演的关键角色。 本文研究结果能帮助研究人员快速准确地检测人类肠道中存在的细菌类型，同时还能帮助开发出治疗多种人类疾病的新型疗法，比如胃肠道疾病、感染和免疫疾病等。人类机体中细菌大约占到了2%的体重，肠道微生物组就是一个主要的细菌聚集位点，同时其对人类健康非常重要。肠道微生物组的失衡会诱发诸如炎性肠病等多种疾病的发生，然而由于很多肠道菌群难以在实验室环境下生存，因此研究人员就无法对其进行更加直观地研究。
【2】Science：肠道微生物组可能是药物出现毒副作用的罪魁祸首 药物本是用于治疗很多患者，但是一些患者遭受这些药物的毒副作用。在一项新的研究中，来自美国耶鲁大学的研究人员给出了一种令人吃惊的解释---肠道微生物组（gut microbiome）。他们描述了肠道中的细菌如何能够将三种药物转化为有害的化合物，相关研究结果发表在Science期刊上。 研究者表示，如果我们能够了解肠道微生物组对药物代谢的贡献，那么我们能够决定给患者提供哪些药物，或者甚至改变肠道微生物组，这样患者具有更好的反应。在这项新的研究中，研究人员研究了一种抗病毒药物，它的分解产物可引起严重的毒副反应，并确定了肠道细菌如何将这种药物转化为有害的化合物。他们随后将这种药物给予携带着经基因改造后缺乏这种药物转化能力的细菌的小鼠，并测量了这种毒性化合物的水平。利用这些数据，他们开发出一种数学模型，并成功地预测了肠道细菌在对第二种抗病毒药物和氯哌嗪（一种抵抗癫痫和焦虑的药物）进行代谢中的作用。 【3】Nat Med：肠道微生物组的改变或与结直肠癌发生密切相关肠道中“居住”着很多不同的微生物群落，即肠道微生物组，其与人类健康和疾病息息相关，近来有研究表明，评估粪便样本中的遗传改变或能准确反映肠道微生物组的状况，或有望帮助诊断人类多种疾病。近日，一项刊登在国际杂志Nature Medicine上的研究报告中，来自
格兰阴性杆菌 肠杆菌科： 共同特点大肠埃希菌沙门菌属志贺菌属克雷伯菌属沙雷菌属变形杆菌属耶尔森菌属 形态结构1）格兰阴性杆 菌； 2）中等大小； 3）无芽孢，多数 有周边毛，少数 有荚膜1)格兰阴性短杆 菌 2)有周鞭毛、菌 毛，某些菌株有 微荚膜 1）格兰阴性杆 菌 2）有菌毛，周鞭 毛，无荚膜 1）格兰阴性杆 菌 2）无鞭毛，无荚 膜，多数有菌毛 1）格兰阴性 2）卵圆或球杆 状，常成双排列 3）有明显荚膜， 无芽孢，无鞭毛， 有菌毛 1）格兰阴性小 杆菌 2）粘质沙雷菌 是细菌中最小 者，可用于检查 除菌滤器的除菌 效果（最大炭疽） 3）周鞭毛，除臭 味沙雷菌外均无 荚膜，无芽孢 格兰阴性杆菌， 呈多形性，周鞭 毛 格兰阴性球杆 状，偶有两级染 色，无荚膜， 22~25度有周边 毛，35度无鞭毛 （鼠疫耶尔森无 鞭毛） 培养特征1）需氧或兼性 厌氧； 2）营养要求不 高； 3）选择性培养 基：麦康凯 （Mac.C），S.S, 伊红-美兰 （EMB）1）兼性厌氧 2）营养要求不 高 3）在普通琼脂 和血琼脂平板生 长良好，菌落呈 圆形、湿润、灰 白色、、、 4）在肠道培养 基上能发酵乳糖 产酸 1）兼性需氧 2）营养要求不 高； 3）在SS、Mac 等选择鉴别培养 基上形成中等大 小无色半透明的 S型菌落 1）兼性厌氧 2）营养要求不 高，能在普通培 养基上生长，中 等大小，半透明 的光滑型菌落 3）在肠道杆菌 选择培养基上形 成不分解乳糖的 菌落(宋内氏菌 除外，它迟缓分 解乳糖） 1）在血琼脂上 菌落呈圆形、凸 起、灰白、不溶 血。光亮的大而 粘液菌落，相邻 菌落易于融合， 呈粘液状，用接 种环可拉起长丝 （拉丝实验） 2）在MAC上多 数形成发酵乳糖 产酸的红色菌落 室温下可产生脂 溶性或水溶性色 素，菌落呈粉红 色，红色 1，点种在营养/ 血琼脂培养基上 可迅速生长弥漫 成同心圆形波纹 状薄膜，布满培 养基表面，称迁 徙生长。可悲胆 盐，式碳酸，苯 酚等抑制。 2）在肠道选择鉴 别培养基上形成 无色透明，乳糖 不发酵的菌落， 产硫化氢的菌落 在SS上菌落中 心呈黑色 1）最适温度 20~28,4度能生 长+ 2）在肠道培养基 （如MAC）呈无 色，半透明，较 小的不发酵乳糖 型菌落 生化反应+ 1）活泼，能分解 多种糖；葡萄糖， O/F F 2）氧化酶（-）1）氧化酶阴性， 硝酸盐还原阳性 2)活泼，能分解 多种糖产气；分 1）分解葡萄糖 产酸，多数产气 2）不分解乳糖 3）H2S(+) 赖/鸟 1）分解葡萄糖， 产酸不产气 2）不分解乳糖， 宋内氏志贺菌能 1）葡萄糖酸盐 阳性，本病氨酸 脱羧酶阴性 2）分解葡萄糖 1）葡萄糖酸盐 阳性，苯丙氨酸 脱羧酶阴性 2）分解葡萄糖 1）苯丙氨酸脱 羧酶阳性，葡萄 糖酸盐阴性 2）H2S阳，乳糖 1）生化反应特 征不稳定，分解 葡萄糖产酸不产 气
肠道微生物体外模型研究进展 随着分子微生态学，特别是高通量测序技术的发展，人类对肠道微生物的作用有了新的突破性认识。我们现在了解到人体和动物消化道系统中生长着大量的细菌，肠道中细菌的总数量甚至高出人体细胞总数的十倍。肠道微生物的菌群多样性受到多种因素的影响。其中环境和宿主的遗传背景在决定肠道菌群结构和组成方面各自起到50% 的作用。而且由于外部环境在肠道菌群结构形成过程中的巨大影响，个体之间肠道菌群结构和组成极为不同。目前的研究证明只有极少数的细菌存在于大多数人的肠道中。而个人之间菌群结构的不同反过来又直接影响到宿主的免疫系统发育和营养物质的吸收，甚至和自身免疫性疾病的产生相关。肠道微生物现在认为是人体的一个新“器官”。而肠道微生物生态的研究近十年来也受到了广泛的重视。但是肠道微生物研究存在的重要的瓶颈在于样品的采集。对正常人来说，除了收集粪便之外，小肠、升结肠、横结肠等部位的取样几乎不现实。另一方面，由于肠道细菌受到外部环境和宿主肠道环境的双重影响，如何区分外部环境和肠道内环境对肠道菌群的作用变得十分重要。所以，建立合理而易操作的体外模型对推动肠道微生态学、人体和动物营养学的发展非常有意义。本文就国内外目前经常使用的用于肠道微生态研究的体外肠道模型做一简单介绍。 体外肠道模型的发展 1 静止发酵或罐批量培养模型此模型为最原始、最简单的体外发酵模型。该发酵在小瓶子中或者pH 控制的批量发酵罐中进行。具体做法为在批量发酵罐中接入动物肠内容物或人粪便菌群的悬浮液，培养基中含有不同的待测碳水化合物或蛋白质，整个发酵过程在充满氮气或二氧化碳的下进行。该模型简单、易操作，可以同时对多种底物进行比较，所以用于对碳水化合物的初步筛选。缺点是只能用于短期的发酵研究，因为培养物内pH 和营养物水平变化很快群的改变导致该模型对肠道环境的模拟效果不理想。而且，由于死亡的细菌不能及时从发酵系统中清理出去，如果采用分子生态学的检测手段，如荧光定量PCR 或FISH 等方法无法区别死亡细菌还是活细菌，所以该模型不适用于使用16S rRNA 的分子生态学实验手段来测定菌群的变化，使用范围有比较大的局限性。但常规微生态学手段，如采用选择性培养基培养活细菌的方法还是能够测定菌群变化的。由于24 h 之后培养基中养分已被大量消耗，而发酵终产物不断累积，长时间培养结果离肠道实际内环境偏差很大。GIBSON 和FULLER 报道用此模型进行研究在48 h 内结果还是比较稳定可靠. 2 连续发酵培养系统食糜在人体和大部分单胃动物消化系统中按照口到肛门的单方向流动，所以肠道细菌在单胃动物肠道中的发酵可以看做是一种恒温连续发酵的过程。发酵工艺中连续发酵的特点和肠道发酵特点比较接近，所以通过恒化连续发酵工艺从理论上可以模拟肠道细菌发酵的自然过程。COATES 等首先设计了连续发酵培养系统，在这个系统中可以连续的加入新鲜培养基同时移除使用过的废液。随着设计工艺和制造技术的不断发展，研究人员已经可以在体外控制这个连续培养系统的pH、温度、氧化还原能和营养状态等，来控制发酵罐中细菌的数量与菌群结。最原始的连续培养是单相连续发酵模型。但由于大肠环境的复杂性及不同肠道位置的解剖结构和环境存在差异，单相连续发酵模型的局限性越来越明显，继而GIBSON 和MACFARLAN 等根据人体结肠的生理特点建立了三相连续发酵模型，同时通过比较该群的结构特点和突然死亡的人体肠道菌群的生理生化指标之间的相关性，对该模型的可靠性进行了验证。研究结果表明三相连续发酵模型能较好的模拟各个肠道解剖位置，即升结肠、横结肠和降结肠环境中肠道菌群的实际结构。现在常用的三相连续发酵系统由三个发酵瓶V1、V2 和V 3 串联而组成，它们各自的容积分别为0．22、0．32 和0．32 升，分别代表升结肠、横结肠和降结肠的生理位置。根据人体肠道不同解剖位置的实际生理特点，三个罐的pH 分别控制在5．5、6．2 和6．8，整体温度控制在37 ℃。每个发酵瓶都用磁力搅拌器以一定速度进行搅拌以混匀培养基，同时充入无氧氮气，以维持发酵瓶的厌氧环境。如图 1 所示，培养基从培养瓶依次流入V1，再从V1 流入V2，V2 流入V3，最后从V3 流入废液罐中。其营养物质的流向和人体结肠中营养物质的流同。连续培养模型目前广泛应用在肠道细菌的生理、生化研究 1．3 人类肠道微生态模拟器由于三相连续发酵模型仅仅模拟了人体结肠部位的肠道微生物小肠的微生物。1993 年MOLLY 等设计了一个五相反应器，命名为人类肠道微生态模拟器。该模拟系统被认为能够全方位，更好的的模拟人体肠道内的微环境。如图 2 所示，该系统温度仍然保持在37 ℃。其中Vessel l 模拟的是胃环境，反应体积是0．2 L，保留时间为 2 h，pH 控制在2．0 ～2．5。1．3 人类肠道微生态模拟器由于三相连续发酵模型仅仅模拟了人体结肠部位的肠道微生物生态过程，没有涉及胃和 Vessel 2 系统模拟小肠部位，反应体积为0．3 L，保留时间为6 h，pH 控制在5．0 ～6．0。Vessel 3、Vessel 4、Vessel 5 三相反应系统模拟升结肠、横结肠、降结肠部位，反应体积分别是．7、1．3、