氧化还原酶
定义及分类
氧化还原酶是一类催化物质进行氧化还原反应的酶类，被氧化的底物就是氢或电子供体，这类酶都需要辅助因子参与。
氧化还原酶是已知酶类中最大的一类，按习惯分类法，这类酶可分成：脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶和加氧酶四类。脱氢酶的受氢体绝大部分是尼克酰胺二核苷酸（磷酸），作为辅助因子的尼克酰胺核苷酸有两种：NAD+和NADP+；氧化酶以氧分子为受氢体，所以又称为需氧脱氢酶，这类酶常需要黄素核苷酸(FMH 或FAD)为辅酶，且结合紧密，故又称黄素蛋白；过氧化物酶常以黄素FAD、血红素为辅基担负H2O2与过氧化物的分解与转化，催化以H2O2为氧化剂的氧化还原反应；加氧酶常伴随羟基形成，故又称为羟化酶，根据反应体系中氢供体数目又分为两个亚类：单加氧酶和双加氧酶。
应用及限制
氧化还原酶在生物体内的氧化产能、解毒和形成生理活性物质等方面发挥着很重要的作用。在生物体外，这类酶可作为生物催化剂用于生产有机酸、氨基酸、类固醇或手性内脂等化合物，尤其是在手性药物、功能性高分子聚合物的合成方面应用非常广泛，其中羰基的不对称还原是生物催化中最活跃的领域之一。
但是，在氧化还原酶的应用进程中一直有一个难以解决的问题，就是辅酶循环使用的问题。辅酶一般不稳定，价格昂贵，而且不能用一般的合成物代替。因此辅酶循环使用是大规模工业化生产的瓶颈因素，多年来人们一直致力于辅酶再生利用的研究和开发。
目前，已经开发出了底物偶联法、酶偶联法、人工电子传递体等辅酶再生方法。但是，这些方法不够完善，使用中都有目前还不能解决的问题，例如底物偶联法，虽然辅酶再生系统使用简单，但是酶要同时作用于底物和辅助底物，酶的催化效率必然降低，高浓度的辅助底物还会抑制酶活性。
此外，通过人工合成得到各种辅酶的结构类似物也是解决辅酶问题的一个有效途径，这些辅酶类似物的合成较为便利且具有辅酶活性，可部分的用于替代价格昂贵的辅酶参与氧化还原反应。例如，尚科生物利用化学酶法制备的NAD+可完全替代商品化的NAD+使用，但价格相对要低很多，很有应用前景。
货号：MS1110 规格：100管/96样 硫氧还蛋白氧化还原酶 （thioredoxin reductase,TrxR）试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。 测定原理： TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412nm有特征吸收峰，通过测定412nm波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。 试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。 粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 TrxR 测定操作： 1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412nm，用蒸馏水调零。 2. 试剂一在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热30min。 3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL试剂二，20μL试剂三，160μL试剂一， 迅速混匀后于412nm 测定10s和310s吸光度，记为A1和A2。△A空白管=A2-A1。 4. 测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL试剂二，20μL试剂三，140μL试剂一， 20μL上清液，迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A3和A4。△A 测定管=A4-A3。注意：空白管只需测定一次。 TrxR 活性计算公式： (1). 按蛋白浓度计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。 TrxR（nmol/min/mg prot）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T = 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷Cpr 第1页，共2页
货号：QS1111 规格：50管/48样 谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GR）活性测定试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。 测定原理： GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340 nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水 试剂组成和配置： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5.0 mL蒸馏水，混匀。 试剂三：液体×1支，4℃保存。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 操作步骤： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）中预热30min。 3. 空白管：取1mL石英比色皿，加入850μL试剂一，100μL试剂二，50μL试剂三，充分混匀，于340nm 处测定10 s和190 s吸光度，记为A空1和A空2，△A空白管= A空1﹣A空2。 4. 测定管：取1mL石英比色皿，加入750μL试剂一，100μL试剂二，100μL上清液，50μL 试剂三，充分混匀，于340nm测定10 s和190 s吸光度，记为A测1和A测2，△A测定管= A 测1﹣A测2。 注意：空白管只需要测定一次。 计算公式： 第1页，共2页
醌氧化还原介质对厌氧氨氧化生物活性的影响 锦集 RMS 通过厌氧氨氧化生物抑制TN的去除性能 RMs 可以显著提高厌氧氨氧化菌关键酶的活性 RMs是推断发挥作用的Q/QH2在厌氧氨氧化过程 作为主要的原因，可能会阻止ladderane RMs 和关键酶之间的联系 文章信息 1.文章历史 2013年9月修订 2013年10月31日修订编版 2013年11月1日被接受 2013年11月10日在网上发布 2.关键词 厌氧氨氧化 氧化还原介质 肼脱氢酶 亚硝酸盐还原酶
硝酸还原酶 3.摘要 本研究首先探讨厌氧氨氧化生物/关键酶和醌的氧化还原介质之间的活动关系，其中蒽醌-2,6-二磺酸（AQDS），2-羟基-1,4- napthoqui-无（LAW）和蒽醌-2-羧酸（AQC）。实验结果表明，总脱氮性能随三种氧化还原介质（RMS）用量的增加而呈下降趋势。例如，当AQC增加到0.8毫米，TN的去除率急剧减少到17.2mg-N/gVSS/h，只能控制大约20%。这种现象可能是微生物中毒与细胞外的RM增加而引起的。然而，粗肼脱氢酶，亚硝酸盐还原酶，和硝酸还原酶的活性增强比没有RMS的对照实验约0.6-3倍。RMS被推断在厌氧氨氧化过程中发挥辅酶/泛醌（Q/QH2）作用。此外，具体ladderane 膜结构可以阻隔RMS和厌氧氨氧化膜内的关键酶。主要原因可能是RMS 对厌氧氨氧化生物和关键酶的反向影响。 1.简介 厌氧氨氧化（ANAMMOX）现在被确认为是一种新颖的重要的生物脱氮工艺。它可以在厌氧条件下将NH4与NO2直接转化成N2（Strouset等人，1999）。与传统工艺相比（硝化反硝化生物），厌氧氨氧化过程提供了显著的优点，如对氧气和有机碳，低污泥产量和减少CO2和NO2的排放（Opden Campet等人，2006）。近日，唐等人（2010）报告了一个高达74.3-76.7 kg-N/m3/d的脱氮率在一个实验室规模的厌氧氨氧化UASB反应器，在废水生物脱氮的厌氧氨氧化工艺的高电位。然而，如此高的脱氮率（NRR）是通过连续添加厌氧氨氧化污泥到目标反应器，其中生物量浓度的增加高达42-57.7VSS/L（唐等人，2010）。此外，厌氧氨氧化菌相对长的培养
生物氧化与氧化磷酸化 一、选择题 1．生物氧化的底物是： A、无机离子 B、蛋白质 C、核酸 D、小分子有机物 2．除了哪一种化合物外，下列化合物都含有高能键？ A、磷酸烯醇式丙酮酸 B、磷酸肌酸 C、ADP D、G-6-P E、1,3-二磷酸甘油酸 3．下列哪一种氧化还原体系的氧化还原电位最大？ A、延胡羧酸→丙酮酸 B、CoQ(氧化型) →CoQ(还原型) C、Cyta Fe2+→Cyta Fe3+ D、Cytb Fe3+→Cytb Fe2+ E、NAD+→NADH 4．呼吸链的电子传递体中，有一组分不是蛋白质而是脂质，这就是： A、NAD+ B、FMN C、FE、S D、CoQ E、Cyt 5．2,4－二硝基苯酚抑制细胞的功能,可能是由于阻断下列哪一种生化作用而引起? A、NADH脱氢酶的作用 B、电子传递过程 C、氧化磷酸化 D、三羧酸循环 E、以上都不是 6．当电子通过呼吸链传递给氧被CN-抑制后，这时偶联磷酸化： A、在部位1进行 B、在部位2 进行 C、部位1、2仍可进行 D、在部位1、2、3都可进行 E、在部位1、2、3都不能进行，呼吸链中断7．呼吸链的各细胞色素在电子传递中的排列顺序是： A、c1→b→c→aa3→O2 B、c→c1→b→aa3→O2 C、c1→c→b→aa3→O2 D、b→c1→c→aa3→O2 8．在呼吸链中，将复合物I、复合物II与细胞色素系统连接起来的物质是什么？ A、FMN B、Fe·S蛋白 C、CoQ D、Cytb 9．下述那种物质专一的抑制F0因子？ A、鱼藤酮 B、抗霉素A C、寡霉素 D、苍术苷 10．下列各种酶中，不属于植物线粒体电子传递系统的为： A、内膜外侧NADH：泛醌氧化还原酶 B、内膜内侧对鱼藤酮不敏感NADH脱氢酶 C、抗氰的末端氧化酶 D、a－磷酸甘油脱氢酶 11．下列呼吸链组分中，属于外周蛋白的是： A、NADH脱氢酶 B、辅酶Q C、细胞色素c D、细胞色素a- a3 12．下列哪种物质抑制呼吸链的电子由NADH向辅酶Q的传递： A、抗霉素A B、鱼藤酮 C、一氧化碳 D、硫化氢 13．下列哪个部位不是偶联部位： A、FMN→CoQ B、NADH→FMA C、b→c D、a1a3→O2 14．A TP的合成部位是： A、OSCP B、F1因子 C、F0因子 D、任意部位 15．目前公认的氧化磷酸化理论是： A、化学偶联假说 B、构象偶联假说 C、化学渗透假说 D、中间产物学说16．下列代谢物中氧化时脱下的电子进入FADH2电子传递链的是： A、丙酮酸 B、苹果酸 C、异柠檬酸 D、磷酸甘油 17．下列呼吸链组分中氧化还原电位最高的是： A、FMN B、Cytb C、Cytc D、Cytc1 18．A TP含有几个高能键：
货号：MS1111 规格：100管/96样谷胱甘肽还原酶（GR）活性测定试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。 测定原理： GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸馏水 试剂组成和配置： 试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 2mL 蒸馏水，混匀。 试剂三：液体×1 支，4℃保存。 粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后8000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 操作步骤： 1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）中预热30min。 3. 空白管：取微量石英比色皿或96孔板，加入170μL试剂一，20μL试剂二，10μL试剂三， 于340nm 测定10s和190s吸光度，记为A空1和A空2，△A空白管= A空1﹣A空2。 4. 测定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入150μL试剂一，20μL试剂二，20μL上清液， 10μL试剂三，于340nm测定10s和190s吸光度，记为A测1和A测2，△A测定管=A测1﹣A测2。注意：空白管只需要测定一次。 计算公式： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1). 按蛋白浓度计算 第1页，共3页
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。 酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。 为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。 紫外-可见分光光度法测定酶活： 1. β一半乳糖苷酶 β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。 【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。 【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。 2. 超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。 【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定Sigma公司的SOD标准品，对所测样品SOD 活性进行校正。 【酶活定义】在lml反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个酶活单位，即325nm 0.035OD/min为一个酶活单位。 3. 多酚氧化酶 多酚氧化酶(PPO)是一类由核基因编码在细胞质中合成的含铜质体的金属酶，其作用机理在于铜的氧化-还原作用。大麦中的多酚物质经过PPO的催化氧化后，具有单宁性质，易和蛋白质起交联作用而沉淀出来，进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。大
氧化还原酶的实验方法 1 （1）方法与原理 在空气存在的情况下，多酚氧化酶能酶促一元酚、二元酚或三元酚氧化成醌。以邻苯二 酚氧化成相应的二醌为例， CH(OH)+1/2O?CHO+HO 64226422 (2) 试剂配制 1%邻苯三酚溶液，乙醚，0.5N盐酸，重铬酸钾标准溶液（0.75gKCrO溶于 1L0.5N HCl），227pH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液 标准曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液，用0.5N盐酸稀释成各种不同浓度。定容后，在 分光光度计上于430nm处比色测定。以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。 （3）操作步骤 取1g鲜土（过2mm筛），置于50ml三角瓶中，然后注入10ml1%邻苯三酚溶液，摇荡后放在30。C恒温箱中培养2h。(为了减少误差，建议以下操作在冰盘上进行)取出后加4mlpH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力振荡数次，萃取30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。比色时用波长为430nm的滤光片，为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色液槽一次。 为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食子酚的纯度，需设无基
质的土壤和无土壤的基质作对照。在无基质的土壤对照中，用水代替基质进行培养。 （4）活性表示 紫色没食子素的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。 多酚氧化酶活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克数表示。 2. （1）方法与原理 在空气存在的情况下，多酚氧化酶能酶促一元酚、二元酚或三元酚氧化成醌。以邻苯二 酚氧化成相应的二醌为例， CH(OH)+1/2O?CHO+HO 64226422 (2) 试剂配制 1%邻苯三酚溶液，乙醚，0.5N盐酸，重铬酸钾标准溶液（0.75gKCrO溶于 1L0.5N HCl），227pH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液 0.5%过氧化氢 标准曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液，用0.5N盐酸稀释成各种不同浓度。定容后， 在分光光度计上于430nm处比色测定。以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。 （3）操作步骤。C恒温箱中培养2h。(为了减少误差，建议以下操作在冰盘上进 取1g鲜土（过2mm筛），置于50ml三角瓶中，然后注入10ml1%邻苯三酚溶液和2ml 0.5%行)取出后加4mlpH4.5柠檬酸----磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力振荡数次，萃取30min。
谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase,GR）活性测定试剂盒使用说明 产品简介： GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，通常昆虫中GR被TrxR取代，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR 还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。 GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时不断消耗NADPH；通过测定NADPH减少量，即可测定GR活性。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1ml比色皿、双蒸水 产品内容： 试剂一×1支，充分溶解于100ml双蒸水，4℃保存3个月 试剂二×1支，充分溶解于6ml双蒸水中，4℃保存3个月 试剂三×2支，临用前配制，每支充分溶解于3ml双蒸水中 操作步骤： 一、样品前处理： 取组织约0.1g，加1ml试剂二，冰上充分研磨，10000rpm4℃离心10min，取上清。（如上清不清澈，再离心3min） GR测定操作：
测定前将试剂一于25℃水浴20min 二、测定操作表： 测定管空白管 试剂一0.75ml0.85ml 试剂二0.05ml0.05ml 样本0.1ml/ 试剂三0.1ml0.1ml 迅速混匀，于340nm处测定3min内吸光值变化，第0s吸光值记为A1，第180s吸光值记为A2。 GR活力计算： GR活力单位定义：在25℃，pH8.0条件下，每毫克蛋白每分钟氧化1mmol NADPH的酶量为1U（U/mg prot）。 计算公式： GR酶活(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)/3÷6.22×（V总/V样）×稀释倍数×1000/Cpr=(△A测定管-△A空白管)×535.91×稀释倍数÷Cpr △A=A1-A2，6.22：NADPH的毫摩尔消光系数，V总：反应总体积（ml），V样：所用样品体积（ml），Cpr：蛋白浓度（mg/ml）。 注意事项： （1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；
第三节电子传递与氧化磷酸化 三羧酸循环等呼吸代谢过程中脱下的氢被NAD+或FAD所接受。细胞内的辅酶或辅基数量是有限的，它们必须将氢交给其它受体之后，才能再次接受氢。在需氧生物中，氧气便是这些氢的最终受体。这种有机物在生物活细胞中所进行的一系列传递氢和电子的氧化还原过程，称为生物氧化(biological oxidation)。生物氧化与非生物氧化的化学本质是相同的，都是脱氢、失去电子或与氧直接化合，并产生能量。然而生物氧化与非生物氧化不同，它是在生活细胞内，在常温、常压、接近中性的pH和有水的环境下，在一系列的酶以及中间传递体的共同作用下逐步地完成的，而且能量是逐步释放的。生物氧化过程中释放的能量可被偶联的磷酸化反应所利用，贮存在高能磷酸化合物（如ATP、GTP等）中，以满足需能生理过程的需要。 线粒体中氧化磷酸化反应的一般机理 一、呼吸链的概念和组成 所谓呼吸链(respiratory chain)即呼吸电子传递链(electron transport chain)，是线粒体内膜上由呼吸传递体组成的电子传递总轨道。呼吸链传递体能把代谢物脱下的电子有序地传递给氧，呼吸传递体有两大类：氢传递体与电子传递体。氢传递体包括一些脱氢酶的辅助因子，主要有NAD+、FMN、FAD、UQ等。它们既传递电子，也传递质子；电子传递体包括细胞色素系统和某些黄素蛋白、铁硫蛋白。呼吸
链传递体传递电子的顺序是：代谢物→NAD+→FAD→UQ→细胞色素系统→O2。 呼吸链中五种酶复合体(enzyme complex)的组成结构和功能简要介绍如下(图5-11，5-12)。 图 5-11 植物线粒体内膜上的复合体及其电子传递 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分别代表复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ； UQ库代表存在于线粒体中的泛醌库 1.复合体Ⅰ 又称NADH∶泛醌氧化还原酶(NADH∶ubiquinone oxidoreductase)。分子量700X103～900X103,含有25种不同的蛋白质,包括以黄素单核苷酸(flav in mononucleotide,FMN)为辅基的黄素蛋白和多种铁硫蛋白，如水溶性的铁硫蛋白(iron sulfur protein,IP)、铁硫黄素蛋白(iron sulfur flavoprotein，FP)、泛醌(ubiquinone,UQ)、磷脂(phospholipid)。复合体Ⅰ的功能在于催化位于线粒体基质中由TCA循环产生的NADH＋H+中的2个H+经FMN转运到膜间空间，同时再经过Fe-S将2个电子传递到UQ(又称辅酶Q,CoQ)；UQ再与基质中的H+结合，生成还原型泛醌(ubiquinol,UQH2)。该酶的作用可为鱼藤酮(rotenone)、杀粉蝶菌素A(piericidin A)、巴比妥酸(barbital acid)所抑制。它们都作用于同一区域，都能抑制Fe-S簇的氧化和泛醌的还原。
货号：QS1110 规格：50管/48样硫氧还蛋白氧化还原酶（thioredoxin reductase, TrxR） 活性测定试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。 测定原理： TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412 nm有特征吸收峰，通过测定412nm 波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、低温离心机、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体90mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体5mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5 mL蒸馏水溶解。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 TrxR测定操作： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到412nm，用蒸馏水调零。 2. 试剂一在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热30min。 3. 测定管：取1mL玻璃比色皿，加入100μL试剂二，100μL试剂三，700μL试剂一，100μL 上清液，迅速混匀后于412 nm测定10 s和310 s吸光度，记为A3和A4。△A测定管=A2-A1。 TrxR活性计算公式： (1). 按蛋白浓度计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min /mg prot）=△A测定管÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T = 147×△A测定管÷Cpr (2). 按样本质量计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样本每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min /g鲜重）=△A测定管÷ε÷d×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T 第1页，共2页
对已纯化的偶氮还原酶的研究表明：这些酶均具有个的结合位点：这表明好氧偶氮还原酶均以作为辅酶，将电子传递给偶氮染料（如图）。 进一步的研究发现，在醌类化合物所介导的偶氮还原系统中，偶氮染料不需要穿过细胞膜后被还原，取而代之的是醌类化合物首先被位于细菌细胞膜上的醌氧化还原酶还原，还原后的醌介体再通过纯化学的氧化还原反应来还原培养基中的偶氮化合物。其具体反应途径见图。 由于厌氧条件下的偶氮染料脱色被认为是非特异性的，因此大部分的厌氧脱色细菌均可以使具有不同化学结构的偶氮染料脱色。此外，偶氮染料的分子量大小与染料的脱色效率之间并没有直接关系，这是由于偶氮分子并不需要穿过细胞膜，在细胞内通过特异性的酶促反应来进行降解，而是染料分子可以在细胞外接受通过电子传递链提供的电子而进行还原。另外有报道说，少数的偶氮染料在厌氧降解的过程中可以形成类似于蒽醌类物质的中间化合物，该中间产物可以对染料进行自催化作用，从而显著提高染料的降解效率。
无论在好氧还是厌氧条件下，细菌使偶氮染料降解的第一步都是使染料分子中的偶氮键断裂，从而使染料脱色。细菌可在不同的条件下通过不同的代谢机制打开偶氮键，如：通过还原酶直接催化、利用小分子的介体物质将电子传递至偶氮染料或利用细菌自身代谢所产生的还原性物质将偶氮染料还原。另外，偶氮键断裂的反应在菌体细胞外和细胞内均有可能发生。 另一种理论认为厌氧条件下的偶氮还原过程是非特异性的。偶氮化合物主要是被一些氧化还原的中间体，如：NADH、FAD、蒽化合物等所传递的电子还原。而这些中间体的还原则主要依赖于细胞内不同还原酶的催化。还原性中间体与偶氮化合物发生非特异反应的条件取决于中间体与偶氮染料的氧化还原电势丨。 偶氮染料一般为芳香族化合物，芳香环上的取代基主要为磺酸基或硝基，带有这些基团的偶氮染料可以强烈抵制微生物的好氧降解因此，一般的偶氮还原反应中均避免接触氧气。然而，单纯的厌氧反应只能将染料的偶氮键打开，生成有毒的芳香胺类化合物，因此，目前的研究常在偶氮染料脱色后继续进行好氧降解，从而使中间产物完全矿化。 厌氧生物处理法是指在缺氧、厌氧条件下，利用厌氧微生物将废水中有机物进行降解为无机物的方法。此方法在虽然在去除方面不明显，但是可以很好地提高可生化性。 好氧生物处理法是指废水处理过程中，通过曝气对微生物提供足够用的氧，利用好氧微生物将有机物氧化分解，其中一部分供微生物生长，另一部分分解为二氧化碳、氨气、SO42-、H2O和能量等中间产物。 厌氧好氧组合生物处理方法是首先将废水进行厌氧生物处理法，将难降解的大分子物质水解酸化为小分子物质，提高废水的可生化性，然后在经过好氧生物处理将小分子物质分解去除，最后使有机物浓度降低，达到处理的目的。
第7章氧化还原酶（1）（3学时）主要内容： 一、过氧化物酶 二、多酚氧化酶 一、过氧化物酶（POD peroxidase） 过氧化物酶是存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应。 过氧化物酶是由单一肽链与一个铁卟啉辅基结合构成的血红蛋白。多数植物过氧化物酶与碳水化合物结合成为糖基化蛋白。糖蛋白有避免蛋白酶降解和稳定蛋白构象的作用。 1过氧化物酶作用方式及分布 1.1过氧化物酶作用方式 过氧化物酶（供体：过氧化氢氧化还原酶）催化过氧化氢分解时，同时有氢供体 参加。 H2O2+ AH2 2H 2O+A 1.2过氧化物酶分类 （1）含铁过氧化物酶 ①正铁血红素过氧化物酶：含有正铁血红素川（羟高铁血红素）为辅基，存在于高等植物、动物和微生物中。 ②绿过氧化物酶：绿过氧化物酶的辅基也含有一个铁原卟啉基团，这类酶存在于动物器官和乳中（乳过氧化氢酶）。 （2 ）黄蛋白过氧化物酶：含有黄素腺嘌呤二核苷酸作为辅基，这类酶存在于微生物和动物组织中。 1.3分布： 过氧化氢酶在植物细胞中以两种形式存在：。 ①以可溶形式存在于细胞浆中 ②以结合形式在细胞中与细胞壁或细胞器相结合 辣根是过氧化氢酶最重要的一个来源。辣根中20%的过氧化氢酶（POD）与细胞 壁结合，用2mol/L NaCI（高离子强度）才能提取出来。辣根中过氧化物酶活力为569,000单位/g组织（蘑菇仅240单位/g组织）。 2过氧化物酶在食品加工中的应用 （1）过氧化物酶是果蔬成熟和衰老的指标：如苹果气调贮藏中，过氧化物酶出现两个峰值，一个在呼吸转折（成熟），一个在衰老开始。 （2）过氧化物酶的活力与果蔬产品，特别是非酸性蔬菜在保藏期间形成的不良风味有关。 （3 ）过氧化氢酶属于最耐热的酶类，在果蔬加工中常被当作热处理是否充分的指标。POD的测定方法：方法：将已热处理的原料中抽取样品，横切，随即放入愈创木酚或联苯胺溶液中，然后取出，在切面上滴0.3%H 2O2，数分钟后，用愈创木酚处理的样品变为褐色，联苯胺变为深蓝色，说明过氧化氢酶未被破坏，热处理时间不够，如果均不变色，则表示热处理效果良好。 3过氧化物酶最适pH和最适温度 3.1最适pH 过氧化物酶一般都含有多种同功酶，因此最适pH范围较宽。
北京索莱宝科技有限公司 谷胱甘肽还原酶（GR）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC1160 规格：50T/48S 产品内容： 试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体3mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5.0mL蒸馏水，混匀。 产品说明： GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，GR催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。 GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。自备仪器和用品： 紫外-可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称约0.1g组织，加入1.0mL试剂一，冰上充分研磨，10000rpm4℃离心10min，取上清液，待测。 二、GR测定操作： 1.紫外-可见分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零。 2.试剂一置于25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）中预热30min以上。 3.空白管：取1mL石英比色皿，加入50μL试剂二，100μL试剂三，850μL试剂一，于340nm测定10s 和190s吸光度，记为A空1和A空2。 第1页，共2页
硫氧还蛋白氧化还原酶（thioredoxin reductase,TrxR）活性测定试剂盒使用说明 分光光度法货号：BC1150 规格：50管/48样 产品说明： TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。 TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412nm有特征吸收峰，通过测定412nm波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。 自备仪器和用品： 可见分分光光度计、低温离心机、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。 产品内容： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入5mL蒸馏水溶解。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5mL蒸馏水溶解。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织， 加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待检测。2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建
议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 二、TrxR测定操作： 1.分分光光度计预热30min后，调节波长到412nm，用蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热30min。 3.空白管：取1mL玻璃比色皿，加入100μL试剂二，100μL试剂三，800μL试剂一， 迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A1和A2。△A空白管=A2-A1。 4.测定管：取1mL玻璃比色皿，加入100μL试剂二，100μL试剂三，700μL试剂一， 100μL上清液，迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A3和A4。△A测定管=A4-A3。 三、TrxR活性计算： (1)按蛋白浓度计算 活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmol DTNB还原。 TrxR（U/mg prot）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T =0.147×（△A测定管-△A空白管）÷Cpr (2)按样本质量计算 活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每克样本每分钟催化1μmol DTNB还原。 TrxR（U/g）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T =0.147×（△A测定管-△A空白管）÷W （3）按细胞数量计算 活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟催化1μmol DTNB还原。 TrxR（U/104cell）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V反总÷(细胞数量×V样
货号：MS2700 规格：100管/96样NADPH-细胞色素 C 还原酶（NCR）活性测定试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR作为P450酶系的重要一员，催化氧化型P450还原再生。 测定原理： NCR催化NADPH还原氧化型细胞色素C，还原型细胞色素C在550nm处有特征吸收峰；通过测定550nm吸光度的增加速率，来计算NCR活性。 自备实验用品及仪器： 普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。 试剂组成和配置： 试剂一：粉剂×2瓶，4℃保存。临用前根据用量每瓶加100mL蒸馏水充分溶解。 试剂二：液体×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1管，-20℃保存。临用前配制，加1.04 mL蒸馏水充分溶解，4℃避光保存。 试剂四：粉剂×1管，4℃保存。临用前配制，加1100 μL蒸馏水充分溶解，4℃保存。 粗酶液提取： 1、除去细胞核和线粒体等：称约0.5g组织，加入4℃预冷的1 mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。 2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。 3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1 mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心30min，弃上清液。 4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。 NADPH-细胞色素C还原酶测定操作： 1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到550 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二在37℃水浴中预热30min。 3. 空白管：取微量石英比色皿/96孔板，依次加入10μL蒸馏水、180μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10s和第130s吸光值。△A空白管=A2-A1。 4. 测定管：取微量石英比色皿/96孔板，依次加入10μL提取液、180μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10s和第130s吸光值。△A测定管=A4-A3。 注意：空白管只需做一次。 NCR活性计算公式公式： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 第1页，共2页
氧化还原酶 定义及分类 氧化还原酶是一类催化物质进行氧化还原反应的酶类，被氧化的底物就是氢或电子供体，这类酶都需要辅助因子参与。 氧化还原酶是已知酶类中最大的一类，按习惯分类法，这类酶可分成：脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶和加氧酶四类。脱氢酶的受氢体绝大部分是尼克酰胺二核苷酸（磷酸），作为辅助因子的尼克酰胺核苷酸有两种：NAD+和NADP+；氧化酶以氧分子为受氢体，所以又称为需氧脱氢酶，这类酶常需要黄素核苷酸(FMH 或FAD)为辅酶，且结合紧密，故又称黄素蛋白；过氧化物酶常以黄素FAD、血红素为辅基担负H2O2与过氧化物的分解与转化，催化以H2O2为氧化剂的氧化还原反应；加氧酶常伴随羟基形成，故又称为羟化酶，根据反应体系中氢供体数目又分为两个亚类：单加氧酶和双加氧酶。 应用及限制 氧化还原酶在生物体内的氧化产能、解毒和形成生理活性物质等方面发挥着很重要的作用。在生物体外，这类酶可作为生物催化剂用于生产有机酸、氨基酸、类固醇或手性内脂等化合物，尤其是在手性药物、功能性高分子聚合物的合成方面应用非常广泛，其中羰基的不对称还原是生物催化中最活跃的领域之一。 但是，在氧化还原酶的应用进程中一直有一个难以解决的问题，就是辅酶循环使用的问题。辅酶一般不稳定，价格昂贵，而且不能用一般的合成物代替。因此辅酶循环使用是大规模工业化生产的瓶颈因素，多年来人们一直致力于辅酶再生利用的研究和开发。 目前，已经开发出了底物偶联法、酶偶联法、人工电子传递体等辅酶再生方法。但是，这些方法不够完善，使用中都有目前还不能解决的问题，例如底物偶联法，虽然辅酶再生系统使用简单，但是酶要同时作用于底物和辅助底物，酶的催化效率必然降低，高浓度的辅助底物还会抑制酶活性。 此外，通过人工合成得到各种辅酶的结构类似物也是解决辅酶问题的一个有效途径，这些辅酶类似物的合成较为便利且具有辅酶活性，可部分的用于替代价格昂贵的辅酶参与氧化还原反应。例如，尚科生物利用化学酶法制备的NAD+可完全替代商品化的NAD+使用，但价格相对要低很多，很有应用前景。
几种常用的土壤酶活性意义及测定! a 氧化还原酶类：酶促氧化还原反应。 主要包括脱氢酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶等。 b 水解酶类：酶促各种化合物中分子键的水解和裂解反应。 主要包括蔗糖酶、淀粉酶、脲酶、蛋白酶、磷酸酶等。 c 转移酶类：酶促化学基团的分子间或分子内的转移同时产生化学键的能量传递的反应。 主要包括转氨酶、果聚糖酶、蔗糖酶、转糖苷酶等。 d 裂合酶类：酶促有机化合物的各种化学基在双键处的非水解裂解或加成反应。 包括天门冬氨酸脱羧酶、谷氨酸脱羧酶、色氨酸脱羧酶。 e 合成酶类：酶促伴随有ATP或其它类似三磷酸盐中的焦磷酸键断裂的两分子的化合反应。 f 异构酶类：酶促有机化合物转化成它的异构体的反应。 2.1 土壤脱氢酶活性 土壤脱氢酶属于氧化还原酶系，它自一定的基质中析出氢或氢的供体而进行氧化作用，反映土壤微生物新陈代谢的整体活性，可以作为微生物氧化还原能力的指标，在研究生物动力学中极受人们的重视[10]。 2.2 土壤转化酶活性 转化酶又名蔗糖酶，是广泛存在于土壤中的一个重要的酶，它对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用[6]。 2.4 土壤磷酸酶活性 土壤磷酸酶是催化土壤中磷酸单酯和磷酸二酯水解的酶，它能将有机磷酯水解为无机磷酸[17]，土壤中有机磷是在它的作用下才能转化成可供植物吸收的无机磷[18]。 2.3 土壤脲酶活性 脲酶在土壤酶系研究中是比较深入的，其酶促反应产物氨是植物氮源之一，其活性反映土壤有机态氮向有效态氮的转化能力和土壤无机氮的供应能力[16]。 3 结论 在长期不同施肥处理之后，土壤脱氢酶、转化酶、脲酶及磷酸酶的活性均产生较大的差异，总体上是施肥高于不施肥，施肥处理间从高到低依次是OM（有机肥）、1/2 OM + 1/2 NPK、NPK、NP、PK、NK。同时，脱氢酶活性随着年限的增加逐渐下降，转化酶与磷酸酶的活性趋于增高，而脲酶活性的年际变化规律在不同施肥处理间互不相同。其中，夏季收获小麦后采集的土样的磷酸酶活性明显高于秋季收获玉米后采集的土样的测定结果，说明磷酸酶活性对因环境或管理因素引起的变化较敏感，具有很强的时效性。另外，OM、1/2 OM + 1/2 NPK处理的土壤微生物生物量C、N最高，而施化肥处理中只有NPK处理的微生物生物量N显著高于不施肥对照，其它处理与对照没有显著差异。