DNA甲基化
DNA甲基化（DNAmethylation）是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA 与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
含义：
在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5'端的非编码区，并成簇存在。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活，DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA 向Z-DNA的过渡，由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的原件缩入大沟而不利于转录的起始，导致基因失活。另外，序列特异性甲基化结合蛋白（MBD/MeCP）可与启动子区的甲基化CpG岛结合，阻止转录因子与启动子作用，从而阻抑基因转录过程。
DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG）
结构基因：
含有很多CpG结构，2CpG和2GPC中两个胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化，且两个甲基集团在DNA双链大沟中呈特定三维结构。基因组中
60%～90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。DNA甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点，以及DNA酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。
5位C甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶（C-T转换），由此可能导致基因置换突变，发生碱基错配，如果在细胞分裂过程中不被纠正，就会诱发遗传病或癌症。
酶的分类：
动物中DNA甲基转移酶有两种：
1）DNMT1，持续性DNA甲基转移酶——作用于仅有一条链甲基化的DNA 双链，使其完全甲基化，可参与DNA复制双链中的新合成链的甲基化，DNMT1可能直接与HDAC（组蛋白去乙酰基转移酶)联合作用阻断转录；2）DNMT3a、移酶可能参与细胞生长分化调控，其中DNMT3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用。
去甲基化
有两种方式：1）被动途径：由于核因子NF粘附甲基化的DNA，使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化，从而阻断DNMT1的作用；2）主动途径：是由去甲基酶的作用，将甲基基团移去的过程。在DNA甲基化阻遏基因表达的过程中，甲基化CpG粘附蛋白起着重要作用。虽然甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、AP2、CMycöMyn、NF2KB、Cmyb、Ets，使它们失去结合DNA的功能从而阻断转录，但是，
甲基化CpG粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子（SP1、CTF、YY1）,使它们失活，从而阻断转录。人们已发现5种带有恒定的甲基化DNA结合域（MBD)的甲基化CpG粘附蛋白。其中MECP2、MBD1、MBD2、MBD3参与甲基化有关的转录阻遏；MBD1有糖基转移酶活性，可将T从错配碱基对TöG中移去，MBD4基因的突变还与线粒体不稳定的肿瘤发生有关。在MBD2缺陷的小鼠细胞中，不含MECP1复合物，不能有效阻止甲基化基因的表达。这表明甲基化CpG粘附蛋白在DNA甲基化方式的选择，以及DNA甲基化与组蛋白去乙酰化、染色质重组相互联系中的有重要作用。
哺乳动物一生中DNA甲基化水平经历2次显着变化，第一次发生在受精卵最初几次卵裂中，去甲基化酶清除了DNA分子上几乎所有从亲代遗传来的甲基化标志；第二次发生在胚胎植入子宫时，一种新的甲基化遍布整个基因组，甲基化酶使DNA重新建立一个新的甲基化模式。细胞内新的甲基化模式一旦建成，即可通过甲基化以“甲基化维持”的形式将新的DNA甲基化传递给所有子细胞DNA分子。
1概述
DNA中碱基的化学修饰近年来一直是生命科学领域研究的热点之一。其中，胞嘧啶第5位碳原子上的甲基化动态修饰研究得较为深入。早在上世纪中叶，科学家就发现DNA胞嘧啶可以被甲基化修饰，修饰之后的碱基称为“5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）”，简称为5mC。后来，又陆续发现了发生在同一个碳原子上的其它修饰，并且这些修饰之间可以相互转化（如图1所示）。
图1（本图取自Wu,）
如上图所示，C可以被DNMT（DNA甲基转移酶）转化为5mC，5mC可以被TET（一种DNA去甲基化酶）依次转化为5hmC、5fC、5caC，最后由TDG/BER介导的碱基修复机制重新生成C，完成整个循环。
首先讲一下甲基化的过程，也就是在胞嘧啶的5‘碳原子上面加上一个甲基的过程。甲基化的过程主要是由DNAmethyltransferase也就是DNMT来承担的。在真核生物细胞内，不同的物种之间DNMT的数目和结构稍有不同，但大体上具有一定的同源性（图2）。
图2DNMT（图2摘自Goll,）
人类细胞中的情况和老鼠（Musmusculus）中的情况差不多，也是DNMT1、DNMT2、DNMT3A/B和DNMT3L等构成。其中，DNMT1的功能主要是在DNA复制的时候维持DNA的甲基化，DNMT3A、DNMT3B的功能主要是DNA的从头甲基化，而DNMT3L不具有甲基化功能，它对DNMT3A和DNMT3B的催化活性具有调节作用。
在哺乳动物体细胞染色体当中，有一种序列中CG含量比较高，并且CG
成对出现，我们把这种CG成对密集出现的序列叫做CpG岛。哺乳动物体细胞的DNA胞嘧啶甲基化主要发生在CpG岛当中（这种规律在植物细胞当中不存在，下文讲的主要是动物细胞DNA甲基化）。在动物的某些较为特殊的细胞当中，如卵母细胞、胚胎肝细胞和成熟的神经细胞当中，CpG 岛以外的甲基化现象同样非常显着。不同的细胞甲基化水平千差万别，功能多种多样。
如图3所示：
图3（图3摘自Lister,R.,etal.,,(7271):.）
H1细胞为胚胎干细胞，IMR90细胞为人胚肺成纤维细胞。左图中的上下两个饼图可以看出，在干细胞里面非CpG区域的甲基化水平相对较高。左边的b图可以看出，在OCT4基因附近，CG原件甲基化水平比IMR90低，
而CHG和CHH序列的甲基化水平较高。右图可以看出，总体上来说，干性较强的细胞中，非CG甲基化水平较高。
下图（图4）说明了mCG和mCH与神经细胞生长发育的关系。
图4（图4摘自Lister,R.,etal.,GlobalEpigenomic）
在神经元细胞当中，mCH的含量比非神经元细胞的含量高很多，在人的神经元当中更甚，mCH的占比甚至超过了mCG。左图可以看出mCH和mCG 的分布都有一定的位点特异性。从以上两个例子可以看出，DNA甲基化与细胞的生长发育、基因的选择性表达有着密切的关系。
目前为止，研究较为深入的是CpG岛甲基化，非CpG甲基化的功能和调控我们几乎对其一无所知。人类细胞中大约有28million个CpGs，体细胞的CpG岛有60-80%被甲基化修饰。
2甲基化和去甲基化的机制
DNA甲基化的过程发现较早。具体说来，DNMT3A和DNMT3B，负责denovo methylation，即把原来没有发生甲基化修饰的DNA双链进行修饰。在DNA复制的过程中，由于其半保留复制的特性，新合成的两条双链各有一半保留了模板的甲基化胞嘧啶，而新合成的那另外一条单链则没有被修饰。DNMT1的作用就是去识别DNA中那条被修饰的单链的甲基化位点，
把没有被甲基化修饰的那条新合成的单链进行修饰，故称之为maintenancemethylation。（图5）
图5（来源于;2(1)::parentalinfluenceonthegenome.）
对DNA去甲基化过程的研究则相对来讲起步较晚。其实在很早之前，人们已经能够观察到DNA当中甲基化水平的变化并且成功纯化出了甲基化酶，然而去甲基化相关的蛋白质一直没能发现。正如上图所示，去甲基化一共有两条途径，activedemethylation和passivedemethylation。在DNA合成的过程中，如果DNMT1不能结合到DNA上去，那么合成的DNA当中5mC 的含量便会降低，这种去甲基化的活动是由DNA复制来完成的，因此称为“被动去甲基化”。那么是否存在一些蛋白质能够把5mC变成C，行使“主动”去甲基化功能呢？
2000年前后的数十年时间里，世界各地的科研工作者卯足了劲，都想成为第一个发现去甲基化酶的人，然而，事与愿违，不止一次有人宣称他们发
现了这个去甲基化酶，然而后来事实证明他们是错的。这种情况一直持续到2009年，发表在CNS上的一系列paper宣告了TET去甲基化酶的发现。2009年-2011年的一系列文章表明，DNA主动去甲基化的过程较为复杂，这个过程需要几步反应（图6）：
图6（来自Kohli,）
TET的作用主要是把5mC转化成5hmC，5fC和5caC，此后再经过一些额外的途径将这些中间产物转化为C（TDG-BER蛋白介导的过程）。
研究发现，DNMT1在从头甲基化的过程中也扮演着重要的角色，维持甲基化的过程中DNMT3也发挥了重要的作用；此外，在细胞分裂之前DNA 复制的过程中，甲基化似乎也没有之前认为的被那么精确地保留。2014年，
TrendsinBiochemicalScience杂志上面有人提出了一种“随机DNA甲基化模型”，可以看做是对现行的理论的一些修正（Jeltsch,）。
3DNA甲基化对基因的调控作用
在下目前主要研究一些和肿瘤相关的热点内容。先放两张图：
图7（Jaiswal,S.,etal.,,(26):.）
图8（Genovese,G.,etal.,,(26):.）
上面两张图来自于《新英格兰医学杂志》与2014年同期发表的两篇研究文章。这两张图都很直观，相信有部分朋友仔细研究了一会儿之后就能大概猜到它们在表达什么。这两篇文章的作者不同，但实验技术大体相同，即对大量不同年龄的人群（不管健康状况如何）的外周血细胞进行外显子测序，然后统计其基因突变情况。从统计得到的基因突变的频率可以看出，
大名鼎鼎的TP53竟然排名如此靠后，而排名前列的基因又是我们刚刚提到的与DNA甲基化有着密切关系的基因——DNMT3A和TET2（其实ASXL1也是一个与表观遗传修饰有着非常密切的关系的基因，在此不多介绍）。这些突变不仅在病人当中发现，在正常人当中也占有不小的比例。基因突变的频率越高，就说明携带这种突变的细胞越能在环境的作用下生存下来，而DNMT3A和TET2很有可能是通过改变整个基因组的甲基化水平来影响细胞的恶性转化的，进而说明甲基化对血液系统的疾病的发生和发展的重要性（其实在其它实体瘤中也可以观察到类似的基因突变情况）。
咔咔，这里提一个小问题，看看谁能知道答案ˉ□ˉ：
问题就是，上面讲过，DNMT3A是甲基化酶，而TET2是一种去甲基化酶，按照常理来说两者功能相反——DNMT3A的突变可能导致基因组整体甲基化水平的降低，而TET2的突变则相反会导致基因组整体甲基化水平的升高，可是为什么二者的突变都能导致肿瘤的发生（并且是很重要的突变之一）？
不知道我的表述是否清晰。这真是个很有趣的问题呢！！！（其实在下最近也在思考这个问题，但还是没有一个完美的解释。有能解释此现象者，在下甘愿赠送kindle一个）
上面的问题似乎有点难了，不明白也没有关系，这个例子就是为了说明DNA甲基化的重要性。
很长一段时间以来，人们观察到DNA甲基化水平与基因的表达水平有着一定的关系。首先需要说明的一个问题就是，甲基化的胞嘧啶基因组上的分布有着怎样的规律？
哎呀，这些问题真是很有趣。
这个问题在之前是很难研究的，好在随着测序技术日新月异的发展，研究人员终于有能力从全局的角度对甲基化进行一番探索。
在基因组上的分布
胞嘧啶甲基化可以分成两大类：
?CpG元件的甲基化
即发生在诸如ATAT CG AT这样的序列中C的甲基化。因为C和G两个碱基中间隔着一个磷酸基团，所以称之为“CpG”。
?非CpG元件的甲基化
很遗憾，我们对非CpG元件的甲基化这部分的内容几乎一无所知。
在哺乳动物细胞中的5mC主要集中在CpG上面,并且，在脊椎动物细胞上的CpG频率要明显低于其他动物细胞（如果蝇，图9）。
图9（）
为什么会这样呢这与细胞中的一种叫做AID的酶有关。AID可以把胞嘧啶的氨基去掉（deamination），生成T，造成TG错配，如果该错配没有被
及时修复的话，通过DNA复制会形成碱基对分别为TA和CG的两条链，进而造成C的丢失。该过程主要发生在生殖细胞产生的过程中，由此可以想象，目前细胞内已知的大多数CpG位点在生殖细胞中应该甲基化程度较低，因为只有这样才能逃脱被去氨基的命运。
CpG元件在DNA上的分布也有着一定的规律。人类DNA当中大约有
28million个CpG位点，它们往往成簇出现，而那些CpG较为密集的地方，我们称之为CpG岛（CpGislands，CGIs），所以，CpG甲基化又可以分为两种类型，即CpG岛甲基化和非CpG岛的甲基化。CpG岛的分布也有一定的规律，它们往往位于一些基因的启动子附近（尤其是一些
house-keepinggene），它们可以调控基因的表达：就一般而言，基因启动子区域的CpG岛的甲基化水平越高，该基因的表达水平就相对较低。CpG 除了以CpG岛的形式分布之外，还会零零散散地散布在DNA的各处。基因的序列之中当然也会有CpG出现，而这种以非CpG岛形式出现在基因中的CpG也与基因的表达量有关，一般而言，这种CpG的甲基化程度越高，往往基因的表达水平就越高。
这一段的内容可以用下面的图来表示：
图10（Stirzaker,C.,etal.,Miningcancermethylomes:,(2):.）
图10中上下两块分别画出了两个基因的不同的甲基化状态。A图表示的是在正常细胞中，抑癌基因表达，癌基因被抑制；而在B图中则相反，抑癌
基因被甲基化沉默而癌基因表达水平上升（B图是肿瘤细胞中一些基因甲
基化水平发生改变的典型状况）。除了我提到的启动子和基因序列中的CpG 之外，图中还有一些元件比如enhancer、shore等等，这些区域的甲基化
水平也会影响基因的表达，感兴趣的朋友可以找这篇文章来读，图的下方
已经标明了出处。
当然了，当然，上面所说的DNA甲基化对基因表达的调控都只能用“大体上”这个词来形容，接下来，我们就根据不同情况详细地去看一下。
转录起始点（transcriptionstartsites,TSS）的CGIs甲基化
在体细胞中，CGIs的甲基化水平是比较低的（相对于非CGIS而言）。前面说过，转录起始位点附近的CGIs的甲基化水平和基因的表达水平负相关，
那么，是不是只要这些区域CGIs的甲基化水平较低，基因的表达就一定会被上调呢？
不是这样的。基因表达的调控是个很复杂的过程，不光涉及表观遗传学的范畴，而胞嘧啶甲基化又只是表观遗传学的一个小分支。除了DNA甲基化，还有一些其他的表观遗传学过程比如组蛋白的甲基化和乙酰化等过程同样可以对基因的表达水平产生影响。如果各位对这些表观修饰感兴趣的话可以告诉我，我会抽时间总结一下写给大家。某些基因的启动子区域甲基化程度较低，然而这些基因的组蛋白修饰可能会不利于转录因子的结合，这同样会抑制基因的表达。
尽管如此，在一些需要长时间保持表达抑制的基因的启动子附近的甲基化仍然表现出较高的水平，换句话说，启动子区域CGIs的甲基化是表达受到长时间稳定抑制的基因的标志。比如在女性体细胞中的两条X染色体上，有一条染色体上的基因不会被表达，这些基因的启动子区域的CGIs甲基化程度会比较高。
转录起始点的非CGIs甲基化
有相当一部分基因的启动子区域附近没有CGIs的存在，然而，关于这些基因启动子区域的甲基化的功能目前由于研究地不深入，资料极其匮乏。有些研究证明，这些区域的甲基化程度与基因的表达负相关。
。
结构基因含有很多CPG结构,2CPG和2GPC中两个胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化,且两个甲基集团在DNA双链大沟中呈特定三维结构。基因组中60%～90%的CPG都被甲基化,未甲基化的CPG成簇地组成CPG岛,
位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。DNA甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化,使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点,以及DNA酶的敏感位点,使染色质高度螺旋化,凝缩成团,失去转录活性。5位C甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶,由此可能导致基因置换突变,发生碱基错配:T2G,如果在细胞分裂过程中不被纠正,就会诱发遗传病或癌症,而且,生物体甲基化的方式是稳定的,可遗传的。
DNA甲基转移酶有两种:1)DNMT1,持续性DNA甲基转移酶——作用于仅有一条链甲基化的DNA双链,使其完全甲基化,可参与DNA复制双链中的新合成链的甲基化,DNMT1可能直接与HDAC(组蛋白去乙酰基转移酶)联合作用阻断转录;2)DNMT3a、DNMT3b从头甲基转移酶,它们可甲基化CPG,使其半甲基化,继而全甲基化。从头甲基转移酶可能参与细胞生长分化调控,其中DNMT3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用。
DNA 甲基化与肿瘤 一、DNA甲基化与基因表达 5-甲基胞嘧啶是天然存在的修饰碱基，甲基化的 mCpG ，在DNA 双链中对称出现。哺乳类动物基因组约60 %的表达基因5′端启动子存在未被甲基化的CpG岛,而启动子区域外的CpG岛大都为 mCpG。正常情况下，非活化的X染色体、印迹基因等的启动子区域的CpG岛为甲基化状态，而看家基因的 CpG岛则是去甲基化状态。 DNA 甲基化状态与基因表达呈负相关。其调控作用主要在转录水平抑制基因表达。 DNA甲基化的检测方法 经过亚硫酸盐处理后的DNA中胞嘧啶（C）转变为胸腺嘧啶（T）,但是甲基化的中的CpG二核苷酸C 未转变为T，而无甲基化的CpG二核苷酸则发生这种转变，由此可以推断DNA是否发生甲基化。TATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGG CCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTTAGTAT TGTTTGGTGAAATGGTACGTGTTTATAATTTTAGTTATTTAG GAGGTTGAGGTAGGAGGATTTTTTGAGTTTAGGAGTTTAA GTTTAGTTTGGGTAATATAGTTTAGTGGTTATATTAAAAAA AGTAAAATAGTCGGGCGCGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTA GTATTTTGGGAGGTCGAGGCGGGTGGATTACGAGGTTAGG AGGTTGAGATTATTTTAAGGGCAAT
DNA 甲基化抑制基因转录的分子机制 ①DNA 双螺旋结构的大沟为DNA 与多种转录因子的作用部位，mCpG的甲基化胞嘧啶突入大沟，抑制转录因子的结合而抑制转录。②mCpG 激活阻遏蛋白因子，如DMAP1、TSG101、 Mi2等，通过阻遏蛋白因子的作用抑制转录。③DNA甲基化与组蛋白乙酰化的研究发现，组蛋白H3、H4 的赖氨酸去乙酰化后带负电荷,与带正电荷的DNA 结合更紧密,不利于转录过程中的聚合物解聚，从而抑制基因转录。甲基化的CpG 结合蛋白(MeCPs) 与DNA 的mCpG结合,并与组氨酸去乙酰化酶(HDAC) 形成复合物共同抑制转录。 二、DNA甲基化与肿瘤 以往的研究认为癌基因激活、抑癌基因失活主要是基因突变、缺失导致的DNA 序列改变。在肿瘤研究中，检测到许多肿瘤的重要基因并未发生突变、缺失，基因表达的异常主要通过DNA 甲基化实现。癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化状态，可导致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改变是肿瘤细胞的一个重要特征。 DNA 甲基化状态的改变导致基因结构和功能的异常，与肿瘤发生的关系是近年来研究的热点。 DNA甲基化的异常与基因突变、缺失等基因组异常也有密切的关系
收稿日期：2012-10-04 第一作者：周建生(1988-)，男，硕士生，E-mail: zhoujiansheng0902@https://www.doczj.com/doc/f419113794.html, *通信作者：焦炳华(1962-)，男，博士，教授， E-mail: jiaobh@https://www.doczj.com/doc/f419113794.html, DNA 甲基化/去甲基化与癌症 周建生，杨生生，缪明永，焦炳华* (第二军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，上海 200433) 摘要：DNA 甲基化是真核细胞基因组中常见的可遗传的表观遗传修饰，在调节细胞增殖、分化、个体发育等方面起重要作用，并且DNA 甲基化水平异常与肿瘤的发生发展密切相关。DNA 甲基化及被动去甲基化主要是在DNA 甲基转移酶家族参与下完成的，而DNA 的主动去甲基化机制尚不是很明确。在肿瘤细胞中DNA 的整体甲基化水平显著降低，但抑癌基因的启动子区域却出现高甲基化。目前尽管有DNA 去甲基化药物用于癌症的临床治疗，但药物特异性较差，因而研究特定基因的主动去甲基化机制有助于研发特异性高的药物用于癌症的治疗。 关键词：DNA 甲基化；DNA 去甲基化；癌症；表观遗传治疗 Relationship between DNA methylation/demethylation and cancer ZHOU Jiansheng, YANG Shengsheng, MIAO Mingyong, JIAO Binghua * (Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Sciences, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China) Abstract: DNA methylation, the most common heritable epigenetic marker of eukaryote genome, plays a critical role in cell proliferation, differentiation, and development. Aberrant DNA methylation is correlated with the onset and progression of cancer. It is well accepted that DNA methylation and DNA passive demethylation are mainly catalyzed by the family of DNA methyltransferases. However, the mechanism of DNA active demethylation is unclear. In cancer cells, the global genomic levels of DNA methylation are lower, but the promoter methylation levels of tumor suppressor genes are higher than in normal tissues. Several demethylating agents have been applied for the clinical treatment of cancer, but these agents are lack of specificity for target genes. So studying the mechanism of active demethylation of specific genes avails the research and development of high-specificity agents for the treatment of cancer.Key words: DNA methylation; DNA demethylation; cancer; epigenetic therapy 表观遗传的概念最初是由Conrad Hal Waddington 于1942年提出的，他认为基因型通过一些偶然的、不确定的机制决定了不同的表现型[1]；1987年Holliday 将这一表观遗传概念用于DNA 甲基化水平改变引起基因表达活性改变现象[2]；现代表观遗传是指在基因的DNA 序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可以遗传的表型。主要的表观遗传标记存在于染色体的不 同水平，包括DNA 和组蛋白修饰、组蛋白多样性、直接结合于DNA 或组蛋白上的染色体非组蛋白修饰、核内RNA(nuclear RNA, nRNA)、染色体高度有序的结构及位置效应等。其中，DNA 甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，参与许多生物过程，包括基因转录调控、转座子沉默、基因印记、X 染色体失活及癌症的发生发展等。本文主要综述DNA 甲基化/去甲基化机制及DNA 甲基化/去
Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond DNA甲基化功能：岛，起始位点，基因体和其他 peter a. jones 摘要 DNA甲基化通常被描述为一个“沉默”的表观遗传标记，的确，5-甲基胞嘧啶的功能最初是在20世纪70年代提出。现在，归功于甲基化绘图的基因组规模的改良，我们可以评估在不同的基因组背景下的DNA甲基化：在基因体上，在调控元件和重复序列上，转录起始位点有或者没有CpG岛。新出现的图片是DNA甲基化功能似乎随背景而改变，DNA甲基化和转录的关系比我们最先认识到的更为微妙。有必要提高我们对DNA甲基化的功能的理解，为了解释这个疾病标记中观察到的变化，比如癌症。 两篇重要的文章在1975年分别表示胞嘧啶残基的甲基化在CpG二核苷酸背景中能作为表观遗传标记。这些文章提出序列可以被重新甲基化，即甲基化通过一种机制的体细胞分裂能够被遗传，包括一种能识别半甲基化CpG回文的酶，甲基基团的存在，可以由DNA结合蛋白和DNA甲基化直接沉默基因解释。虽然这些关键原则中的几个被证明是正确的，解开DNA甲基化与基因沉默的关系已被证明是具有挑战性的。 在CpG序列背景下，在动物身上的大部分工作都集中在5-甲基胞嘧啶（5mC）。据报道，在哺乳动物的其他序列的甲基化广泛分布在植物和一些真菌中。在哺乳动物中，非CpG甲基化的功能目前未知。在这里我主要集中在哺乳动物基因组中的CpG甲基化，包括在其他动物和植物中观察到的差异的讨论。 理解DNA甲基化的功能需要通过基因组考虑甲基化的分布。超过一半的基因脊椎动物的基因组包含短（约1 kb）CpG丰富的区域称为CpG岛（CGIS），其余的基因组因为CpGs而耗尽。当5mC通过自发或酶胸腺嘧啶脱氨基作用被转换成胸腺嘧啶，认为基因组的损失是由于甲基化的序列在种族中的脱氨基；认为CGI存在是因为他们可能是从来没有或只有瞬时甲基化。然而，有很多关于准确定义CGI是什么的讨论，虽然在
DNA甲基化概述 在哺乳动物基因组中，甲基化是一种表观遗传机制，包括将甲基转移到胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通过招募参与基因抑制的蛋白或通过抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达。在发育过程中，DNA甲基化的模式在基因组中发生变化，这是DNA从头甲基化和去甲基化的动态过程的结果。 DNA甲基化是被一个甲基转移酶家族所催化，转移S腺苷甲硫氨酸(SAM)的一个甲基到第五个碳胞嘧啶残基形成5mc , Dnmt3a和Dnmt3b可以建立一个新的DNA甲基化模式来去修饰DNA，被称为从头甲基化。另一方面，Dnmt1在DNA复制过程中起作用，将亲代DNA链上的甲基化模式复制到新合成的子链上。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。当细胞到达终末分化时，Dnmt的表达大大降低。这似乎表明有丝分裂后细胞的DNA甲基化模式是稳定的。 大部分DNA的甲基化发生在鸟嘌呤核苷酸或CpG位点之前的胞嘧啶上。总的来说，哺乳动物基因组中CpG位点的减少可能是由于5 - mc可脱氨成胸腺嘧啶的诱变潜力。剩余的CpG位点分布在整个基因组中，除了CpG岛外，它们都被严重甲基化。DNA甲基化对沉默逆转录病毒分子、调节组织特异性基因表达、基因印记和X染色体失活至关重要。不同基因组区域的DNA甲基化可能根据潜在的遗传序列对基因活动产生不同的影响。 一、DNA甲基化的位置 1.1 基因间区 大约45%的哺乳动物基因组由转座因子和病毒因子组成，这些因子被大量甲基化而沉默。这些元素中的绝大多数是通过DNA甲基化或随着时间的推移由于5mC的破坏而产生的突变而失活的。如果表达，这些元素是潜在的有害的，因为它们的复制和插入可以导致基因损坏和DNA突变。胞内颗粒(IAP)是小鼠基因组中最具侵袭性的逆转录病毒之一。在整个生命过程中，IAP在配子形成、发育和成年阶段都被高度甲基化。甚至在胚胎内部，当基因组其余部分相对低甲基化时，Dnmtl维持对IAP元件的抑制。当Dnmtl被基因突变耗尽，导致广泛的低甲基化时，IAP元素被表达。这表明，在基因间区，DNA甲基化的主要作用之一是抑制潜在有害基因元素的表达。 1.2 CpG岛 CpG岛是大约1000个碱基对长度的DNA延伸，它们的CpG密度比基因组的其他部分高，但通常不会甲基化。大多数基因启动子，大约70%，在CpG岛。特别是，管家基因的启动子常常嵌入到CpG岛。CpG岛，尤其是那些与启动子相关的基因在小鼠和人类之间高度保守。在整个进化过程中，CpG岛屿的位置和保存意味着这些区域具有重要的功能。 CpG岛通过调控染色质结构和转录因子的结合来促进基因表达。DNA有规律地包裹在组蛋白周围，形成被称为核小体的小段。DNA与组蛋白的联系越紧密，对基因表达的宽容程度就越低。CpG岛的一个共同特征是，它们比其他DNA片段包含更少的核团。与CpG 岛相关的少数核小体常含有组蛋白，其修饰涉及增强基因表达。尽管约50%的CpG岛包含已知的转录起始位点，但CpG岛往往缺乏常见的启动子元件，如TATA boxes 。由于许多转录因子结合位点富含GC, CpG岛可能会增强对转录起始位点的结合。CpG岛虽然缺乏共同的启动子元件，但却能增强DNA的可达性，促进转录因子的结合。 CpG岛的甲基化导致了稳定的基因表达沉默。在配子发生和胚胎早期发育期间，CpG 岛经历了差异甲基化。通过CpG岛调控基因表达的甲基化能力对建立很重要。印迹基因仅由两个遗传亲本染色体中的一个表达，它们的表达由遗传亲本决定。除了印迹基因外，CpG
DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。 近15年来，人们越来越认识到DNA甲基化研究的重要性，开发出一系列检测DNA的方法。根据研究目的这些方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。 DNA甲基化的分析方法很多，可分为总基因组甲基化的检测和单基因序列特异性甲基化分析的研究。总基因组甲基化的检测又分为全基因组序列特异性甲基化分析和基因组非特异性甲基化水平的研究。前者包括甲基化差异性杂交显示(differential methylation hybridization，DMH)、寡核苷酸微阵列法和基因组限制性酶切扫描法(restriction landmarkgenomescanning，RLGS)；后者包括3H—SAM掺人后液闪检测法和高压液相色谱法。 对单基因序列特异性甲基化分析包括传统的甲基化敏感的限制性内切酶(methylation sensitive restriction endonucleases，MSREs)分析、比较简洁的甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)、全面反映甲基化情况的亚硫酸氢钠变性后测序(bisulfitegenomic sequencing)、甲基化敏感性单核苷酸引物扩增(methylation sensitive single nucleotide primer extension，Ms—SnuPE)、较新颖的甲基化荧光检测(methylight)、结合亚硫酸氢钠变性的限制性酶分析(combined bisulfite restrictionan alysis，COBRA)、酶的区域性甲基化特异性分析(enzymatic regional methylation assay，ERMA)和变性高压液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)。 甲基化敏感的单核苷酸的扩增(Ms—SnuPE) Ms—SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。 先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms—SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms—SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。这样，如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端；若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C／T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况。 甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)法 methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶，目前至少已发现320种。此类酶如在其切割位点中含有一个甲基化碱基，则它们中的绝大多数就不能切割DNA。MSRE法是基于甲基化敏感Ⅱ型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理。用甲基敏感Ⅱ型内切酶及其同工酶(对甲基化不敏感)切割含有一个或多个甲基化CpG序列的片段，然后用DNA印迹法分析。此法
DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION） 实验操作原理及方法 一、实验目的： 通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。 二、实验原理： DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。 DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。 重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。 BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下,将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域,在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系,例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女性侵袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默,基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8],都会导致细胞癌变。 甲基化作用是转录水平上表达调控的基本方式之一。由于宿主细胞基因组DNA中不 同位点的甲基化程度存在某种平衡，并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征，破坏后的结构便成为宿主基因组防御系统识别的信号，使新整合的DNA 序列发生不同程度的甲基化，甲基化基因序列则通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MeCP2)的结合而抑制转录的顺利进行Ⅲo。在拟南芥中发现了DNA甲基化可以导致基因沉默汹埘]。在基因沉默过程中，外源或内源性信号引起部分DNA序列中CpG的甲基化，甲基化CpG结合域蛋白2(MeCP2)结合到甲基化的胞嘧啶上聚集HDACs使组蛋白去乙酰化，该蛋白与去乙酰化的组蛋白通过聚集更多的DNA 甲基转移酶来加强沉默信号，从而引起基因沉默H?。 ?。DNA甲基化对染色质结构和基因表达的作用很可能是通过一组蛋白介导的，这些蛋白可能含有共同的高度保守的甲基化的CpG结合结构域(MBD)L45 J。DNA甲基化在基因印记、x染色体失活、某些疾病的发生发展中发挥重要作用。其直接作用机制可能是CpG岛甲基化干扰了一些转录因子(transcription factor，TF)与基因调控区的结合，使甲基从DNA分子大沟中突出，从而阻止转录 因子与基因相互作用。间接机制可能是由于甲基化DNA与甲基化DNA结合蛋白结合或DNA甲基化改变染色质结构，这2种情况都间接阻碍TF与DNA结合从而抑制转录m1。DNA甲基化一般是通过转录抑制机制来调节特定基因的，具体的机制可能有：5一MeC伸入DNA双螺旋大沟，影响转录因子的结合；序列特异的甲基化DNA结合蛋白(MDBP一1，MDBP一2)与甲基化的启动子序列特异性结合而抑制转录因子与靶序列的结合；甲基化CpG结合蛋白(MeCPl，MeCP2)与甲基化的二核苷酸CpG结合，发挥类似转录抑制蛋白的作用H“。一般DNA甲基化会通过干扰转录因子与识别位点结合和招募组蛋白乙酰转移酶(histon acefltransfeI"SeS，HATs)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)形成辅助阻遏复合体，使基因沉默而抑制其表达，而去甲基化则使沉默的基因重新激活Ⅲ卜 ＤＮＡ甲基化尤其是基因启动子区ＣｐＧ岛的高甲基化，会导致基因表达的下降或沉默。甲基化抑制基因的表达目前认为要有两个方面，一方面甲基化引起的基因结构改变可直接阻碍一些转录因子与其结合位的结合；另一方面可能与一些甲基化
DNA甲基化研究综述 The summarize of the research on DNA methylation 郭文媛 （生物技术 1353227） 摘要：DNA 甲基化是真核生物表观遗传学中一种重要的基因表达调控方式，是一种酶催化的修饰过程。其是在DNA 甲基转移酶催化下，将甲基基团转移到胞嘧啶的5 位碳原子上，使之转变成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程。在人类和其他哺乳动物中，此修饰过程通常发生在5'-CpG-'二核苷酸的胞嘧啶上。大量相关研究表明，DNA 甲基化与人类疾病密切相关。 Abstract:DNA methylation is an important epigenetic regulation of gene expression in eukaryotes．It is a kind of enzyme catalysis modification process: refers to the chemical modification process of DNA methyltransferase catalysis，the transfer of methyl groups onto cytosine carbon atom 5，making them into 5-methyl cytosine．In humans and other mammals，the modification process usually occurs in 5＇CpG -＇dinucleotide cytosine．A large number of relevant studies have shown that DNA methylation is closely related to human diseases． 关键词: DNA 甲基化; 甲基转移酶;表观遗传学; CpG 岛; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b; 基因沉默; DNA甲基化结合蛋白; 人类表观基因组计划 Key words:DNA methylation; Methyltransferase; Epigenetics; CpG island; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b ; Gene Silencing ;MBD; human epigenomeproject 表观遗传学研究的是不改变DNA 的一级结构而改变表型的一种基因表达调控机制，主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色体重构、RNA 干扰等。 DNA甲基化是重要的表观遗传修饰之一，在大多数真核生物中广泛存在。DNA 甲基化水平受到环境、疾病、年龄和性别等因素的影响，处于动态的变化过程中。不同的细胞、组织或个体之间，甚至同一细胞或个体的不同发育时期，其DNA 甲基化状态和程度都可能存有差异。 2003 年10 月，人类表观基因组计划委员会正式宣布投资和启动人类表观基因组计划( human epigenomeproject，HEP) 。HEP 的主要目标是研究人类所有基因在主要组织以及200 多种细胞中正常和疾病状态下的甲基化模式，并在基因组水平绘制不同组织正常和疾病状态时的甲基化变异位点图谱[4]，本文结合2013年至今DNA甲基化研究文献，综述了DNA甲基化分布特点和与疾病关系等方面的研究情况。 1.DNA甲基化 1.1DNA甲基化与DNA去甲基化 DNA 甲基化是表观遗传( Epigenetic) 的一种重要表现方式，指在DNA 甲基转移酶( DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s －腺苷甲硫氨酸( SAM) 为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。 DNA 去甲基化也被称为DNA 甲基化丢失(lossof DNA methylation), 即甲基基团从胞嘧 啶上消失的过程。包含主动去甲基化与被动去甲基化2 种模式。 1.2DNA甲基化分布 DNA 甲基化在生物体内的分布并不是随机的，而是呈现一定的规律性。
DNA甲基化 甲基化检测服务-亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite genomic sequencing PCR, BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠发生脱氨基变为尿嘧啶的原理，用两一特异性引物扩增后测序。测序法克服了只能针对单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测。 甲基特异性的PCR扩增（MS-PCR）示意图 DNA甲基化（英语：DNA methylation） DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。为外遗传编码（epigenetic code）的一部分，是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上：这种5'方向的DNA甲基化方式可见於所有脊椎动物。在人类细胞内，大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生於CpG双核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化则於胚胎干细胞中较为常见。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG（或CpNpG），或是不对称的CpNpNp形式（C与G是碱基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。特定胞嘧碇受甲基化的情形，可利用亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing）方式测定。DNA甲基化可能使基因沉默化，进而使其失去功能。此外，也有一些生物体内不存在DNA甲基化作用。
提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT 这四种碱基的排列顺序中。然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为
表观遗传学 DNA主动去甲基化的Science之路 (中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海 200031) 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)被认为是哺乳动物基因组中除腺嘌呤(adenine)、胸腺嘧啶(thymine)、胞嘧啶(cytosine)及鸟嘌呤(guanine)之外的第五种碱基。它与染色质的另外一种重要组分组蛋白及其翻译后修饰的组合决定了特定基因组区域染色质的结构及基因转录活性，从而形成了一层叠加于碱基序列上的表观遗传信息。胞嘧啶甲基化，也称为DNA甲基化，参与了诸多生物学过程，包括基因印迹、X染色体的失活、基因组稳定性的维持、转座子及逆转录转座子的沉默及组织特异性基因的沉默等[1-2]。 在哺乳动物的个体发育中，DNA甲基化谱式主要经历了两次大规模的重编程过程，一次发生在从受精至着床的早期胚胎发育时期，另一次发生在配子发生过程中[3-4]。这两次重编程都涉及了基因组范围的主动去甲基化反应(global demethylation)。相对于基因组范围内的大规模主动去甲基化，在体细胞中会发生局部的、高度位点特异性的主动去甲基化[5-6]。DNA的去甲基化与DNA甲基化这两个过程相互平衡，维持了DNA甲基化谱式的稳定。任何一方的失调都会导致DNA甲基化谱式的紊乱，进而引起多种神经退行性疾病、免疫系统疾病以及癌症[7-8]。特别是两次基因组范围的主动去甲基化事件对于生命的起始以及生命的传承具有非常重要的意义。 DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase)催化完成，那DNA去甲基化是如何完成的呢？也存在类似于DNA甲基转移酶的DNA去甲基化酶(DNA demethylase)，抑或是其他的机制呢？就此，著名的华人生物学家、美国科学院院士朱健康教授在一篇综述中提出以下几种DNA去甲基化的可能方式(图1) [5]。(1)存在特异性识别并切除5mC的糖苷酶(glycosylase)，切除5mC产生AP 位点(apurinic/apyrimidinic site)，进而启动碱基切除修复途径(base excision repair, BER)，用没有修饰的胞嘧啶取代原有的甲基胞嘧啶，最终完成DNA的去甲基化。(2)存在特异性识别5mC的脱氨酶(deaminase)，通过脱氨作用将5mC转变成胸腺嘧啶，形成G/T错配。进而由识别G/T错配的糖苷酶，如TDG、MBD4等，启动BER途径，完成DNA的去甲基化。(3)通过核苷酸切除修复途径(nucleotide excision repair, NER)切除含有5mC的一段DNA，并用含有未修饰胞嘧啶的同样序列进行替换，进而完成DNA的去甲基化。(4)通过氧化作用将甲基基团氧化成羧基基团，再通过脱羧作用完成DNA去甲基化。 (5)通过水解作用直接将甲基基团去掉。朱健康教授实验室发现在拟南芥中存在着一种由DNA 糖苷酶(DME、DML2、DML3和ROS1等)介导的主动去甲基化机制。ROS1等可以切除5-甲基胞嘧啶，启动碱基切除-修复途径(base excision repair, BER)完成DNA去甲基化[5]。但在哺乳动物中并没有鉴定到这
分子生物学综述 题目：DNA甲基化的研究方法与技术姓名： 班级： 学号：
摘要：DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。 关键字：表观遗传学；DNA甲基化；甲基化研究方法 1 导言 早在1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R. Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断，也就是人们现在比较统一的认识[1]，即在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA甲基化最为常见。其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱，即不同组织与疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱，以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用[2]。DNA甲基化的研究，逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。让我一一介绍现有的大部分DNA甲基化研究方法，并对其相关特性进行简要分析与总结。
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的 表达[3]。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体[4]。 1.2 DNA 甲基化的生物学作用 1.2.1 DNA 甲基化与遗传印记、胚胎发育 DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（Li 等1992年和Okano等1999年）[3]。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions,ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的[4]。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等[5]。
人类基因组单体型图细胞株中与遗传和基因表达变化有关的DNA甲基化模型 摘要 背景：DNA甲基化是参与基因调控和疾病的一种重要表观遗传学机制，但很 少人知道在个体间甲基化机制存在差异。在这，我们从77个图约鲁巴人的人类基因组单体中测量了22,290 CpG二核苷酸的淋巴母细胞系的甲基化水平，同时也使用了全基因组的基因表达和基因型数据。 结果：通过对超过三百万常见的单核苷酸多态性（SNP）位点的甲基化水平关联的分析，我们确定在173个基因的180个CpG双核苷酸位点与附近的单核苷酸多态性（独联体通常在5 KB内）的错误发现率为10％。在迪斯科相互 作用蛋白2的同源基因B（DIP2B，以前推测在DNA甲基化中发挥作用）中发现SNP rs10876043是最有趣的传输信号，全基因范围内的信号与第一组分的甲基化模式是有联系的。而且我们发现在整体信号联系中只有少量的反式作用。正如预期的那样，通过测量的RNA序列，我们发现基因的启动子甲基化和基因表达水平呈负相关关系。最后，发现有一个显着的SNP位点重叠，均与甲基化与基因的表达水平有关。 结论：我们的研究结果显示在个体间的差异在DNA甲基化方面有很强的遗传成 分。此外，丰富的单核苷酸多态性会影响甲基化和基因表达，为共享机制的一小部分的基因提供了证据。 背景：D NA甲基化在真核生物的基因组起着重要的调节作用。甲基化的改变可以影响转录和表型的变化[1]，但DNA甲基化本身的变化根源，现在仍然知之甚少。大量证据确实存在DNA甲基化的个体差异随着年龄的增长[2,3]，组织[4,5]，物种[6]。在哺乳动物中，DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶（转移酶）介导的，是在复制过程中负责重新甲基化和维持甲基化模式。参与合成的甲基化和DNA去甲基化的基因也可以影响甲基化的变化。例如，突变的甲基转移酶DNMT3L[7]和亚甲基四氢酸还原酶MTHFR[8]基因可导致人的血液中DNA低甲基化。这些变化发生在全基因组水平，与遗传变异是不同的，而是有针对性的对基因组区域影响DNA甲基化变异，例如，在H19/IGF2位点的差异性甲基化与遗传多态性有关9]。 最近的证据表明，DNA甲基化的依赖所在基因的序列含量[10?12]。在对家庭与双胞胎甲基化模式的研究中发现有很强的遗传效应，但随机因素和环境因素也有可能发挥重要作用2,14]。最近的工作表明，基因变异可能对所在的甲基化模式有重大影响[5,15-18]，但影响甲基化的遗传变异是何种程度，机制尚不清楚。此外，在DNA甲基化变化的基础上对个体基因表达影响到何种程度，仍然是未知之数。
Hereditas (Beijing) 2014年5月, 36(5): 403―410 https://www.doczj.com/doc/f419113794.html, 综 述 收稿日期: 2014-01-07; 修回日期: 2014-01-27 基金项目:国家自然科学基金项目(编号：30921140311，31261140372)资助 作者简介:邓大君，教授，研究方向：肿瘤病因学和DNA 甲基化研究。E-mail ：dengdajun@https://www.doczj.com/doc/f419113794.html, DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0403 网络出版时间: 2014-3-3 12:41:25 URL: https://www.doczj.com/doc/f419113794.html,/kcms/detail/11.1913.R.20140303.1241.001.html DNA 甲基化和去甲基化的研究现状及思考 邓大君 北京大学肿瘤医院／研究所, 北京 100142 摘要: DNA 甲基化通过调节基因转录、印记、X 染色体灭活和防御外源性遗传物质入侵等, 在细胞分化、胚胎 发育、环境适应和疾病发生发展上发挥重要作用, 是当前表观遗传学研究的热点领域之一。文章介绍了在过去几年中TET 介导的DNA 羟甲基化及其在早期胚胎发育中的作用, DNA 主动去甲基化及其与被动去甲基化的关系, DNA 甲基化建立及其与组蛋白修饰、染色质构象、多梳蛋白和非编码RNA 结合等关系方面的重要研究进展和存在的问题以及DNA 甲基化的转化应用前景。 关键词: DNA 甲基化; 去甲基化; 表观遗传学; 稳态; 转化研究 DNA methylation and demethylation: current status and future per-spective Dajun Deng Peking University Cancer Hospital and Institute , Beijing 100142, China Abstract: DNA methylation plays important roles in cell differentiation, embryonic development, host adaptations to environmental factors, and pathogenesis through regulation of gene transcription and imprinting, X-inactivation, and de-fense of foreign genetic material invasion, is currently one of the hottest research fields on epigenetics. In the past few years, a number of important findings on DNA methylation have been achieved. These findings include discovery of TETs-catalyzed cytosine hydroxymethylation and its functions in the early embryonic development; the relationship be-tween active and passive DNA demethylation; establishment and maintenance of DNA methylation patterns and their asso-ciations with histone modifications, chromatin configuration, polycomb group proteins and non-coding RNA bindings. DNA methylation has become a new potential biomarker and therapy target. Keywords: DNA methylation; demethylation; epigenetics; homeostasis; translational research DNA 甲基化是指DNA 序列中的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)碱基在甲基化转移酶的催化下与甲基发生共价结合, 可在细胞分裂过程中传递给子细胞的表 观遗传现象。由DNA 腺嘌呤甲基化酶(DNA adenine methylase, DAM)催化形成的O 6-甲基腺嘌呤(6mA)是一种CTAG 序列复制后维持甲基化, 在细菌表观