生物技术制药总结
第一章
一、名词解释
生物技术：生物技术是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织，细胞及其组分）的特性和功能，设计具有预期性状的新物种和新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（或品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。
生物技术制药：采用现代生物技术可以人为地创造一些条件，借助某些微生物，植物或动物来生产所需的药品，称为生物技术制药。
技术范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、抗体工程等。
二、知识点
生物技术发展简史：
答：1.传统生物技术阶段：技术特征：酿造技术；特点:自然发酵、全凭经验
２、近代生物技术阶段：技术特征：微生物发酵技术
特点：产品类型多；生产技术要求高；生产设备规模巨大；技术发展速度快。
３、现代生物技术：技术特征：基因工程技术（重组DNA技术）
第二章
一、名词解释
基因工程技术：就是将所要重组的目的基因插入载体拼接，转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
补料分批培养：将种子接入发酵罐中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续的补加新鲜培养基，噬菌体进一步生长的培养方法。
连续培养：将种子接入发酵罐反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。
透析培养：利用膜的半透析原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。
高密度发酵：培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达500gDCW/L。
离子交换层析：离子交换层析是依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
疏水层析：疏水层析是利用蛋白质表面的疏水区域和固定相上疏水基团之间的相互作用力差异，对蛋白组分进行分离的层析方法。
亲和层析：亲和层析是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使结合解除。
凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。
二、简答题
1.基因工程技术生产药物的优点？
答：1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；
2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这
些物质的应用范围；3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；
4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；
5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
2.基因工程技术制药的主要步骤？
答：1）获取目的基因；2）目的基因与运载体结合；3）将目的基因导入受体细胞；4）目的基因的表达和鉴定。
3.化学合成目的基因的先决条件？
答：必须已知其核苷酸排列顺序，或者已知其蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA核苷酸序列。
4.人工合成目的基因的限制有哪些？
答：1）不能合成太长的基因；3）费用较高。
2）由于遗传密码简并性，合成的基因不一定与天然基因完全一致，易造成中性突变；
5.基因工程宿主菌应满足哪些条件？目前应用最广泛的宿主菌有哪些？
答：1）具有高浓度、高产量、高产率；2）不致病、不产生内毒素；3）发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；4）容易进行代谢调控；5）容易进行重组DNA技术；6）产物容易提取纯化。
应用：原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等
真核细胞：酵母、丝状真菌
6.表达载体须具备哪些条件？
答：（1）载体能够独立的复制。
（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
（3）应具有很强的启动子，能为宿主菌的RNA聚合酶所识别。
（4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。
（5）应具有很强的终止子，以使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号
7.真核基因在大肠杆菌的表达形式有哪些？
答：（1）融合蛋白表达方式（2）非融合蛋白表达方式（3）分泌蛋白表达方式
8.表达应用的酵母菌应满足什么条件？
答：（1）菌体生长力要强（2）菌体内源蛋白酶要较弱（3）菌株性能要稳定（4）分泌能力要强
9基因工程菌在发酵过程中，对发酵罐有哪些要求？
答：（1）要提供菌体生长的最适条件； 2 培养过程不得污染、保证纯菌培养；
3培养及消毒过程中不得游离出异物，不能干扰细菌代谢活动
10.离子交换层析的原理？
答：当离子交换剂处于水溶液中时，活性离子可以从活性基因上解离下来，在基质骨架与溶液间自由迁移，并可与溶液间的同性离子，因与活性基因的化学亲和力不同而发生交换，即发生离子交换作用。
11.疏水层析的原理？
答：蛋白质表面多由亲水基团组成，也有一些疏水性较强的疏水区。在高盐浓度时，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，暴露出疏水部位，疏水作用增强，与固定相上的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来。
因此，疏水层析流动相一般为pH6～8盐水溶液，采用高盐上样，低盐洗脱。
12.亲和层析的原理？
答：通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质（也称载体）上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
13.凝胶过滤层析优缺点？
答：优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、不改变样品生物学活性。
缺点：分辨率较低，尤其是相对分子质量相近的分子之间。
第三章动物细胞工程制药
一、名词解释
细胞工程：细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。
悬浮培养：所谓悬浮培养即让细胞自由地悬浮在培养基内生长繁殖。
贴壁培养：贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。
代谢工程：采用基因工程的手段，使工程细胞增加或减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其降低对某些营养物质的需要，减少某些代谢产物的产生和危害，以及控制工程细胞的增值速度和制造产品的能力。
组织工程：将组织或细胞从机体取出，在体外模拟机体体内的生理条件进行培养，使之生存和生长。
二、简答题：
1、动物细胞的生理特点：
答：1 细胞分裂周期长动物细胞分裂所需时间一般为12~48h。
2 细胞生长需贴附于基质，有接触抑制现象
3 二倍体细胞寿命有限（异倍体细胞系寿命长）
4 对生长环境要求敏感
5 培养基要求高
6 合成的蛋白质有修饰（或：动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同）
2、动物细胞培养时加入血清的作用机制：
答：1)提供基本营养物质2)提供激素和各种生长因子
3）提供贴附因子和伸展因子4)对培养中的细胞起到某些保护作用
3、无血清培养基的优点：
答：1 提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响。
2 减少了由血清带来病毒、真菌、和支原体等微生物污染的危险。
3 供应充足、稳定。
4 细胞产品易于纯化。
5 避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性。
6 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于对实验结果的分析。
4、动物细胞大规模培养有哪些：
答：①悬浮培养②贴壁培养③贴壁—悬浮培养，或称假悬浮培养
5、动物细胞悬浮培养的优缺点：
答：该培养方法的优点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验。不足之处是由于细胞体积较小，较难采用灌流培养，因此细胞密度一般较低。
6、动物细胞贴壁培养的的优缺点：
答：优点是适用的细胞种类广（因为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差，这些不足常常成为扩大培养的“瓶颈”。
7、动物细胞包埋成微囊培养的优点：
答：1 包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害。
2 可以获得较高的细胞密度，一般都在107~108 个/ml以上。
3 当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，从而有力图下游产物的纯化。
4 可采用多种生物反应器精心大规模培养，如搅拌罐式生物反应器，气升式反应器等。而包埋法当起颗粒直径较大时，还可采用固定床式生物反应器培养。
8..动物细胞包埋或微囊培养的优点是什么？
答：（1）、包埋在在体内的细胞可以获得保护，避免了剪切力的损害。
（2）、可以获得较高的细胞密度，一般都在10^7~10^8个/ml以上。
（3）、可以使产品浓缩在微囊内，利于下游产物的纯化。
（4）、可以采用多种生物反应器进行大规模培养。
9动物细胞生物反应器的作用是什么？生物反应器应满足那些要求？
答：（1）、作用是给动物细胞的生长代谢提供一个最优化的环境，从而使其在生长代谢过程中产生出最
大量、最优质的所需产物。
（2）、要求如下：生物反应器所用的材料尤其是与培养基、细胞直接接触的材料必须对细胞无毒；生物反应器具有良好的传质、传热和混合的性能。※密封性能好。※能自动监控培养环境，保持质量的均一。※能长期连续运转。※容器内面光滑，无死角。※拆穿、连接和清洁方便，耐高压。※设备成本尽可能底。
10.动物细胞生物反应器的类型有哪些？
答：1、搅拌罐式反应器。2、气升式生物反应器。3、中空纤维式生物反应器。4、透析袋或膜式生物反应器。 5 、固定床或流化床式生物反应器。
第四章
一、名词解释
抗体：由B细胞接受刺激后分化为浆细胞产生能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
免疫球蛋白：具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白称为免疫球蛋白。
凝集反应：在细菌、红细胞等颗粒性抗原中加入相应抗体，在有适量的电解质存在下，能形成肉眼可见的凝集块，故称为凝集反应。
？反向被动血凝实验：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质。将抗HBs吸附其上，若待测样品中含有HBsAG，则发生特异性结合而使血细胞凝集。
二、简答题
1.免疫导向疗法为什么没有成功？从哪些方面可以对单克隆抗体进行改造？
阻碍：A．单克隆抗体的均是鼠源性抗体，应用于人体可内可产生人鼠源抗体，加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5-6h，难以维持有效药物的作用靶组织时间。
B．完整的抗体份子Ig分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。
改造：A．降低单克隆抗体的免疫原性。B．降低单克隆抗体的相对分子质量
（1）人-鼠嵌合抗体：由人抗体的恒定区与鼠源单抗的可变区融合得到。
（2）.改型抗体：把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体
（3）小分子抗体小分子抗体包括：Fab、Fv或ScFv、单域抗体、最小识别单位。这些部位都可以改造
2.单克隆抗体的制备流程及方法。
流程：将有用抗原免疫过的淋巴细胞与骨髓瘤用PEG进行杂交融合
①把融合的细胞在HA T培养基上选择出来。
②将选择后的整合细胞分散，培养成杂交瘤细胞。
③使能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆化。
④杂交瘤细胞抗体的性状的鉴定。
⑤单克隆抗体的大量制备，一是在培养液中大更是繁殖，二是注入纯系小鼠腹腔中大量繁殖。
⑥单克隆抗体的纯化。
制备方法：体内诱生法和体外法。
3.动物体内诱生法制备单克隆抗体的优缺点
答：优点：简单，比较经济，所得单克隆抗体量较多且效价较高，可有效地保存杂交瘤细胞株和分分离已污染的杂菌的杂交瘤细胞株。
缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。
4.鼠源性单克隆抗体改造后的抗体类型及各自的特点？
1.人-鼠嵌合抗体：保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性，但对人免疫原性大幅下降了
2.改型抗体：鼠源性单克隆抗体的互补决定区（CDR区）序列替换人的Ig分子中的CDR序列。基本
消除免疫原性。
3.小分子抗体
a)Fab 将Iｇ的重链在铰链区的C端裂解，获得两个完全相同的抗原结合片段。才铰链区和二硫键相
连。有完整的生双价抗体活性，相对分子质量减少为三分之一，排斥反应也降低，人体内很稳定。
b)Fv 含有L链和Fd链一半的N端可变区。有完整抗体相似的结能力，相对分子质量减少为六分之一
4.单链抗体scFv：单链易改造；体内半衰期短，免疫原性低；稳定性低，重轻链之间的分子间作用力弱；
功能单一，只能与一种抗原特异性结合；亲和力低，稳定性差，体内清除过快。
5.单域抗体：只由一个CDR构成。
5.多功能抗体的优点。
答：具有高亲和力性能，由于具有多个结合价，可同时与细胞膜上相邻的两个或多个靶抗原结合，与肿瘤细胞表面抗原的多价结合有利于肿瘤的影像分析及治疗。
6.有应用价值的多功能抗体应具备有哪些特征。
a)能高选择性，高亲和性地同靶抗原或肿瘤相关抗原结合。
b)在血循环中，与效应细胞或细胞毒触发分子有较低亲和力。
c)应为人源化抗体，最大限度地减少人抗鼠蛋白的排斥反应，使得复给药不受限制。
d)分子应大小适中，既能渗透到肿瘤组织内部，又能保证适当的滞留时间。
7.抗体导向酶-前药疗法中酶和前药有哪些要求？
答：（1）、对酶的要求：活化酶最好来自非哺乳动物，而人体内不存在相应的类似物，以保证高度的特异性。酶还能通过化学交联与单抗结合，在较长的一段时间内保持稳定性和活性。
（2）对前药的要求：前药本身应无活性或活性很低，只能被相应的酶活化为高度扩散性的小分子，以实现在肿瘤组织内的广泛分布和杀伤肿瘤细胞。而且前药还应具有极短的生物半衰期，避免重新进入循环产生非特异性毒性。
第五章：植物细胞工程制药
一、名词解释
植物细胞工程：以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种、制造新品种、加速繁育植物个体或获得有用物质的一门科学或技术。
植物细胞全能性：是指植物体中任何一个具有完整细胞核的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。
植物组织和器官培养：就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
植物的分化：个体发育过程中，细胞在形态、结构和功能上发生改变的过程
脱分化：已分化为组织器官的细胞离体条件下变成未分化的细胞和组织的过程。
再分化：脱分化的愈伤组织再分化形成胚状体或愈伤组织直接分化出器官
植物愈伤组织培养：从植物体的各种组织、器官等外植体，经脱分化而形成的细胞聚集体的培养。
胚胎培养：未成熟或成熟的胚胎的离体培养
分生组织培养：分生组织培养又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。一般仅限于分生组织的顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm。
外植体：指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。
无性繁殖系：无性繁殖系又叫克隆，是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。
变异体：在无性系的培养过程中，有时其局部的组织无论在结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如继续进行选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为“无性系的变异体” 。
突变体：细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为突变体。
植物抗毒素：指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物。
诱导子：指植物抗病过程中诱导植物在防御过程中产生植物抗毒素和引起植物过敏反应的物质。包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子
生物诱导子：植物在防御过程中位对抗微生物感染而产生的的物质。
非生物诱导子：所有不是植物细胞中天然成分单又能触发形成植物抗毒素信号的因子。
内源性诱导子：来自植物细胞的分子，多为植物细胞壁在微生物作用下的降解产物及沉积在细胞壁上的木质素。
外源性诱导子：亦称整诱导子，是指病源微生物在入侵植物时自身被降解的产物及其代谢产物。
生物转化：也称生物催化，是指利用离体培养细胞或器官等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值的生理生化反应，其本质是利用生物体系生身所有产生的酶对外源化合物进行的酶催化反应。
1、次级代谢作用的定义及产物的特征？
答：（1）定义：是由特异蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。
2）产物特征：a：有明显的分类学区域界限。b：其生物合成需在一定的条件下才能发生。
c：缺乏明确的生理功能。d：是生物活动的多余成分。
2、植物细胞培养中细胞团产生的原因？
答：1）、细胞分裂之后没有进行细胞分离。
2）、在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期是，开始分泌黏多糖和蛋白质，或者以其他方式形成粘性表面，从而形成细胞团。
3、植物细胞培养中常用的灭菌剂有哪些？
答：次氯酸钙、次氯酸钠、氯化汞。还有（过氧化氢、溴水、硝酸银、抗生素）
4、细胞的两步培养法各有什么目的？
答：第一步采用适合细胞生长的培养基——生长培养基
第二步采用适合次级代谢产物合成的培养基——生产培养基
前者是为了实现细胞的高生产率，后者获得一定含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或较少的碳源，得到最佳生长。
5、影响植物次级代谢产物产生和累积的因素？
答：1、生物条件：外植体季节休眠等。 2 、物理条件：温度光通气渗透压。
3、化学因素：无机盐、碳源、植物生长剂、维生素、氨基酸、前体。
4、工业培养条件：培养灌类型、通气、培养方法等。
6、植物细胞和微生物相比具有什么的差异？
答：（一）、结构组成：1、细胞壁的组成不同：植物细胞的成分主要是纤维素，微生物的细胞壁主要是由肽聚糖组成。2、植物细胞拥有大的液泡和质体（如叶绿体）。（二）、用于培养时：1、植物细胞对营养的要求较复杂，而微生物要求较简单。2、植物细胞会有有限的分化，而微生物不会。3、由于细胞壁的组成不同，植物细胞在培养时不能搅拌，而微生物可以。
7植物细胞培养的生物反应器类型？
答：1）、机械搅拌生物反应器2）、鼓泡塔生物反应器3）、气升式生物反应器
4)、转鼓式生物反应器5)、固定化生物反应器
8、在植物细胞大规模培养中应综合考虑哪些因素？
1）、供养能力的及气泡分散程度2）、剪切力大小及对细胞的影响3）、高密度培养时培养液的混合程度4）、温度、PH、级营养物浓度的控制能力5）细胞团大小的控制能力。6）易于放大
9、两相培养系统须满足什么条件？
答：添加相无毒，易吸附易溶解。两相易分开，不吸附培养基
第六章
一、名词解释
酶工程：是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术科学，他是从运用的目的出发研究酶.运用，酶的特异性功能并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。
固定化酶：是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。
酶化学修饰：通过主链的切割.剪接和侧链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性。这种运用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术称为酶分子的化学修饰。
固定化细胞：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术，被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。
1.用微生物生产酶制剂的优点：
答：（1）微生物种类多，品种齐全（2）微生物生长繁殖快，生长周期短，产量高（3）培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量（4微生物具有较强的适应性和应变能力
2.优良的产酶菌株应满足哪些要求：
答：1繁殖快，产酶量高，酶的性质应符合使用要求，最好是产生胞外酶的菌，
2不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生有毒物质，
3产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，
4能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养
3.固定化酶的优点：
答：1可以较长时间内多次使用，酶的稳定性高。
2反应后，酶与底物和产物易于分开，易于纯化，产品质量高。
3反应条件易于控制。4酶的利用率高。5比水溶性酶更适合于多酶反应。
4.物理吸附法制备固定化酶的优缺点：
答：优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，固定化过程和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可以再生。
缺点：最适吸附酶量五规律可循，对不同的载体和不同酶的吸附条件不同，吸附量和酶活力不一定成平行关系，同时载体与载体之间结合力不强，酶易于脱落，导致酶活力下降并污染产物。
5.共价结合法制备固定化酶的优点和缺点;
答：酶以共价键结合于载体上即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，
缺点：条件苛刻，操作复杂，而且采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白的高级结构的变化，破坏活性中心，所以往往不能得到比活高的固定化酶，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化
6.酶固定化过程中选择载体的依据以及载体需满足哪些条件：
答：依据：1酶促反应的性质2底物类型3固定化方法
载体需满足的条件：1.固定化过程中不引起酶变反性 2.对酸碱有一定的耐受性3有一定的机械强度
4.有一定的亲水性和良好的稳定性。
5.有一定的疏松网状结构，颗粒均匀。
6.共价结合时具有可活化基团。
7.有耐受酶和微生物细胞的能力。
8.廉价易得。
7.固定化细胞的优点和缺点：
优点：1.无需进行酶的分离纯化。 2.细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高
3.细胞内酶比固定化酶稳定性更高。
4.细胞内酶的辅酶因子可以自动更生。
5.细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应6抗污染能力强。
缺点：1.利用的仅是细胞内酶，而细胞多种酶的存在，会形成不需要的副产物。
2.细胞膜.细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。
3.载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。
8.固定化酶和细胞的生物反应类型：
答：1.间歇式搅拌罐反应器。 2.连续流动脚步罐反应器。 3.填充床反应器。 4.流化床反应器。
5.循环反应器。
6.连续流动脚步罐—超滤膜反应器。
7.其他反应器。
9.有机相中酶催化反应的优点:
答：1.增加流水性地位或产物的溶解度。 2.热力学平衡向合成方向移动。
3.可抑制有水参与的副反应
4.酶不溶于有机介质，易于回收再利用。
5.容易从低沸点的溶解中分离纯化产物。6酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大。
7.无微生物污染。8.能测定某些在水中不能测定的常数。
9.固定化酶的方法简单，可以只沉积在载体表面
第二章生物药物概论 一、生物药物生产原料选择的主要原则、生物药物的特性及种类。 主要原则：有效成分含量高，原料新鲜；来源丰富，易得；原料产地较近；杂质含量少；原料成本低；易提取。 特性：（1）药理学特性：治疗的针对性强；药理学活性高；毒副作用小，营养价值高；生理副作用常有发生。 （2）生产、制备中的特殊性：原料中的有效物质含量低；稳定性差；易腐败；注射用药有特殊要求。 （3）检验上的特殊性：要有理化检验指标，和生物活性检验指标。 分类： 按药物化学本质和化学特性分类：（1）氨基酸及基衍生物类（2）多肽和蛋白质类（3）酶和辅酶类（4）核酸及其降解物和衍生物类（5）糖类（6）脂类（7）细胞生长因子类（8）生物制品类（9）小动物制剂（10）动物器官或组织制剂。 按原料来源分类：（1）人体组织（2）动物组织（3）植物组织（4）微生物（5）海洋生物来源的药物。 按生理功能和用途分类：（1）治疗药物（2）预防药物（3）诊断药物（4）其他。 二、生物药物提取分离制备方法的工艺过程。在对生物药物进行提取操作时，选择提取试剂需注意的问题。 工艺流程：1、生物药物原料的选择、预处理与保存（保存方法： 冷冻法，-40℃；②有机溶剂脱水法；③防腐剂保鲜，多用于液体）。 2、生物药物的提取：（1）生物组织与细胞破碎：磨切法，压力法，反复冻融法，超声波震荡破碎法，自溶法，酶溶法（2）选择合适的溶剂进行提取（考虑提取剂的用量、提取时间、提取次数，注意温度、变性剂等因素）。 3、生物药物的分离纯化：（1）蛋白质类药物的分离纯化：沉淀法，亲和层析法，疏水层析法（2）核酸类药物的分离纯化：提取法，发酵法（3）糖类：沉淀法，离子交换层析法（4）脂类：沉淀法，吸附层析法，离子交换层析法（5）氨基酸类：沉淀法，吸附法，离子交换法。 试剂的选择：1、对所需要提取的活性成分溶出度较高，对杂质较低。2、不破坏活性成分。 3、利于后续预处理。 4、对环境影响较小，有利于回收和处理。 5、对设备要求不高。 6、成本较低。 7、最好对人体无害。 第三章基因工程制药 一、基因工程制药的主要工艺过程。 获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物的分离纯化→质量控制→产品检验包装 二、什么是目的基因？有几种获取方法？用于构建基因工程菌的目的基因应该达到什么要求？ 目的基因既是人们所需要的特定基因，一般也是接受目的基因的细胞或个体原本没有的基因。 获取方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段（4）化学合成法；⑸逆转录（RT）-PCR法合成cDNA。 基本要求:不含多余干扰成分，纯度高；片段大小适合重组操作；结构、序列正确，达到一定数量。
一：选择题 1、酶的主要来源是( C) A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/ 植物细胞与 组织培养 2、所谓“第三代生物技术”是指(A) A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术 3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A) A、大于 B、等于 C、小于 D、无关 4、促红细胞生长素( EPO)基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：( E) A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用 B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定 C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化 5、目前基因治疗最常用的载体是：(B) A、腺病毒 B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒 6、cDNA第一链合成所需的引物是：( D) A、Poly A B、Poly C C、Poly G D、Poly T E、发夹结构 7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达 C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达 D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产 物的功能B、表达产物的产量 C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和(安全性鉴定)。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A. 糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇( PEG)诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相 对分子量大，促进融合率高B、PEG的浓度高，促进融合率高C、PEG 的相对分子量小，促进融合率高D、PEG的最佳相对分子量为 4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物 为糖基化蛋白质B、表达产物存在的部位是在菌体内 C、容易培养，产物提纯简单 D 、表达产物为天然产物 13、人类第一个基因工程药物是：(A) A、人胰岛素 B、重组链激酶 C、促红细胞生成素 D、乙型肝炎疫苗 14、下列不属于加工改造后的抗体是：(C) A、人-鼠嵌合抗体 B、单链抗体C 、鼠源性单克隆抗体D、单域抗体 15、动物细胞培养的条件中，不正确的是：(D)
第一章绪论 填空题 1. 生物技术制药的特征 _高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。 2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是_治疗药物、预防药物、诊断药物。 3. 现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白 质类治疗剂；二是基因药物_______________ ；三是来自动物植物和微生物的天然生物药 物；四是合成与部分合成的生物药物； 4. 生物技术的发展按其技术特征来看，可分为 三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。 5. 生物技术所含的主要技术范畴有基因工程; 细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 选择题 1?生物技术的核心和关键是（A ） A细胞工程B蛋白质工程C酶工程D 基因工程 2. 第三代生物技术（A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围 A基因工程技术B蛋白质工程技术C海 洋生物技术D细胞工程技术 3. 下列哪个产品不是用生物技术生产的（D）A青霉素B淀粉酶C乙醇D氯化钠 4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制 药的特征 A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B 高技术、高投入、低风险、高收益、长周期 C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期 D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期 5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作 A10% B5% C 1% D 7% 名词解释 （2）近代生物技术阶段的技术特征是微生物 发酵技术，所得产品的类型多，不但有菌体的初 级代谢产物、次级代谢产物，还有生物转化和酶 反应等的产品，生产技术要求高、规模巨大，技 术发展速度快。代表产品有青霉素，链霉素，红 霉素等抗生素，氨基酸，工业酶制剂等。 （3）现代生物技术阶段的技术特征是DNA 重 组技术。所得的产品结构复杂，治疗针对性强， 疗效高，不足之处是稳定性差，分离 纯化工艺更复杂。代表产品有胰岛素，干扰素和 疫苗等。 3. 生物技术在制药中有那些应用？ 生物技术应用于制药工业可大量生产廉价的防治 人类重大疾病及疑难症的新型药物，具体体现在 以下几个方面： （1）基因工程制药，利用基因工程技术可生 产岀具有生理活性的肽类和蛋白质类药物，基因 工程疫苗和抗体，还可建立更有效的药物筛选模 型，改良现有发酵菌种，改进生产工艺，提供更 准确的诊断技术和更有效的治疗技术等。随着基 因技术的发展，应用前景会更广阔。 （2）细胞工程和酶工程制药 该技术的发展为现代制药技术提供了更强大的技 术手段，使人类可控制或干预生物体初次生代谢 产物和生物转化等过程，使动植物能更有效的满 足人类健康方面的需求。 （3）发酵工程制药 发酵工程制药的发展主要体现在对传统工艺的改 进，新药的研制和高效菌株的筛选和改造等。 第二章基因工程制药 填空题 1. 基因工 程药物制造的主要步骤是：目的 基因的获得；构建DNA重组体;构建工程菌；目 的基因的表达；产物的分离纯化; 产品的检 验。 1. 生物技术制药 采用现代生物技术可以人为的创 造一些条件，借助某些微生物、 植物或动物来生产所需的医学药 品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物 一般说来，采用DNA重组技术 或其它生物新技术研制的蛋白 质或核酸来药物称为生物技术药 物。 3. 生物药物 生物技术药物是重组产品概念在 医药领域的扩大应用，并与天然 药物、微生物药物、海洋药物和 生物制品一起归类为生物生物药 物。 简答题 1.生物技术药物的特性是什 么？ 生物技术药物的特征是： （1）分子结构复杂 （2）具有种属差异特异性 （3）治疗针对性强、疗效高 （4）稳定性差 （5）免疫原性 （6）基因稳定性 （7）体内半衰期短 （8）受体效应 （9）多效应和网络效应 （10）检验特殊性 2.简述生物技术发展的不同阶段 的技术特征和代表产品？ （1）传统生物技术的技术特征 是酿造技术，所得产品的结构较 为简单，属于微生物的初级代谢 产物。代表产品如酒、醋、乙 醇，乳酸，柠檬酸等。
1. 生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件， 借助某 些微生物、植物或动物来生产所需 的医药品。 2. 抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 3.疫苗：是指将病原微生物(细菌、病毒、真菌、立克次氏体、支 原体、衣原体等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭火或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂。 4.反义核酸：包括反义DNA分子，或由部分RNA和部分DNA形成的RNA-DNA 嵌合分子，以及经高度化学修饰的寡聚核酸类似物。 5.载体分为：质粒载体和λ噬菌体载体。①质粒载体涉及三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点、几种质粒载体（克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体）②λ噬菌体载体：常用于构建基因组文库和cDNA 文库。λ噬菌体载体通常分为插入型载体和置换型载体，插入型载体是指载体中一个酶切位点用于外源DNA的插入，置换型载体是指外源DNA通过置换载体上非必需序列插入载体。 6.目的基因常用的制备方法：化学合成法、PCR法、基因文库法、cDNA 文库法。 7.基因工程药物制造程序：获得目的基因→构建基因工程菌→工程菌大规模培养→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检测→成品加工→成品检测。 8.基因工程菌的培养过程:（1）摇瓶操作：了解工程菌生长的基础条件（温度、pH、培养基组分及C/N），分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响。（2）培养罐操作：确定培养参数、控制方案及顺序。基因工程菌的培养方式:（1）补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。（2)连续培养： 将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后,开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。 两阶段连续培养，控制和优化诱导水平、 稀释率、细胞比生长速率。（3）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养：维持质粒稳定性(5）分批培养:DO-Stat 法： 调节搅拌转速和通气速率控制溶氧在 20%，补料的流加速率是关键。Balanced DO-Stat 法： 控制溶氧、搅拌转速、糖的流加速率，使乙酸维持在低浓度。 控制菌体比生长速率的方法：在最优表达水平获得高密度、高表达。9.基因工程菌发酵工艺的影响因素:（1）培养基的影响（2）接种量的影响（3）温度的影响（4）溶解氧的影响（5）诱导时机的影响（温度、氧、营养）（6）pH的影响（细胞生长期、外蛋白表达期）（7）诱
2018年生物技术制药习题及答案 一、选择填空题 1. 酶的主要来源是什么? 微生物生产。 2. 第三代生物技术是什么? 基因组时代。 3. 基因治疗最常用的载体是什么? 质粒载体和λ噬菌体载体。 4. 促红细胞生长素基因可在大肠杆菌中表达。但不能用大肠杆菌工程菌生产人的促红细胞生产素为什么? 因为大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化, 人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用。 5. 菌体生存所需能量已菌有氧代谢所需能量在什么情况下产生代谢产物乙酸?
菌体生长所需能量 (大于) 菌体有氧代谢所能提供的能量时, 菌体往往会产生代谢副产物乙酸。 6.cDNA 第一链所合成所需的引物是什么? cDNA 第一条链合成所需引物为 PolyT 。 7. 基因工程制药在选择基因表达系统时首先考虑什么? 表达产物的功能。 8. 为了减轻工程菌代谢负荷,提高外源基因表达水平可采取什么措施? 将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段。 9. 根据中国生物制品规定要求,疫苗出厂需要经过哪些检验? 理化检定、安全检定、效力检定。 10. 基因工程药物化学本质是什么? 蛋白质。
11.PEG 诱导细胞融合? PEG 可能与可能与临近膜的水分相结合, 使细胞之间只有微笑空间的水分被 PEG 取代, 从而降低了细胞表面的极性,导致双脂层的不稳定,使细胞膜发生融合。 12. 以大肠杆菌为目的基因表达系统的表达产物,产物位置是什么? 胞内、周质、胞外。 13. 人类第一个基因工程药物是什么? 重组胰岛素。 14. 动物细胞培养的条件是什么? 温度 :哺乳类 37昆虫 25~28, ph7.2~7.4,通氧量:使 co2培养箱,不同动物比例不同。防止污染, 基本营养物质:三大营养物质维生素, 激素, 促细胞生长因子, 渗透压:大多数 260~320。 15. 不属于加工改造抗体的是什么? 单域抗体。 16. 第三代抗体是什么?
生物技术制药要点概括 1.现代生物技术发展大事记： 年代主要发现和进展 1953 Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构 1958 分离得到DNA聚合酶I，并在试管内制得人工DNA 1960 发现mRNA，并阐明了mRNA在蛋白质合成中的作用 1966 破译遗传密码 1967 分离得到DNA连接酶 1970 分离出第一个限制性内切酶 1971 第一次用限制性内切酶和连接酶获得重组DNA 1972 合成了完整了tRNA基因 1974 Boyer和Cohen建立了DNA重组技术 1975 Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术 1976 DNA测序技术诞生 1978 Genentech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1981 第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准使用 1981 第一台商业化生产DNA自动测序仪诞生 1982 用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准 1983 基因工程Ti质粒用于植物转化 1988 PCR（聚合酶链式反应）技术诞生 1990 美国批准第一个体细胞基因治疗方案 1997 英国培育出世界上第一只克隆羊多莉 1998 美国批准艾滋病疫苗进行人体实验 2001 人类基因组草图完成 2003 世界上第一个正式批准的基因治疗药物重组腺病毒-p53注射液在中国上市 2008 人类将表皮细胞激活为干细胞 2.生物技术药物（biopharmaceutics）:广义是是指所有以生物质为原料只去的各种生物活性物质及其人工合成类似物、以及通过现代生物技术制的的药物，狭义指利用生物体、生物组织、细胞及其成分，综合应用化学。生物学和医药学各学科原理和技术方法制得的用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品，而这里特指采用DNA重组技术或其他现代生物技术研制的蛋白质或核算类药物。 3.生物技术药物的四大类型：基因重组药物、基因药物、天然药物、合成的半合成的生物技术药物。 4.生物技术药物的主要特点：剂量小，活性高；分子结构复杂，分子量一般较大；稳定性较差，易失活或分解，体内半衰期短；具有种属特异性；具有免疫原性；分析检验的特殊性。 5.生物技术药物与化学药物的区别：
《生物技术制药》教案 生物技术制药教案 使用专业:生物技术专业 一教学方案 1. 本课程总学时 72 学时(四年制本科生)，其中理论课讲授 54 学时，实验 课 18 学时 2. 本课程注重教学的基础性、先进性和实践性，坚持不懈地进行教学研究和改革，除课堂 教学衔接了其他的相关课程，同时还建立了实验教学体系，努力培养学生分析 问题、解 决问题和科研动手能力，使学生能够适应现代生命科学对高素质人才的需要 3. 本课程采用启发式教学并以多媒体课件辅助教学，通过学生自学、课堂教学及课后辅导 相结合的教学方式开展教学 4. 本课程实践性教学详见实验教学大纲 二课程作业与考核评价 1. 作业 1.1 预习作业:每堂课后布置课后预习作业，并要求做好预习笔记，以培养学 生的自学能力 1.2 课后作业:每堂课后布置书面作业，教师批阅后并给出参考答案，供学生进一步学习思考 1.3 课堂作业:根据需要在课堂安排一定的练习，并当堂讲评，以培养学生解 决问题与分析 问题的能力 2 考核形式与成绩评定
2.1 期末考试采用闭卷考试，占总成绩的70% 2.2 平时小测与作业以书面为主，口试为辅，占总成绩的10% 2.3 实验成绩占总成绩的20% 三教材和学习参考书 1. 教材 夏焕章,熊宗贵.生物技术制药(第2版).高等教育出版社,2006 2. 学习参考书郭勇.生物制药技术(第2版).中国轻工业出版社,2007 G 沃尔什.生物制药学(原著第2版).化学工业出版社,2006 宋航.制药工程专业实验.化学工业出版社, 2005 天津大学.制药工程专业实验指导.化学工业出版社,2005 四本课程考核方式 本课程采用百分制进行考核，其中期末考试成绩占考核分的70%;平时成绩占10%，平时成绩包括课后作业、课堂提问、考勤等;实验占20%。 生物技术教案(章节备课) 学时:2 章节第一章绪论第一讲 教学目的 1. 掌握生物技术制药的基本概念和发展简史和要求 2. 熟悉生物技术的现状和发展趋势 重点重点:生物技术制药、生物技术药物的概念和特征难点难点:生物技术药物的分类、特征 第一节生物技术的发展史,1学时, 1. 生物技术的概念 2. 生物技术的发展简史 第二节生物技术药物,1学时,
1.生物技术制药分为哪些类型？ 生物技术制药分为四大类： （1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。 （2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等 （3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物 （4）合成与部分合成的生物药物 2．生物技术制药具有什么特征？ （1）分子结构复杂 （2）具有种属特异性 （3）治疗针对性强，疗效高 （4）稳定性差 （5）基因稳定性 （6）免疫原性 （7）体内的半衰期短 （8）受体效应 （9）多效性 （10）检验的特殊性 3.生物技术制药中有哪些应用？ 应用主要有： （1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基 因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产 工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物 （2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物 （3）抗体工程制药 （4）酶工程制药 （5）发酵工程制药 4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？ 基因工程药物制造的主要步骤有： ①目的基因的克隆， ②构造DNA重组体， ③构造工程菌， ④目的基因的表达， ⑤外源基因表达产物的分离纯化产品的检验 5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？ （1）外源基因的计量 （2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱 b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成 （3）表达产物的稳定性 （4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件
生物技术制药 第一章绪论 药学一级学科分类：药物化学、药剂学、药理学、药物分析、生药学及微生物与生化药学二级学科 ★生物技术与生物技术药物的概念 生物技术药物的分类 ?按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片) ?按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物 ?按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物 ★生物技术药物的特性 ?理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差 ?药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性 ?生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染 ?质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等) 第二章基因工程制药 蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性 临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验)；药代动力学 真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响 基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH 基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性 基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节 ?上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞 ?下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装 基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞 ?酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端 ?1U核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量?影响限制性内切酶反应的因素： ?DNA样品的纯度： ?DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。 ?酶切反应的温度 ?DNA的分子结构 ?反应缓冲液组成 ?反应时间、反应体积等
第一章绪论 1生物技术是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。 2生物技术的主要内容：P1 基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程 蛋白质工程：运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。 染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。 生化工程：生物反应器及产品的分离、提纯技术。 3生物技术制药采用现代生物技术人为创造条件，借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为 4生物技术药物采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物才能被称为 5生物药物生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为PPT复习题 第二章基因工程制药 1、简述基因工程制药的基本程序。P16 2、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。P15第一段第一行 3、采用哪两种方法来确定目的cDNA克隆？P18（7目的基因cDNA的分离和鉴定 ）①核酸探针杂交法 用层析法或高分辨率电泳技术(蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质，氨基酸测序，按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸，用做探针，与cDNA文库中的每一个克隆杂交。这个方法的关键是分离目的蛋白， ②免疫反应鉴定法（酶联免疫吸附检测） 4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的6个困难。 ①原核基因表达产物多为胞内产物，必须破胞分离，受胞内其它蛋白的干扰，纯化困难； ②原核基因表达产物在细胞内多为不溶性(包含体, inclusion body)，必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性，工艺复杂； ③没有翻译后的加工机制，如糖基化，应用上受到限制； ④产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸，因无加工机制，常造成N-Met冗余，做为药物，容易引起免疫反应； ⑤细菌的内毒素不容易清除； ⑥细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化； 5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性？ 蓝藻：很有前途的药物基因的宿主细胞 ①有内源质粒，美国Wolk实验室已构建1200种人工质粒，可用做基因载体。 ②载体转化蓝藻不需要诱发感受态就可以做到； ③外源基因产物不形成包含体，分离与纯化工艺可以大大被简化； ④可以直接食用，等于直接口服药物 6、结合pBG-2说明选择用于E. coli 细胞宿主中的载体的6项原则。 P23 与pBV220优点类似，原则P22 7、简述基因工程菌中质粒不稳定的两个指标？P32如何计算质粒的稳定性？P33质粒稳定
一、名词解释：每个概念5分，共50分 1. 生物技术制药 生物技术制药是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。 2. 基因表达 基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。 3. 质粒的分裂不稳定 通常将质粒不稳定性分为两类:一类是结构不稳定性,也就是质粒由于碱基突变、缺失、插入等引起的遗传信息变化;另一类是分离不稳定性,指在细胞分裂过程中质粒不能分配到子代细胞中,从而使部分子代细胞不带质粒(即P-细胞)。在连续和分批培养过程中均能观察到此两类现象发生。一般情况下具有质粒的细胞(即P ＋细胞)需要合成较多的DNA、RNA和蛋白质,因此其比生长速率低于P-细胞,从而P-细胞一旦形成能较快速地生长繁殖并占据培养物中的大多数。 4. 补料分批培养 发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。 5. 人-鼠嵌合抗体 嵌合抗体（chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。 6. 悬浮培养 非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。细胞悬浮于培养基中生长或维持。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积就可以子。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。 7. 贴壁培养 也称为细胞贴壁，贴壁后的细胞呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。大多数哺乳动物细胞的培养必须采用这种方法。 8. 固定化酶 不溶于水的酶。是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。 9. 双功能抗体 将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（CTL 细胞、NK 细胞、LAK 细胞）表面分子的抗体（CD3 抗体或CD16 抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。 10. 组织工程 应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 11抗体：由B细胞接受刺激后分化为浆细胞产生的能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
生物技术制药知识点纲要 生物技术制药:采用现代生物技术，借助某些微生物、植物、动物生产药品。 生物技术药物一般来说，采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。 生物药物：生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物.微生物药物.海洋药物和生物制品一起归类为生物药物。 生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程、蛋白质工程、抗体工程等。 基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术； 细胞工程是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件； 发酵工程是生物技术获得最终产品的手段。 生物技术：从广义角度来看，是人类对生物资源（包括微生物、植物、动物）的利用、改造并为人类服务的技术。 第三代生物技术是海洋生物技术 我国科学家承担了人类基因组计划1%的测序工作 现代生物技术包括: ⑴重组DNA技术 ⑵细胞和原生质体融合技术 ⑶酶和细胞的固定化技术 ⑷植物脱毒和快速繁殖技术 ⑸动物和植物细胞的大量培养技术 ⑹动物胚胎工程技术 ⑺现代微生物发酵技术 ⑻现代生物反应工程和分离工程技术 ⑼蛋白质工程技术⑽海洋生物技术 现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几个方面： ①基因操作技术日新月异，不断完善。 ②新技术、新方法一经产生便迅速地通过商业渠道出售专项技术，并在市场上加以应用。 ③基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。 ④新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。 ⑤转基因植物和动物取得重大突破 ⑥现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。 ⑦阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向， ⑧基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。
生物技术制药课后习题 by xx Yua n 1生物技术制药分为哪些类型？ 生物技术制药分为四大类： （1）应用重组DNA技术（包括基因工程技术、蛋白质工程技术）制造的基因重组多肽, 蛋白质类治疗剂。 （2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等 （3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物 4）合成与部分合成的生物药物2、生物技术制药具有什么特征? （1）分子结构复杂 （2）具有种属特异性 （3）治疗针对性强，疗效高 （4）稳定性差 （5）基因稳定性 （6）免疫原性 （7）体内的半衰期短 （8）受体效应 （9）多效性 （10）检验的特殊性 3、生物技术制药中有哪些应用？ 应用主要有： （1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基 因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产 蛋白质类药物 （2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产 物 （3）酶工程制药 （4 ） 发酵工程制药 4、基因工程药物制造的主要程序有哪些？ 基因工程药物制造的主要步骤有： 目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验 5、影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些? （1）外源基因的计量 （2）外源基因的表达效率： a、启动子的强弱
b、核糖体的结合位点 c、S D序列和起始密码的间距 d、密码子组成 （3）表达产物的稳定性 （4）细胞的代谢付荷 （5）工程菌的培养条件 6、质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？ 质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。 提高质粒稳定性的方法如下： （1）选择合适的宿主细菌 2）选择合适的载体 （3）选择压力 （4）分阶段控制培养 （5）控制培养条件 （6）固定化 7、影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数? 影响因素： (1)培养基 (2)接种量 (3)温度 (4) 溶解氧 (5) 诱导时机的影响 (6) 诱导表达程序 (7) PH值 &什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？ 高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH（4）温度（5）代谢副产物 实现高密度发酵的方法： （1）改进发酵条件：a培养基b、建立流加式培养基c、提高供养能力 （2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a阻断乙酸产生的主要途径b、对碳代谢流 进行分流c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流d、引入血红蛋白基因 （3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 9、分离纯化常用的色谱分离方法有哪些？它们的原理是什么？ 方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。 （1）离子交换色谱IEC :是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换 剂
生物技术制药（Biotechnological Pharmaceutics）是不断引进现代生物化学、分子生物学、细胞生物学、微生物学和制剂学及现代基因工程等多学科先进技术而形成与发展起来的实用制药技术。 基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：①上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。、 ②下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 基因工程药物制药的主要程序：⒈目的基因的克隆⒉构建DNA重组体⒊DNA重组体转入宿主菌⒋构建工程菌⒌工程菌发酵⒍表达产物的分离纯化⒎产品的检验等 反转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：RT-PCR是将以RNA为模板的cDNA合成同PCR 结合在一起，该法是mRNA经反转录合成cDNA第一链，在以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始协助下，PCR扩增，特异性的合成目的cDNA链（目的基因）。 化学合成法：较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA 双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程 进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。 表达载体必须具备的条件（1）载体能够独立的复制；（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。并且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；（3）具有很强的Promoter，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；（4）具有Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因。
1. 生物技术制药分为哪些类型？生物技术制药分为四大类： （1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽， 蛋白质类治疗剂。 （2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物 2．生物技术制药具有什么特征？ （1）分子结构复杂（2）具有种属特异性 （3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性 （7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性 （10）检验的特殊性 3.生物技术制药中有哪些应用？应用主要有： （1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体， 基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物 （2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢 产物 （3）酶工程制药（4）发酵工程制药 4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？ 基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验 5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？ （1）外源基因的计量 （2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱 b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件 6.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？ 质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌2）选择合适的载体（3）选择压力 （4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化 7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？ 影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧 （5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7） PH值 8.什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？ 高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH (4)温度（5）代谢副产物实现高密度发酵的方法： （1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力 （2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流 d、引入血红蛋白基因 （3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌
生物技术制药复习提纲 生物技术所含的主要技术范畴包含有哪几个工程？ 基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 基因工程菌在传代过程中的质粒不稳定的现象主要是指哪两种不稳定？ 质粒不稳定分为分裂不稳定性和结构不稳定性 基因工程菌的培养方式有哪几种？ 分批培养；补料分批培养；连续培养；透析培养和固定化培养； 从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可以分为哪几种？ 悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。 动物细胞培养基分为哪三类？ 天然培养基合成培养基无血清培养基 植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有哪几类？。 无机盐碳源植物生长调节剂有机氮源维生素 在V区中，决定抗体分子与抗原分子发生特异性结合的关键部位称为互补决定区（CDR），而 c 区则决定了Ig分子的异种抗原性。 酶固定法中的包埋法可分为哪两种？ 网格型微囊型 发酵工业的生产水平取决于哪三个要素？ 生产菌种、发酵工艺和发酵设备 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为哪三类？ 治疗药物、预防药物、诊断药物
基因工程药物制造的主要步骤如何？ 目的基因的获得；构建DNA重组体；构建工程菌；目的基因的表达；产物的分离纯化；产品的检验 酶和细胞的固定化载体主要有哪三类？ 吸附载体包埋载体交联载体 单克隆抗体制备时对动物的免疫方法分为哪两种？ 体内免疫法和体外免疫法 生产用动物细胞为原代细胞、二倍体细胞系、转化细胞系以及工程细胞系。 目前工业常用的酶一般是以什么为主要来源？ 微生物 发酵工程产品开发的关键是筛选到高效菌株，一般优良菌种的选育方法主要有哪几种？ 自然选育、诱变育种和原生质体融合 . 在制备大量微生物菌体或其代谢产物时，可采用不同的发酵方式。微生物的发酵方式有哪几种？ 分批发酵、补料分批发酵、连续发酵 目的基因的获得方法有哪几种？用反转录法获得目的基因，首先必须获得什么？cDNA法获得目的基因的优点是什么？将构建好载体导入动物细胞最常用的方法是什么？ 反转录法、反转录-聚合酶链反应法和化学合成法 目的基因的mRNA 获得的目的基因编码序列无内含子，目的基因的筛选较容易 磷酸钙沉淀法电穿孔法
第一章绪论 ·生物技术（biotechnology）：是指将生物用于有价值产品的生产。 ·生物技术制药（biotechnology pharmaceutics）:用现代生物技术制造药物。 是指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术，来研究、开发和生产用于预防、治疗、诊断疾病的药物。 ·生物药物（biological drug）：从生物体中制取的各种天然活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。 ·生物技术药物（biotechnological drug）:利用现代生物技术生产的蛋白质或核酸类等生物药物。·现代生物技术的主要内容 基因工程技术 细胞工程技术 酶工程技术 发酵工程技术 ·生物技术制药的主要内容 基因工程制药 细胞工程制药 酶工程制药 发酵工程制药 ·基因工程技术：是将一种生物体的基因与载体在体外进行连接，然后转入另一种生物体内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。·细胞工程技术：包括细胞及转基因细胞的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞器（如线粒体、叶绿体等）的移植与改建等操作技术。 ·酶工程技术：在一定生物反应装置中利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术。 ·发酵工程技术：培养活细胞以
取得生物体或代谢产物的技术。（抗生素、氨基酸、维生素）·生物制药：从生物材料中提取、分离、纯化药物的过程。 第二章基因工程制药 ·基因工程制药：是指利用基因工程技术生产蛋白质或多肽类药物。 ·基因工程药物制造步骤: 上游阶段：分离目的基因，构建工程菌，目的基因的表达。 下游阶段：从工程菌的大量培养到产品的分离纯化和质量控制。 ·分离纯化的步骤：细胞分离- 细胞破碎-固液分离-浓缩与初步分离-高度纯化直至得到纯品-成品加工 ·基因重组蛋白的主要分离技术：分离、沉淀（等电点沉淀法、盐析法） 、膜分离、双水相萃取。·基因重组蛋白的主要纯化技术: 1.离子交换层析 2.亲和层析 3.凝胶过滤层析(分子量大 的先洗脱下来） 4.反相色谱和疏水色谱 ·亲和层析的主要步骤： a.配体固定化 b.亲和吸附阶段 c.洗涤阶段 d.洗脱解离阶段 e.再生阶段 ·凝胶过滤法的用途： 脱盐、分级分离、分子量的测定 ·反相色谱和疏水色谱：根据蛋白质疏水性的差异来实现分离纯化的。 ·基因工程药物的改造的目的：提高疗效降低毒副作用。 ·基因定点突变技术