苏云金芽孢杆菌简介
组员：张晓云李文慧
2010年5月10日
明治维新后，日本成为当
时最大的蚕丝产地和最主要的蚕丝出产国
猝倒病
病蚕停止进食桑叶，随后
出现颤抖的症状，并且很
石渡繁胤（いしわたし
げたね）(1868-1941)
猝倒杆菌
恩斯特·贝尔林纳（Ernst
Berliner）在德国苏云金省重新分离得到
正式定名为苏云金芽胞杆
菌(Bacillus thuringiensis,B.t.)
Mattes在1927年重新从
地中海粉螟中分离出了Bt 能杀死鳞翅目昆虫，对其
它动物却没有什么影响
Bacillus thuringiensis))苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis
革兰氏阳性土壤杆菌
芽孢杆菌属
菌体短杆状，生鞭毛，单
生或形成短链
20世纪20年代末，美国
用于控制舞毒蛾
法国在1938年成功地研
制出第一个商业化的Bt杀
虫剂Sporine。
20世纪50年代，Bt作为绿
色有机农药，取代DDT在
美国开始被大规模地应用
Bt 的没落和新生
?不需要人工喷洒?新作物不确定性大大降低
?误伤非农业害虫的几率变低
?尚未发现对人类健康有任何负面影响
?对环境贡献巨大
新特点
?价格昂贵?须多次喷洒
?化学合成杀虫 剂出现
旧缺点
转基因技术
抗虫蛋白
基因转入
基因转入玉米、棉花
基因
克隆cry 基因蛋白提纯cry 蛋白-内毒素伴胞晶体蛋白
发现δ-内毒素
伴胞晶体蛋白
虫吃了会死，人吃也有害？
Bt安全性
毒性检测毒理研究免疫学
?老鼠：3.8-
5g/kg体重
?我国≤2.5微克/g
?60kg的人吃120吨稻米?原毒素
?受酶激活，作用
于肠道受体造成
穿孔
?人体不存在激活
蛋白酶
?结构与已知过敏
原相差很大
?没有能引起过敏
反应的实验依据
?争议案例缺乏说
服力
Bt对环境的影响节肢动物群落特征参数
特征参数MH—BT MH-bt田
水MH—常
规
SY-Bt SY-bt田
水
SY—常规
物种 535153525152 SIMPSON(J) 0.888180.890810.893020.890950.88910.89395 SHANNON(H) 3.90161 3.92576 3.94629 3.95656 3.92669 3.97552均匀度 0.681160.692080.688960.694080.692240.69741
新型抗虫蛋白
鞘翅目昆虫（天牛）
双翅目昆虫（黑蝇）
河盲症（River
Blindness），仅次于沙
眼之后的第二大致盲传染
病
蟠尾丝虫症控制计划
（OCP），3000万人得
到保护，直接避免盲眼的
人数26.5万人
基因组测序概况2 complete，2 assembly，14
in progress
B. thuringiensis 97-27，B.
thuringiensis Al Hakam，均无
杀虫活性
苏云金芽孢杆菌YBT-1520，
华中农业大学，含有cry1A a、
cry1A b、cry1A c、cry2A a和
cry2A b，但拼接困难
内生质粒，在细胞内呈共价闭
合环状的形式(cccDNA)，已有
22 个质粒完成了全序列测定
Bt 97-27 的染色体圈图
注: 最外面两圈表示基因的起始位点
和指定的功能分类;
第1 圈包括正链基因产物;
第2 圈包括负链基因产物;
第3 圈和第4 圈表示特有基因;
第5 圈和第6 圈表示原噬菌体基因;
第7 圈表示插入序列元件;
第8 圈表示(G+C)含量;
第9 圈表示GC 偏好性(卡其色表示值
>1, 紫色表示值<1)
颜色代表功能分类如下: 浅蓝色—氨
基酸的生物合成; 浅肉色—辅助因子
的生物合成; 暗肉色—细胞膜; 橙色—
细胞加工; 橙红—重要中间代谢; 绿
色—能量代谢; 黑色—脂肪酸和磷脂
代谢; 青色—其他分类; 暗灰色—蛋白
凋亡; 黄色—嘌呤、嘧啶、核苷和核
苷酸; 浅绿色—调控功能; 蓝色—复制;
浅灰色—转录和翻译; 洋红色—转运
和结合蛋白; 褐色—未指定的编码; 红
色—未知功能
pBtoxis 质粒圈图
注: 外边两圈表示正反链
上预测的基因, 外圈刻度
标尺的单位为kb; 最里面
一圈表示GC 偏好性, 黄褐
色表示值>1, 紫色表示值
<1; 第2 圈表示（G+C）
含量
基因由不同的颜色来代表
如下: 灰色—毒素和肽类
抗生素; 粉红色—转座子
相关; 橙色—保守假定的;
红色—DNA 代谢; 蓝色—
调控; 鲜绿色—表面关联
的; 灰绿色—未知; 黄色—
各种代谢因子
谢谢！
References
https://www.doczj.com/doc/f02724790.html,/archives/37319.html
谭寿湖等. 苏云金芽孢杆菌基因组研究概况[J].基
因组学与应用生物学, 2009, 28(1),202-208
图片来源于参考文献及网络图片
本文对农业上研究最多、用量最大的两类微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis, Bt）和昆虫杆状病毒（baculovirus）进行了综述，分别论述了它们的杀虫优势、杀虫的分子机理、目前的研究状况，并对它们的基因工程技术改良路线以及在农业上的应用，提出了一些建议。 由病虫害引起的农作物的减产减收已成为制约农业生产进一步发展的限制因素，全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的13％，而目前对农作物害虫的防治主要依赖于化学农药。完全依赖化学杀虫剂存在许多弊端，其中最主要的问题是，一种化学物质的广泛使用会使害虫的后代产生选择性进化优势，从而对该化学物质产生抗性。例如，世界各地的家蝇品系对杀灭它们的每种杀虫剂都产生了抗性。第二个问题是，有的杀虫剂影响非靶目标品种，产生灾难性后果，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长。第三问题是在于环境的耐受性和许多杀虫剂的毒性，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁。上述不利因素促使人们急欲寻求控制害虫的替代方案。 在对农业害虫进行的长期防治实践中，人们逐渐认识到必须采取综合治理的措施，才能有效的控制害虫的危害。基因工程技术的发展，为防治农林害虫提供了一种有效、减污的新技术手段，微生物农药也因此在世界范围内受到广泛重视。微生物农药是指非化学合成、具有杀虫防病作用的微生物制剂，如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素，等等。这一类微生物包括杀虫防病的细菌、真菌和病毒。 杀虫微生物是指其代谢产物或微生物本身对宿主昆虫有致死效应或致病的微生物类群，通常也称为昆虫病原微生物。目前已知的杀虫防病微生物主要有芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、链球菌科和杆状病毒科等类群。尽管不同杀虫微生物引起昆虫致病的症状不尽相同，但杀虫微生物对害虫的作用方式主要是通过产生特异性的杀虫毒素来破坏害虫的代谢平衡，或者是通过营养体在虫体内的繁殖复制而引起昆虫死亡和发生流行病。 除了这一独特的杀虫机制外，微生物杀虫剂还具有以下一些特点：对人畜安全无毒，不污染环境；杀虫作用具有一定特异性和选择性，不会使天敌和非目标昆虫致死；易于和其他生物学手段结合进行害虫综合治理，维持生态平衡；由于杀虫活性蛋白的多样性，昆虫产生抗性较缓慢或不易产生抗性；可以通过发酵法生产，具有较低的生产成本；可以通过基因工程技术途径筛选或构建优良性能的菌株来满足生产与应用所需等。所以微生物杀虫剂自问世以来发展很快，据报道，全世界已商品化的微生物农药约30种，微生物杀虫剂占其中的90％。 苏云金芽孢杆菌 杀虫微生物中研究最多，用量最大的是苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌从上世纪20年代起就用于害虫的防治，它的生物学特性决定了它的微生物杀虫剂功能。 苏云金芽孢杆菌菌株在生长代谢过程中会形成芽胞，在芽胞形成过程中产生一个芽胞及一个或多个较大的蛋白质性质的晶体内含体。这种蛋白质性质的晶体被敏感昆虫摄食后会导致昆虫死亡，蛋白质晶体含有不具活性的原毒素分子——δ－内毒素，当昆虫幼虫吞食了这种内毒素，晶体就会被幼虫的碱性肠液溶解，随后被肠道蛋白酶降解，形成有活性的蛋白质毒素，最终导致昆虫死亡。苏云金芽孢杆菌菌株在营养体生长旺盛期，某些菌株还会产生一些其它的外毒素，如α－外毒素、β－外毒素、γ－外毒素，等等。除上述毒素外，近年来从
苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定 09级园林工程系生物技术及应用班级 (制作人—王珏指导教师—韩磊) 内容提要 本论文描述了苏云金芽孢杆菌的选择性培养、分离以及鉴定的过程,从而熟悉了灭菌、接种等无菌操作技术，掌握了鉴定菌种的不同方法以及了解到了苏云金芽孢杆菌在生产上的应用和发展前景前景。 关键词 苏云金芽孢杆菌;选择性培养;生化鉴定；明胶酶；明胶的液化；精氨酸脱羧酶；尿素酶1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1玻璃器皿 烧杯；三角瓶；量筒；玻璃棒；培养皿；试管；移液管；涂布棒；酒精灯；胶头滴管等 1.1.2实验仪器 超净工作台；光照培养箱；水浴锅；摇床；电子天平等 1.1.3其他用具 研钵；纱布；吸耳球；八层纱布；剪刀；棉塞；pH试纸；胶头滴管；牛皮纸；麻线；喷壶等 1.1.4实验材料 土壤表层土样；叶片；苏云金芽孢杆菌菌粉 1.2方法与步骤 1.2.1选择性培养及扩大培养 1.2.1.1灭菌前准备 1)PBA培养基的制备 PBA培养基配方（1L） 配置750mL的PBA搖瓶培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。
注（制备的培养基中有500mL中不含有醋酸钠） 2）灭菌器材的准备 将需要灭菌的三角瓶、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。 1.2.1.2灭菌 1、注水：往灭菌锅内注入适量的蒸馏水； 2、预热：放入需灭菌的器材和培养基之前先预热十分钟； 3、加热升温过程：将需要灭菌器的材放入灭菌锅内→盖 好灭菌锅的顶盖→打开放气阀→接通电源进行升温、升压→ 待到有大量热气从放气阀冒出时关掉放气阀；此后是升压的 过程； 4、升压、降压过程：开始升温后压强随之升高，待到压 强为0.05mpa时关掉电源；此后为降压过程，当压强降到 0mpa时打开放气阀放气。放完气后关掉放气阀接通电源，再 次升温、降温后打开放气阀放气，放完气之后关掉放气阀接 通电源；此后为升压保压的过程； 5、升压保压过程：当压强从0mpa升到1.1mpa时开始计时；当压强升到1.13mpa时关掉电源，待压强降到约1.1mpa时再接通电源；再次升压至1.13mpa时关掉电源开始降压，当降到1.1mpa时再接通电源然后开始升压。重复上一步操作，使此过程保持20分钟。此后为降压出锅过程； 6、降压出锅过程：保压20分钟后关掉电源等待降压至0mpa时打开放气阀放气；用抹布打开灭菌锅的锅盖，然后将灭完菌的器具和培养基取出； 1.2.1.3样品的预处理 三个小组分别取土壤表层土样和植物叶片共5份→土壤研磨、叶片剪碎→每份样品称取5g→溶于适量的自来水中→摇匀→置于75℃的水浴锅中保温10min→静置 1.2.1.4超净工作台的准备 接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。 1.2.1.5无菌操作 1）培养基的完善及分装（对照试验）
Bt（苏云金杆菌）乳剂生产工艺规程 衡阳市微生物厂 一九九二年三月
Bt 乳剂工业生产技术 一、概述 Bt 即苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ）的简称，是一种寄生于昆虫体内引起昆虫发病死亡的能产生伴孢晶体的芽孢杆菌，其制剂广泛应用于农、要、果、蔬、城市园林方面的害虫防治。 二、生产工艺流程 砂土管菌种 斜面菌种 扁瓶 菌种扩大培养 发酵罐 过滤 浓缩 加助剂 检验 包装 三、生产工艺操作规程 （一）砂土管菌种的制备 1、砂的处理： 取建筑用砂或河砂经60－80目过筛后用工业Hc 浸泡48h 后用清水洗净，再用0.2NNao 中和，烘干后用磁铁除去其中带磁性之金属微粒，装入洁净容器内备用。 2、砂土管制备： 将以上已处理好之砂土分装于1.2×12公分之小试管中，每管约装2克，塞上棉塞，先用2.0kg/cm 2高压灭菌1.5小时，间歇灭菌三次，再以160℃干热灭菌2小时，经无菌试验，即抽取一点砂土置于斜面试管中 36℃培养24小时才检查无杂菌后备用。 27－29℃ 48－72h 27－29℃ 18－24h 27－29℃ 36－48h
3、砂土孢子的制作： 选择生长良好，经过生产能力考查合格的优良试管斜菌种一支加入无菌水5ml，用接种针刮下孢子制成高浓度的孢子悬液用无菌吸管吸取0.2－0.3ml接入砂土管中，而后置入真空干燥器内，用真空泵间歇抽干，用石蜡封口，以后置于0－5℃冰箱中，在干燥情况下保存。 （二）斜面菌种的制备 1、培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、琼脂2%，调节7.5－8.0溶化后分装试管，加塞放入试管篓内包好灭菌。 2、灭菌：在消毒锅内 1.1kg/cm2下蒸气灭菌30分钟，等冷却到60－70℃时取出摆成斜面，空白培养2天观察无杂菌方可使用。 ３、接种培养：将菌种试管斜面放在接种室内或无菌操作箱中，打开紫外线灯灭菌30分钟后关闭。用接种环按操作规程刮取种子菌苔少许，转至新鲜斜面培养基上划线接种，然后放入30℃培养箱内3－4天，经检查正常，放入冰箱内备用。 （三）扁瓶扩大种子制备 1、培养基：同斜面培养组成，另加葡萄糖1%，溶化后装入扁瓶。 2、灭菌、接种、培养均与斜面菌种同。 （四）发酵 1、培养基棉籽饼粉 3.5% 玉米粉 2.0% 鱼粉 1.0% 酵母粉0.2%
苏云金芽孢杆菌生物农药的制备伴胞晶体的分离纯化及杀虫活性 集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
JIUJIANG UNIVERSITY 实验论文 题目苏云金芽孢杆菌生物农药(Bt制剂)的制备、伴 孢晶体的分离纯化及杀虫活性 院系生命科学学院 专业生物技术 姓名樊晓乐、严学芬、王伟、 周明宣、邹红虹 班级 B0933 指导教师张炳火 二零一一年十一月
摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。本试验采用固体培养，对一株苏云金芽孢杆菌进行了发酵，制备了Bt制剂，对伴孢晶体进行了分离纯化，采用菜地试验，检测了Bt制剂和伴孢晶体对白菜虫害的防治效果。 关键词：苏云金芽孢杆菌（Bt）；伴孢晶体；杀虫活性 前言 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上），这些蛋白具有很高的杀虫活性。Bt由于具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、生物降解无残毒、所用原料简单等优点，在虫害防治中发挥着越来越重要的作用，随着对Bt研究的深入，Bt 的基因改造、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等方面的研究都对高纯度的Bt伴胞晶体提出了极大的需求。 因此，Bt伴胞晶体的分离纯化方法逐步得到了发展，如等密度梯度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等。 本实验采用2种液体培养基、2种培养条件对苏云金芽孢杆菌进行培养。镜检观察当90％以上的芽孢脱落时处理菌体，经碱液裂解后比较等电点沉淀和液体双相分层法提取Bt蛋白的收率和纯度。 1 材料与方法
基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第1期，第202－208页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.1,202－208 专题介绍Review 苏云金芽孢杆菌基因组研究概况 谭寿湖1,3张文飞1,3叶大维2* 1广西大学生命科学与技术学院,南宁,530005;2南开大学生命科学院,天津,300071;3海南海德热带农业资源研究所,三亚,572025*通讯作者,yehtawei@https://www.doczj.com/doc/f02724790.html, 摘 要 迄今为止，全球已有2个Bt 株菌株完成了全基因组测序，1个Bt 菌株正在拼接中，15个Bt 菌株正在 进行测序中。已有22个Bt 质粒完成了全序列测定。Bt 是作为生物农药使用最广泛的微生物菌株，也是最为成功地将其杀虫晶体蛋白基因应用于植物转基因的微生物。在基因组进化、新基因发现、基因表达调控等方面一 直是科学家研究的热点，并取得了相当多的成果。本文概述了苏云金芽孢杆菌基因组测序现状、基因组特征及比较基因学等方面的研究进展。 关键词苏云金芽孢杆菌,Bt 基因组,质粒基因组,比较基因组 Summary of Research Progress in the Genomics of Bacillus thuringiensis Tan Shouhu 1,3 Zhang Wenfei 1,3Ye Dawei 2* 1College of Life and Technology Science,Guangxi University,Nanning,530005;2College of Life Sciences,Nankai University,Tianjin,300071;3Haide Institute of Tropical Agricultural Resources,Sanya,572025*Corresponding author,yehtawei@https://www.doczj.com/doc/f02724790.html, Abstract Presently,there are two Bt strains that have completed whole genomic sequencing,while one Bt strain is being assembled,and 15Bt strains are in progress.Furthermore,22Bt plasmids have completed sequencing.Bt is the most widely used microbial strains as a biological pesticide and also have the most successful application in genetically modified plant with the use of its insecticidal protein gene.Scientists have been looking at the genomic evolution,new gene discovery,gene expression and regulation with considerable achievements.This article pro-vides an overview on the latest research development of Bt genome sequencing,genome characteristics and com-parative genomics studies.Keywords Bacillus thuringiensis ,Bt Genome,Plasmid genome,Comparative genome 基金项目：本研究由国家863项目(2006AA022189)资助 随着基因组测序技术的快速发展，测序成本的降低，对任何生物的基因组进行测序变得现实和可能(Marguerat et al.,2008)。自1995年首次完成流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae )的全基因组序列以来，已有大量的微生物菌株基因组全序列测定完成。截止到2009年2月3日，全球已经完成基因组测序的微生物菌株有834株，有643株微生物菌株的基因组正处在拼接阶段，此外，有797株微生物菌株的基因组由于各种原因只完成了基因组草图。在已经完成测序的微生物中，有779株为真细菌，55株为古生菌(https://www.doczj.com/doc/f02724790.html,/genomes/lproks.cgi)。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,简称Bt )在《伯杰氏系统细菌学手册》(第九版)中被列为第2类 第18群中的芽孢杆菌属。与蜡状芽孢杆菌(B.cereus )，炭疽芽孢杆菌(B.anthracis )同属于蜡状芽孢杆菌群细菌(Rasko et al.,2005)。 Bt 广泛存在于土壤、 虫尸、污水、淤泥、尘埃以及叶面等介质中，是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性细菌。苏云金芽孢杆菌也是一种典型的昆虫病 原菌，对鳞翅目(Lepidoptera )、 双翅目(Diptera )、鞘翅目(Coleoplera )、膜翅目(Hymenoptera )、同翅目(Ho － moptera )、 直翅目(Orthoplera )、食毛目(Mallophaga )等多种昆虫，以及线虫、 螨类和原生动物等具有特异的毒性活性，由此成为目前世界上研究最深入，应用最广泛的农业害虫生物防治细菌(Crickmore et al.,1998;喻子牛等,1996)。
苏云金杆菌 苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌，英文名称：Bacillus thuringiensis（B.t.）为了方便都将B.T.写成BT或Bt，故Bt即苏云金杆菌的简称。苏云金杆菌杀虫剂是利用苏云金杆菌杀虫菌经发酵培养生产的一种微生物制剂。苏云金杆菌在自然状态下以一种生物细菌的形式生存于土壤及水中。这种杀虫菌在生长发育过程中产生芽胞并形成一种蛋白质毒素，在显微镜下观察，通常是不规则的菱形结晶，叫做伴孢晶体。 当害虫蚕食了伴孢晶体和芽孢之后，在害虫的肠内碱性环境中，伴孢晶体溶解，释放出对鳞翅目幼虫有较强毒杀作用的毒素。这种毒素使幼虫的中肠麻痹，呈现中毒症状，食欲减退，对接触刺激反应失灵，厌食，呕吐，腹泻，行动退缓，身体萎缩或卷曲。一般对作物不再造成危害，经一段发病过程，害虫肠壁破损，毒素进入血液，引起败血症，同时芽孢在消化道内迅速繁殖，加速了害虫的死亡。死亡幼虫身体瘫软，呈黑色。所以，害虫只有把Bt细菌吃到肚子里，再经过一个发病过程，才能死掉，大约48小时方能达到杀灭害虫的目的。 Bt杀虫剂与化学农药相比有许多优点 第一，对人畜无毒，使用安全。Bt细菌的蛋白质毒素在人和家畜、家禽的胃肠中不起作用。
第二，选择性强，不伤害天敌。Bt细菌只特异性地感染一定种类的昆虫，对天敌起到保护作用。 第三，不污染环境，不影响土壤微生物的活动，是一种干净的农药。 第四，连续使用，会形成害虫的疫病流行区，造成害虫病原苗的广泛传播，达到自然控制虫口密度的目的。 第五，没有残毒，生产的产品可安全食用，同时，也不改变蔬菜和果实的色泽和风味。 第六，不易产生抗药性，这只是相对而言。最近已经发现了抗药性的报道，但不象化学农药产生的那么快。 毒性： 鼠经口按2*10^22活芽孢/Kg体重给药无死亡，也无中毒症状。18名志愿者每人每天吞服30亿芽孢，连服5天，1个月后检查，一切化验正常，无毒性反应。亚急性和毒性试验未见异常，对猪、禽、鸟、鱼、蜂的急性和慢性饲喂养试验未见不正常现象，对家蚕敏感。无致癌、致畸、致突变作用。注意事项： [1]本品对家蚕有毒，蚕室和桑园附近禁用； [2]不能与内吸性有机磷杀虫剂或杀菌剂混合使用(如乐果、甲基内吸磷、稻丰散、伏杀硫磷、杀虫畏)及碱性农药等物质混合使用。
品名：苏云金杆菌（无添加任何化学杀虫成分） 有效含量：16000iu/mg 剂型：可湿性粉剂 净含量：100克 一、作用方式及特点 苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌是一种革兰氏阳性细菌，英文名称：Bacillus thuringiensis （B.t.）即苏云金杆菌的简称。苏云金杆菌（Bt菌）杀虫剂是利用苏云金杆菌杀虫菌经发酵培养生产的一种微生物制剂。Bt的杀虫活性物质,主要有二种,即晶体和孢子.晶体又叫原毒素,它是一种蛋白质。当害虫蚕食了伴孢晶体和芽孢之后，在害虫的肠内碱性环境中，伴孢晶体溶解，释放出对鳞翅目幼虫有较强毒杀作用的毒素—毒性肽。这种毒素使幼虫的中肠麻痹，肠道内碱性内含物漏入血腔，孢子和菌体通过被破坏的肠壁进入体腔。使其呈现中毒症状，食欲减退，对接触刺激反应失灵，厌食，呕吐，腹泻，行动退缓，身体萎缩或卷曲。一般对作物不再造成危害，经一段发病过程，害虫肠壁破损，毒素进入血液，引起败血症，同时芽孢在消化道内迅速繁殖，加速了害虫的死亡。死亡幼虫身体瘫软，呈黑色。所以，害虫只有把Bt细菌吃到肚子里，再经过一个发病过程，才能死掉，大约48小时方能达到杀灭害虫的目的，不象化学农药作用那么快，但染病后的害虫，上吐下泻，不吃不动，不再危害作物。 毒性：对人、畜低毒，大鼠口服急性LD50 852.7-856.7毫克/公斤，对家禽、鸟类、鱼、畜等低毒,对害虫天敌无伤害。 中毒症状: 吞服了制剂可能引起胃肠炎。 中毒急救：溅到皮肤或眼内立即用清水冲洗15分钟后就医。吸入，应将病人移到通风处，就医。误服，立即催吐，并送医院对症治疗。 二、杀虫原理 苏云金杆菌长得像根棍棒，矮矮胖胖,身高不到5‰毫米。当它长到一定阶段，身体一端会形成一个卵圆形的芽孢，用来繁殖后代；另一端便产生一个菱形或近似正方形的结晶体，因为它与芽孢相伴而生，我们叫它伴孢晶体，有很强的毒性。昆虫取食后，晶体蛋白在昆虫碱性肠道内溶解，经过中肠蛋白酶的酶解作用，将前毒素降解为活性蛋白。活性蛋白插入昆虫中肠细胞膜，形成跨膜离子通道或孔，破坏钾离子平衡，最终使昆虫中毒，麻痹而死。三、防治对象 Bt对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等100多种害虫和动植物线虫有很好的毒杀作用。国内外应用统计，Bt对64种森林害虫，34种果树害虫，12种茶树害虫都显示高毒力。最常用具特效的防治对象有：菜青虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟、稻苞虫、稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟、棉铃虫、棉小造桥虫、茶毛虫、茶尺蠖、松毛虫、天幕毛虫、毒蛾、刺蛾等鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目等害虫有很好的防治效果，且有杀卵作用。此外对大豆拌种防治地下线虫也有特效。 四、使用方法 1.一包100克可兑水100斤 2.可放农用喷雾器里（一喷雾30斤水），也可放园艺喷雾（800ml约可配18桶/1500ml 可配10桶。记得喷撒之前先过滤沉淀物哦，以免塞住喷壶嘴) 3.杀虫剂苏云金杆菌制剂可用于喷雾、喷粉、灌心、制成颗粒剂或毒饵等，也可进行 大面积飞机喷洒，也可与低剂量的化学杀虫剂混用以提高防治效果。草坪害虫的防 治用100亿孢子/g的菌粉750g／hm2对水稀释2000倍喷洒，或用乳剂1500～ 3000g/hm2与52.5～75kg的细沙充分拌匀，制成颗粒剂撒人草坪草根部，防治危 害根部的害虫。也可将苏云金杆菌致死的发黑变烂的虫体收集起来，用纱布袋包好，在水中揉搓，每50g虫尸洗液加水50～l00kg 喷雾（病毒重复利用！）。(2)防治蔬
发酵工艺学作业 题目苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 学院 班级学号 姓名
苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 摘要：苏云金芽孢杆菌（Bt）是一种开发和利用较为成功的微生物生物农药，但也存在着生产成本高、发酵条件难控制等缺点。本文主要综述了Bt生物农药的发酵工艺研究进展，主要包括BT发酵中的培养基、温度、PH值、通氧量以及发酵时间等方面。并对Bt生物农药的发展前景作出了展望。 关键词：苏云金芽孢杆菌；生物农药；发酵工艺；展望 Review on fermentation of Bacillus thuringiensis Abstract:Bacillus thuringiensis (Bt) is a microbial pesticides,Which has been successful developed and used.The fermentation technology of Bacillus thuringiensis (Bt) in recent years were summarized, including raw material, temperature, pH value, oxygen, fermentation time.In this aricle,the development prospct of Bt microbial pesticides is also put forward. Key words: Bt;microbial pesticides; fermentation technology;forward 前言 生物农药又可称为绿色农药、生态农药，是20世纪70年代提出的，是指可以用来防治病、虫、草、鼠等有害生物及调节植物生长的生物体或源于生物体的各种生理活性物质。生物农药不仅具有常规农药的高活性，能大规模工业化生产，而且专一性强，一般不伤害虫的天敌和有益生物，对人畜无毒，不污染环境，可在田间大规模应用。 微生物生物农药是生物农药中的主要类型之一[1]。而在微生物生物农药方面又以苏云金芽孢杆菌（Bt）为目前产量最大，应用最为广泛的一类细菌杀虫剂[2,3]，占到生物农药的90%左右[4]。Bt的发酵方式可分为液体发酵和固体发酵两种类
苏云金芽孢杆菌的研究 摘要苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛、研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。目前已发现多种Bt亚种或血清型对害虫具有杀虫活性,同时也发现了一些新的杀虫晶体蛋白，通过纯化得到高效的杀虫晶体蛋白也是目前研究热点之一。本文简要介绍了Bt的发展历史、晶体蛋白的纯化及在杀虫方面的一些应用。 关键词苏云金芽孢杆菌、历史、伴孢晶体、杀虫 苏云金杆菌(Bacillu .thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴孢晶体,且伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性[15]。苏云金杆菌是一种应用广泛的绿色环保型微生物杀虫剂，全世界年产值已突破1亿美元[1]。自20世纪60年代实现工业化生产以来,已成为世界上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂,每年以20%的速度增长[2,3]。苏云金杆菌杀虫剂的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等问题都待解决，关于苏云金芽孢杆菌的研究都将继续进行。 1Bt的发展历史 1901年，日本学者石渡繁胤(Ishiwata)从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott) 成为苏云金杆菌研究的起点[4]。1911年，Berliner 发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌(Bacil-lus.thuringiensis)，指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl) 。 1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。从发现该菌至今已有整整105年历史,世界上有超过万篇的研究报道,涉及生物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传学、产品化和安全性,包括近年来的转基因植物等诸多方面[5]。 1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。1981年，Schnept和Whiteley 首次将HD21菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并得到表达。用血清学技术进行Bt的鉴定和分类始于20世纪60年代。 我国对苏云金芽孢杆菌的研究和应用起步较晚，但发展迅速，据统计，在在70年代，我国苏云金杆菌制剂年产量大1000吨以上，并且部分产品用于出口。 1992年联合国“世界环境和发展大会”在巴西的召开促进了全球生物防治的发展，推进了苏云金杆菌制剂产业化进程。世界上许多科学家致力于Bt的研究，并作出卓越贡献，时至今日，Bt在农药上所占的比例仍处于劣势，许多问题依然有待解决。 2 苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体的纯化方法 2.1等密度梯度离心法 等密度梯度离心法是利用密度的差异将伴孢晶体与杂质分离,获得纯品的方
[转载]枯草芽孢杆菌发酵探讨 枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两 种芽孢杆菌之一，已被越来越多地研制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有 广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力。这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率、防病和促进生长起到重要作用。鉴于此，国内外专家学者对研究开发枯草芽孢杆菌制剂用于畜禽养殖日趋关注，从而也促进了这一产业的迅猛发展，但在现阶段的工业化生产中，存在着制约枯草芽孢杆菌发酵的诸多因素。 1、枯草芽孢杆菌的生物学特点 杆菌：一般（0.7～0.8）×（2.0～3.0）μm，电子显微镜测 量为（0.5～0.6）×（1.1～3.5）μm，革兰氏阳性，运动， 有长而又丰富的周生鞭毛。 芽孢：椭圆形，中生或偏中生，即使孢囊膨大也不显著。 生长温度：最高温度45～55℃；最低温度5～20℃。 阳性反应：接触酶；V-P反应；在7％的氯化钠中生长；pH5.7生长；分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸；水解淀
粉；利用柠檬酸作为碳源；还原硝酸盐为亚硝酸盐；分解酪素；石蕊牛奶产碱胨化。 阴性反应：厌氧生长； 卵黄反应：在葡萄糖洋菜上或酪氨酸洋菜上形成可溶性黑色素；28℃4星期水解马尿酸盐；利用丙酸盐并分解酪氨酸。在55℃生长的菌株被0.02％的叠氮化合物抑制。 变化的性质：在V-P液中产酸(pH5.0～8.0)；对溶菌酶的抗性；在10％的氯化钠中生长。2、芽孢杆菌制剂的作用机理2.1可产生酶类和营养物质 研究表明芽孢杆菌能够分泌大量的胞外酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，有助动物对饲料的降解、消化，提高饲料利用率。饲料中未被消化的蛋白质和一些含氮物质在肠道中被大肠杆菌和其他细菌脱梭生成具有潜在的毒性的腐胺、吲哚、酚类等物质。一些芽孢杆菌可产生氨基氧化、SOD酶、分解硫化氢的酶以及其他抗菌物质如过氧化氢，起到杀菌作用，从而减少动物体内有害物质的产生。研究表明一些芽孢杆菌产生SOD酶，SOD可以清除生物体内活性氧自由基，减少其对细胞的毒害作用，使生物体免受伤害。芽孢杆菌在 生长繁殖过程中可以产生挥发性脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，一些脂肪酸可降低动物肠道的pH，从而为乳酸菌的 生长创造条件，并且抑制病菌的生长。其中丙酸还可以参与三梭酸循环，为动物的新陈代谢提供能量。同时，能够产生
农业环境保护1998,17(6):248 250 A gr o_environ mental P rotection 微生物杀虫剂苏云金杆菌液体发酵技术的研究 张俊亭 李治祥 张克强 黄士忠 (农业部环境保护科研监测所,天津300191) 摘 要采用不同固形物含量的发酵液,确定出苏云金杆菌发酵液的最佳碳氮比为 1:2.5。不同固形物含量发酵液的试验证明,采用高固形物含量(9%)的发酵液在生产上可有效降低生产费用。应用造价低、便于维修、抵御感染能力强、节能省电的气升式发酵罐对B.t 进行发酵,发酵液不用浓缩其效价就达到国家行业标准(H a 2275IU / L),很适宜在实际生产上采用。 关键词苏云金杆菌 液体发酵碳氮比 气升式发酵罐 收稿日期:1998-04-17 苏云金杆菌(Bacillus thrin g iensis ,B.t)是一种杀虫效果良好的微生物农药, 可以应用于多种害虫的防治[1、2] 。B.t 的液体发酵在生产上应用最多,它的杀虫毒力与其发酵水平有着密切的关系。M eg na [3] 采用固形物在3% 4%左右的发酵液来培 养,最终发酵液含活孢子20 50亿/mL 。Drake 等 [4] 则采用了固形物含量6% 10%的发酵液,最终的活孢子数达到140亿/m L 。在配方的成本上来看,国外用料成本比较高;而国内由于产品售价低,只能采用一些比较便宜的原料。我们采用了廉价的农产品原料(豆饼粉等),来研究苏云金杆菌的液体发酵技术。研究表明,苏云金杆菌的活孢子数与杀虫毒力之间虽有一定关系,但用活孢子数来表示杀虫效价是不科学的。我们选用棉铃虫作供试害虫,来评价发酵液的杀虫效价。 1材料与方法 1.1菌种 Bacillus thr in g iensis H D-11.2斜面培养基 牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,氯化钠 0.5%,琼脂2.0%,余量为水。 1.3发酵配方的筛选 发酵的基本配方为豆粉4%,玉米粉3%,酵母粉1%,鱼粉1%和碳酸钙0.2%。在此基础上,通过变换配方的碳氮比,通过摇瓶试验来确定发酵培养基各组分的最佳配比。将选定发酵配方的发酵液20m L 装入250m L 三角瓶,灭菌后,接活化后的斜面菌苔一大环。在30 下进行摇床振荡培养10 12h,作为种子。然后,以3%的量加入到灭菌处理过并含有20mL 培养液的250mL 三角瓶中。在30 恒温条件下摇床振荡培养28 32h 。发酵液均按稀释平板计数方法对菌体进行计数[5]。将发酵液在玻片上染色,在油镜下计数测定晶孢比。 1.4发酵促进剂的筛选 在选出最佳发酵培养基配方的基础上,分别向内添加1%玉米糖浆、微量元素(硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁,1%溶液)、1%氨基酸(18种氨基酸混合物)、1%螺旋藻粉等营养物质,期望它们能使发酵水平有所提高。上述发酵液经灭菌后,用摇
苏云金芽胞杆菌杀虫方面的研究 及运用进展 摘要：人类对苏云金芽胞杆菌（Bt）的研究至今已有100多年的历史，因其具有特殊的生理特性，在微生物防治害虫方面具有重要的作用。利用微生物能直接杀死害虫却又不伤害控制害虫的天敌，最重要的是它不污染环境，害虫也更难以产生抗药性，还能通过遗传操纵改造某些性状，以便对其更好的利用。同时，随着转基因技术的兴起和发展，Bt成为转基因过程中的重要材料，在应用实践中起着巨大的作用，如今成功的转Bt产物已有：转Bt抗虫棉花、转Bt玉米以及备受争议的转基因水稻等等。本文主要叙述Bt的某些重要特征和当前的研究进展，旨在达到一种科普宣传让人们更加了解有关转Bt产物方面的知识。 关键词：苏云金芽孢杆菌、微生物防治、转基因、农业生产应用 苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis，简称Bt )是一种杆状、革兰氏染色阳性反应、能形成内生芽胞的细菌，广泛存在于各种生态环境中。其营养体具有周生鞭毛或无鞭毛。在其芽胞期能形成对特定昆虫具有毒性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)组成的伴胞晶体，此特点成为苏云金芽胞杆菌区别于分泌肠毒素的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)和引起炭疽病的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)的主要特征(喻子牛等，1990)。由于其独特的杀虫特性，自从1901年日本学者Ishiwata首次分离到苏云金芽胞杆菌以来，苏云金芽胞杆菌得到了广泛的关注和研究，在世界范围内已分离得到超过
40000个菌株，对其生物活性谱的了解得到了极大的扩展，由最初对鳞翅目的毒性，逐渐发现对双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf等，1998)。 1.苏云金芽孢杆菌的毒素 毒素是苏云金杆菌杀虫的核心，主要有三种：伴孢晶体（杀虫晶体蛋白，Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）即σ-内毒素，苏云金素即β-外毒素，芽孢。 1.1杀虫晶体蛋白（ICPs） 杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,简称ICPs）是由Cry基因和Cyt基因编码的，自从1981年克隆了第一个ICPs基因，并于1985年发表了他的核苷酸序列起，大量的ICPs基因相继被发现和克隆。他们的分类系统也从最初的基于杀虫活性和基因的同源性的分类系统变为基因的核苷酸序列及其演化关系的分类系统，并且其基因编号也该用阿拉伯数字取代了原来的罗马数字。Cry基因广泛用于转基因作物中，目前对Cry基因及其蛋白的主要分析方法有：PCR-RFLP、核酸分子杂交鉴定等。 1.1.1 ICPs基因的命名 传统命名法，Hofte和Whiteley（1989）提出根据杀虫谱进行分类的分类系统，根据基因编码的杀虫晶体蛋白的同源性及杀虫活性，已克隆的42个基因被划分为五类。其中，cryI、cryII、cryIII、cryIV编码的杀虫晶体蛋白分别特异地对鳞翅目、鳞翅目和双翅目、鞘翅目、双翅目有毒力作用，而对双翅目有生物活性且具溶细胞的作用的杀虫晶体蛋白基因则被划入cytA类。
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化 摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。通过对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化得到伴孢晶体。经过稀释分成不同的浓度分别去检测杀虫活性。 关键词：伴孢晶体，苏云金芽孢杆菌，纯化 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器设备和试剂 超净工作台，高压灭菌锅，离心机，冷冻干燥机，-80℃低温冰箱，透析袋，移液管，玻璃棒，电子秤，养虫缸。超纯水，0.5M/L的Nacl，生理盐水，5%的丙酮溶液。 1.1.2 研究菌株 本实验室分离自病蚕体内的苏云金芽孢杆菌。 1.1.3 供试昆虫 菜青虫。 1.1.3 培养基 种子培养基[1]:酵母浸膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaC1 1.0％，pH值7.0。121℃灭菌30 min。蒸馏水1000 ml，pH值7.0（用NaOH调pH值）。 发酵培养基[2]：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，葡萄糖0.3％，NaC1 0.2％，MgS04·7H2O 0.03％，K2HPO4 0.03％，MnSO40.005％，蒸馏水1000 ml。调pH 7.5，121℃灭菌30 min，灭菌后pH 7.3。 1.2 方法 1.2.1 种子液的培养 在无菌的条件下，从保藏管中分别挑一环接种有种子夜培养基，30℃培养14 h。 1.2.2 菌株发酵 按照3％的接种量转接500ml的发酵培养基，30℃，120 r／min培养60 h，镜检观测80％以上的菌体裂解时停止培养，离心收集提取晶体蛋白。 1.2.3 伴孢晶体的分离纯化[4] 氨基酸可以3种形式存在，即带正电荷、带负电荷和两性离子，如在酸性溶
年产1000吨苏云金芽孢杆菌的发酵车间工艺设计 包文雨 （辽宁石油化工大学，石油化工学院，生物工程1102，辽宁营口，1132050215） 摘要 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)于1901年在日本被发现，1911 年由柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，并依其发现地点德国苏云金省而命名. 苏云金芽孢杆菌简称苏云金杆菌，是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，在芽孢形成初期会形成杀虫晶体蛋白对敏感昆虫有特异性的防治作用。 本设计首先初步介绍了苏云金芽孢杆菌的发展过程，然后就其产品化进行了讨论，苏云金芽孢杆菌的发酵共有两种工艺路线，即液体深层发酵和固态发酵。它们都有其优缺点，但是经过对比论证，最终选择了液体深层发酵。随后根据相关资料确定了苏云金芽孢杆菌的生产周期及期产量，依照期产量对其进行了物料衡算和热量衡算，最后对设备进行了合理的选型。 关键词：苏云金芽孢杆菌；产品化；工艺路线；设备选型
1000 tons of Bacillus thuringiensis fermentation process design workshop Bao Wenyu (Class 1102, Department of Biological Engineering, School of Environmental and Biological Engineering, Liaoning Shihua University, Liaoning Yingkou, 1132050215, China) Abstract Bacillus thuringiensis (Bacillus thuringiensis) in 1901, was discovered in Japan in 1911 by the Berliner from the Mediterranean flour moth larvae in the prevalence of isolated and found locations in Germany according to their province and named Bacillus thuringiensis. thuringiensis Called Bacillus thuringiensis, is endogenous Gram-positive Bacillus soil bacteria, initially formed in the spore formation of insecticidal crystal protein (insecticidal crystal protein), insects have specific sensitive rats. The preliminary design of the first Bacillus thuringiensis introduced the development process, and then conducted a discussion of its products, the fermentation of Bacillus thuringiensis There are two process routes, that is, submerged fermentation and solid-state fermentation. They all have their advantages and disadvantages, but after comparison argument, I finally chose the submerged fermentation. Then determined according to the relevant information of Bacillus thuringiensis and production cycle of production, production was carried out in accordance of the material balance and heat balance, the last of the equipment for a reasonable selection Key words:Bacillus thuringiensis; product of; process routes; equipment selection