发酵工程实验指导
前言
发酵工程是整个生物工程的核心，是工业微生物实现实验室与工厂化生产的具体操作，是生物技术在生产实践中应用的原理及方法的一部分，是基因工程及酶工程等生物技术工业化的过程与方法。同时随着生物技术的发展，发酵工程技术理论已广泛应用于生物制药技术、植物细胞培养及动物细胞培养技术等新兴领域。因此，通过对发酵工程课程的学习，不仅掌握发酵工程原理及发酵优化控制过程，而且对系统了解生物技术及其工业化应用都具有深远的意义。
通过发酵工程实验及发酵工程各论的学习，不仅能够掌握发酵工艺操作的具体过程及反应过程控制方法，而且进一步了解目前发酵行业的具体产品生产工艺，对发酵生产能够进行指导与分析。为学生将来进入研究生阶段的课题研究、进入发酵及相关行业工作以及新产品开发打下基础。
本实验根据发酵工程的共性技术选编了代表性的实验，涉及工业菌种分离、诱变选育、发酵过程优化、流加发酵技术、发酵罐使用及发酵实验等，基本上覆盖了发酵工程基本实验技术和发酵理论，其中主要以课题组研究成果为基础，通过对出芽短梗霉菌株的自然界筛选、富集、分离等手段，获得特定目的产物的高产菌株，大部分为创新性设计实验。
本实验指导可可用于制药工程专业微生物制药课程的实验指导参考，亦可应用于生物技术专业发酵工程课程的配套实验指导书。课题组研究生阳静、李虹庆、李天夫等同学参与编写和指导，同时收集了与实验有关的参考书，供同学们参考。
发酵工程实验涉及水、电、气、蒸汽的使用及发酵设备安全操作，每位实验参与者应遵守实验室规章制度和实验要求。
实验一高产聚苹果酸菌株筛选分离
一、实验目的
（1）在自然界中筛选高产聚苹果酸的出芽短梗霉菌
株。（2）掌握并学习筛选及鉴定出芽短梗霉的方法
二、实验原理
出芽短梗霉属于真菌界，半知菌门，丛梗孢目，暗色丛梗孢科，短梗霉属。出芽短梗霉是一种腐生真菌，广泛存在于自然界中，出芽短梗霉在自然界中分布比较广泛，主要集中在植物叶片、花瓣、树皮以及海洋中，自然界分离到的不同亚种在各种培养条件下菌落形态有所差异，主要表现在不同色素和胞外多糖的分泌引起的变化，一般情况下，培养前期菌落圆润而粘稠随着菌龄增加会出现粉红
色、黄色或者黑色，菌落逐渐平整圆滑(图 1.2)。目前，已分离到许多不同性状的出芽短梗霉，它们普遍能够合成普鲁兰多糖、聚苹果酸、各种胞外酶、葡萄糖酸、黑色素、单细胞蛋白等。
图 1.不同出芽短梗霉菌落表型及细胞形态
聚苹果酸（Polymalic acid , PMA）是由其单体苹果酸通过α位的-OH与α或β位的-COOH酯化而形成的新型聚酯化合物，根据酯键的位置差异分为α型β型和
γ 型三种构型（图 1.3）。这三种构型都能通过化学方法合成，但分子量较小（≤17.4 kDa），条件苛刻；而生物法则只能合成β 型聚苹果酸。聚苹果酸聚合单体苹
果酸是三羧酸循环（TCA）中的重要代谢中间体，很容易被生物体代谢利用，因此聚苹果酸具有非常好的生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性；由于聚苹果酸分子中带有很多外挂羧基，它具有很好的水溶性和可修饰性，方便将各种药
物靶标或载体连接到了-COOH上形成具有新功能的衍生。
三、实验材料
（一）仪器
超净工作台，灭菌锅，恒温摇床，恒温培养箱，250mL锥形瓶，显微镜，天平，pH计等。
（二）材料
1. 菌种与保藏
出芽短梗霉菌种从自然界采样分离，一般接种于PDA斜面4℃保藏。
2. 培养基
1） PDA 斜面培养基：2%葡萄糖，1%酵母膏，2%蛋白胨，2%琼脂粉
2）富集培养基：10%甘露醇，0.1%硝酸铵，0.05%KH2PO4, 0.02%MgSO4·7H2O，0.2%柠檬酸，0.02%司盘80。
3）筛选培养基：2%葡萄糖，0.2%NH4NO3，0.01%KH2PO4，0.05%KCl，2%琼脂粉，
0.02%MgSO4·7H2O，0.02%溴甲酚绿（pH6.0~6.5）。
4）种子培养基： 6% 葡萄糖， 0.2%NH4NO3， 0.05%KCl ， 0.01%KH2PO4，
0.01%MgSO4·7H2O，0.01%ZnSO4·7H2O，0.1%玉米浆，2%CaCO3。
5）发酵培养基： 9% 葡萄糖， 0.2%NH4NO3， 0.05%KCl ，
0.01%KH2PO4，0.01%MgSO4·7H2O，0.01%ZnSO4·7H2O，0.05%玉米浆，
3%CaCO3。
四、实验步骤
1. 采样
根据文献调研，高产聚苹果酸的出芽短梗霉分布广泛，可从海洋、桃树或樱花树等环境下分离。该次选择在桃树或樱花等新鲜花朵、树蜜采集样本。
2. 富集与分离
将250mL三角瓶中加入20mL纯净水并加入玻璃珠，121℃灭菌20min中备用。将采集的样本在无菌环境下放入无菌水中振摇20min后，将液体移取至装有20mL富集培养基的摇瓶中培养，220rpm，25℃培养直至液体浑浊。将浑浊菌体按等比例稀释后，取100μL均匀涂布于事先制备好的PDA培养基平板上，置25℃烘箱倒置培养2~4d，定期观察菌落生长情况，挑取单菌落用革兰氏染色法染色后，油镜下观察细胞形态，确定单菌落只含有一种细胞形态，且符合出芽短梗霉椭圆状，若菌落不纯，需继续分离至单菌落。
3. 筛选
（1）初筛
用牙签蘸取单菌落点在筛选培养基上，25℃培养箱中培养2~4d，定期观察是否有黄色产酸圈。以有明显黄色产酸圈的菌落继续后续研究。挑取菌落于种子培养基中，25℃培养48h，
取发酵液上清液加入4倍体积无水乙醇，若有白色絮状沉淀，则可判定发酵液中可能有PMA。采用HPLC法检测有絮状沉淀出现的发酵后离心液，将其中能产生PMA的做为初筛目的菌株。
（2）复筛
取初筛目的菌株经过二级培养，取发酵液离心水解后测定PMA含量，选择产量最高
的一株为复筛目的菌株，并保存于PDA斜面。
4. 菌株鉴定
（1）形态鉴定
将复筛目的菌株接种于PDA培养基平板上于25℃培养2d，观察菌落形态。并取单
菌落用革兰氏染色法染色，油镜下观察菌株微观形态。
（2）分子鉴定
内转录间隔区（Internal transcribed sequence，ITS）包括18S和 5.8SrDNA中的ITS1及5.8SrDNA 和 28SrDNA 间的 ITS2。18S、5.8S 和 28SrDNA 基因序列进化相当保守，但 ITS1
和ITS2为中度保守区域，使得种内相对一致，而种间存在明显差异，因而广泛用于种内
或属内物种间差异较明显菌群间的系统发育分析。
用改良CTAB法提取目的菌株基因组，以菌株基因组为模版，采用通用引物ITS4(5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3' )和 ITS5( 5' GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG 3' )，扩增核糖
体DNA的ITS序列。经琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物后，用DNA纯化回收试剂盒回收PCR
产物进行测序（由北京六合华大基因科技股份有限公司完成）。将测序结果提交至GenBank库进行Blast检索，采用MEGA6.06软件进行多序列匹配排列，构建系统发育树。
PCR 反应体系如下：
DNA 模版 1 μL
10×ExTaq Buffer 2.5μL
MgCl2（25mM）2μL
dNTP （各 2.5mM）2μL
ITS4 1 μL
ITS51μL
Ex Taq （5U/μL）0.125μL
ddH2O加至25μL
扩增程序为：
94℃3min
94℃35s
50℃50s 30cycles
72℃45s
72℃10min
生物发酵工程实验 实验一................................ 利用酵母富集培养基分离酵母菌 实验二... ......................... 分离纯化酵母菌 实验三... ......................... 酵母菌的保藏 实验四............................... 大肠杆菌生长曲线测定及pH对生长曲线 的影响 实验五.............................. 发酵罐的构造及操作 实验六.............................. 发酵罐实灌灭菌操作 实验七.............................. 利用7L发酵罐对地衣芽孢杆菌进行补 料分批发酵培养 实验八..............................淀粉酶生成曲线的测定
实验一、利用酵母富集培养基分离酵母菌 一实验目的 1、通过本实验加深理解酵母富集培养基的原理和应用； 2、掌握涂布分离技术； 3、熟悉从自然样品土壤中分离酵母菌的具体操作方法 二实验原理 酵母菌主要分布于含糖高和酸度较高的自然环境中，在果园表土和浆果、蔬菜、花蜜和蜜饯等的表面很容易找到它们。在土壤中，由于各种微生物混杂在一起且酵母菌的数量相对比较少，故可以利用酵母菌富集培养基进行富集培养，该培养基含有较高的葡萄糖（5%）和较酸（pH为4.5）的环境，以及能抑制多种杂菌（许多细菌、放线菌和快速生长霉菌）的孟加拉红（玫瑰红），故十分有利于酵母菌的增值。 三实验材料 土壤（标注采集地点） 培养基：酵母富集培养基（5%葡萄糖、0.1%尿素、0.1%硫化铵、0.25%磷酸二氢钾、0.05%磷酸氢二钠、0.1%七水合硫酸镁、0.01%七水合硫酸铁、0.05%酵母膏、0.003%孟加拉红、1.9%琼脂 pH4.5） 移液枪、培养皿、天平、涂布棒、棉绳、250ml三角瓶、75%酒精棉花、摇床等 四实验步骤 1、采集土样：采集葡萄园或其他果园、菜地等的土壤若干（要求：先铲去2~3cm 的表土，再采集土样）适当研碎。 2、称取1g土样装入准备好的30/250ml蒸馏水中震荡均匀。 3、准备平板：将酵母菌富集培养基加热融化，待冷却至50℃左右后，倒2个平板，冷却待用。 4、用移液枪吸取200ul样品，用涂布法分离菌种。 5、恒温培养：将培养皿倒置后防于37℃恒温培养箱中培养2d。 五结果记录 将土壤来源，平板上得到的菌落特征和菌落数做表记录 六思考题 酵母菌富集培养基中为什么要加孟加拉红
发酵工程课后思考题 第一章绪论 1、发酵及发酵工程定义？ 答：它是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。由于它以培养微生物为主，所以又称为微生物工程。 2、发酵工程基本组成部分？ 答：从广义上讲分为三部分：上游工程、发酵工程、下游工程 3、发酵工业产业化应抓好哪三个环节？ 答：发酵工程产业化就是将有关应用微生物的科学研究成果转化为发酵产品，并投向市场的过程。 三个环节：投产试验、规模化生产和市场营销。 ①投产试验：涉及到”上、中、下三游”工作，即研究成果的验证、小试、中试和扩大试验。 ②规模化生产：值得注意的是产品质量问题，其检测必须符合相应产品标准。 ③市场营销：市场开拓对技术本身影响不大，但参与市场竞争却是产业化成败的决定因素。 4、当前发酵工业面临三大问题是什么？ 答：菌种问题 纯种，遗传稳定性，安全，周期短、转化率高产率高抗污染能力强：噬菌体、蛭弧菌； 合适的反应器 生产规模化原料利用量大，并且具有一定选择性，节能，结构多样化、操作制动化，节劳力。 基质的选择 价廉原料利用量大，并且具有一定选择性易被利用、副产物少，满足工艺要求。 5、我国发酵工业应该走什么样的产业化道路？发酵过程的组成部分？ 答第一步为技术积累阶段、第二步为产业崛起阶段、第三步为持续发展阶段 典型的发酵过程可划分成六个基本组成部分： （1）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定； （2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌； （3）培养出有活性、适量的纯种，接种入生产容器中； （4）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长； （5）产物分离和精制； （6）过程中排出的废弃物的处理。 第二章菌种的来源(1) 1、自然界分离微生物的一般操作步骤？ 答：标本采集，预处理，富集培养，菌种分离（初筛，复筛），发酵性能鉴定，菌种保藏 2、从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集？ 答：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 3、什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？ 答：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。 意义：自然选育是一种简单易行的方法，可达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。虽然其突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。 4、诱变育种对出发菌株有哪些要求？
实验 1 K L a 的测定方法 氧是难溶气体，在25℃和1个大气压下，纯水中溶解度为0.25 mol/m 3左右。在好氧发酵过程中，氧气由气相传递到液相，为微生物消耗。氧的传递过程限速阻力位液膜阶段，此时K l a 是描述氧的传递性能的重要参数。 1.目的 掌握利用亚硫酸盐测定容积氧体积传递系数的方法，了解氧传递在好氧发酵过程中的重要作用。 2原理 以Cu 离子为催化剂，溶解于水中的O 2能立即将水中的SO 32-氧化为SO 42-，其氧化反应的速度几乎与SO 32-浓度无关。实际上是O 2一经溶入液相，立即就被还原掉。这种反应特性使溶氧速率成为控制氧化反应的因素。其反应式如下： 2Na 2SO 3 2 2SO 4 剩余的Na 2SO 3与过量的碘作用 Na 2SO 3 + I 2 + H 2O Na 2SO 4 + 2HI 剩余的I 2用标准Na 2S 2O 3溶液滴定。 I 2+ 2Na 2S 2O 3 Na 2S 4O 6+2NaI ?O 2 ~ ?Na 2SO 3 ~ ?I 2 ~ ?Na 2S 2O 3 1 2 2 4 可见，每溶解1mol O 2，将消耗2mol Na 2SO 3，将少消耗2mol I 2，将多消耗4mol Na 2S 2O 3。因此可根据两次取样滴定消耗Na 2S 2O 3的摩尔数之差，计算体积溶氧速率。公式如下： 090036004tV VM tV VM N V ??= ???= 式中 N V ：两次取样滴定消耗Na 2S 2O 3体积之差， M ：Na 2S 2O 3浓度， ?t ：两次取样时间间隔，h V 0：取样分析液体积。 将上述N V 值代入公式C C N a k V L -= * 即可计算出k L a
发酵工程实验 目录 发酵罐的结构系统及使用方法实验一 实验二微生物的诱变育种乳酸菌的分离及乳酸饮料制作实验三 实验四大肠杆菌生长曲线的测定摇床培养枯草芽孢杆菌发酵条件的优化实验五
实验一发酵罐的结构系统及使用方法 一、实验目的： 1．了解发酵罐（气升式、搅拌式）的几大系统组成，即空气系统、 蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。 2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤 3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤 4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法 二、实验原理： 1．蒸汽系统： 三路进汽——空气管路、补料管路、罐体 2．温度系统： (1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。 (2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。 3．空气系统： 取气口→空压机：往复式油泵获得高脉冲的压缩空气 粗过滤器：由沙布包裹棉花压实成块状叠加制得，作用是去除部分细菌及大部分灰尘 （贮气罐）：空压机压缩使气体温度升高，经贮气使气体保温杀菌；压缩空气中有油污、水滴，且压力不稳，有一定的脉冲作用，会冲翻后面的过滤介质，贮气后可使油滴重力沉降，减小脉冲。（冷却塔）：有降温并稳定作用，同时经旋风分离器进行气液分离 (丝网分离器)：通过附着作用，逐步累积沉降而分离5微米以上的微粒 其作用介质为铜丝网 (加温器)：对压缩空气升温，除湿，使湿度达50%-60% 总过滤器：纱布包裹棉花加活性炭颗粒，逐层压紧而成。 分过滤器：平板式纤维，中间为玻璃纤维或丝棉，下面放水阀应适时打开放出油、水，再用压缩空气控干。 种子罐或发酵罐 4．补料系统：补培养基、消泡剂、酸碱等。 5．在线控制系统：热电偶（温度探关）、溶氧探头、pH探头（后二者实消时才安装，为不可再生探头，有限定使用次数，pH探头使用前要先校准）、控制柜、数据采集系统。 。)取样口(、出料口)接种口(、进出料系统：进料口6．
发酵工程与设备实验 1.决定摇瓶溶氧量的因素有哪些？它们如何影响摇瓶溶氧量？答：⑴摇瓶的透气性：8层纱布，纱布透气性越好，摇瓶溶氧量越大。⑵摇瓶的转速：转速越大，培养基流动越剧烈，增大与气体接触面积。⑶培养基的粘稠度：粘稠度越大，氧气越难进入，溶氧量越低。 2.采用磷钼蓝法测定发酵液中的植酸酶活性实验中，空白对照中并未发生酶和底物的水解反应，但经过显示后，颜色却呈较深的蓝色，试解释其原因。 答：①磷钼蓝受热，易被氧化成蓝色还原物。②植酸钠中含杂质磷太多。 3.红曲米发酵实验中，为何要添加酸水？无菌酸水如何制得？答：是为了洗脱菌种，同时为红曲霉生长创造酸性环境。 制备：取一烧杯的蒸馏水，往水中加入乳酸并调PH至4.0.然后取10ml配制好的溶液于干净的试管中，密封包扎后，放入高压灭菌锅灭菌，即可得到无菌酸水。 4.产植酸酶黑曲霉的分离实验中，为何选用植酸钙而不选用植酸钠？ 答：钠盐易溶解、钙盐难容，易形成透明圈，从而筛选。 5.产植酸酶黑曲霉的分离实验中，为什么不将脱氧胆酸钠溶液
和氯霉素眼药水加入到筛选培养基中一起灭菌？ 答：①脱氧胆酸钠会与铁盐高温时反应。②细菌性抗生素、自身就是杀菌的，且本身无菌，也不能灭菌。 6.请详细说明产植酸酶黑曲霉的分离实验的实验原理。 答：以植酸钙为唯一磷来源的选择培养基，同时以透明圈法，从土壤中分离筛选产植酸酶的黑曲霉 7.产植酸酶黑曲霉的摇瓶发酵实验中，摇瓶的作用有哪些？答：①气体和营养分布均匀②温度保持恒定③代谢产物分散④避免影响其他菌丝生长⑤防止细胞沉淀 8.植酸酶酶活力测定实验中，若显色后的反应体系测定吸光度值为2.23，说明什么问题？该如何调整实验方案？ 答：浓度过大，该稀释。 9.植酸酶活力测定时做标线的目的是什么？ 答：标线是反应吸光度与无机磷浓度之间的关系，待我们测的样品吸光度后即可在标线上读出对应无机磷浓度，从而进行酶活计算。 10.简述灭菌锅的使用方法及步骤。 答：①向锅内注入水至三脚架上边缘、预热。 ②放入物品，将直排气管并放入排气槽。 ③关盖，拧紧对应螺栓，打开开关加热 ④待压力达到0.05MPa，排冷空气，归零。
发酵工程学实验报告实验四、甜酒酿的制作 学院生命科学学院 专业应用生物教育 班级12应生A班 姓名李顺昌 学号124120218 实验课程甜酒酿的制作 指导教师许波 开课学期2014—2015学年下学期
实验四、甜酒酿的制作小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤一、实验目的 学习并掌握甜酒酿的酿制方法 二、实验设备与材料 1.设备：天平、灭菌锅、盆、容器（口缸）、保鲜膜、培养箱等 2.材料：糯米（约400g/人）、市售甜酒药、冷开水 三、实验原理 1、将蒸熟的米饭经接种酒酿种曲后，在适宜的培养条件下，让种曲中的根霉孢子萌发菌丝体，大量繁殖后通过淀粉酶等的作用，将淀粉转化为葡萄糖，从而使甜酒酿具有独特的甜醇口味。 2、从微生物的观点来看，酿制的关键在于： 要有优质的酒酿种曲，即种曲中应含有糖化率很高的优质根霉孢子或菌丝体；应选择优质的糯米作原料；严格无菌操作规程，尽量避免杂菌污染；制作甜酒酿的器具都要清洗干净；合理控制酿制条件等。 四、实验方法步骤 浸米→蒸饭→淋饭→拌酒药→搭窝→保温培养 1、蒸饭：将滤干水分的糯米，扎紧纱布口后放入灭菌锅；于115-121℃灭菌20~25min，到米饭熟透为止。 2、淋饭：加少许冷开水淋洗糯米饭，边淋边拌，使米饭迅速冷却至35℃左右。 3、拌酒药（接种）：按干糯米的重量换算接种量( 0.35% ) ；将酒药均匀地
撒在冷却的糯米饭中（稍微留下一点点酒曲最后用），拌匀。
4、搭窝：将拌好酒药的米饭装入容器后（不能压太紧），将饭粒搭成中心下陷的凹窝（中间低、周围高）；饭面和凹窝中均匀撒上少许酒药，倒入少量的冷开水，盖上盖子或保鲜膜； 5、保温培养：28℃培养约24-48小时，待凹窝内有少许液体渗出即可食用（下周一取）；酿成的甜酒酿应是醪液清澈、半透明而甜醇爽口。
发酵实验报告四甜酒酿 的制作 集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]
发酵工程学实验报告实验四、甜酒酿的制作 学院生命科学学院 专业应用生物教育 班级12应生A班 姓名李顺昌 学号124120218 实验课程甜酒酿的制作 指导教师许波 开课学期2014—2015学年下学期
实验四、甜酒酿的制作小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤一、实验目的 学习并掌握甜酒酿的酿制方法 二、实验设备与材料 1.设备：天平、灭菌锅、盆、容器（口缸）、保鲜膜、培养箱等 2.材料：糯米（约400g/人）、市售甜酒药、冷开水 三、实验原理 1、将蒸熟的米饭经接种酒酿种曲后，在适宜的培养条件下，让种曲中的根霉孢子萌发菌丝体，大量繁殖后通过淀粉酶等的作用，将淀粉转化为葡萄糖，从而使甜酒酿具有独特的甜醇口味。 2、从微生物的观点来看，酿制的关键在于： 要有优质的酒酿种曲，即种曲中应含有糖化率很高的优质根霉孢子或菌丝体；应选择优质的糯米作原料；严格无菌操作规程，尽量避免杂菌污染；制作甜酒酿的器具都要清洗干净；合理控制酿制条件等。 四、实验方法步骤 浸米→蒸饭→淋饭→拌酒药→搭窝→保温培养 1、蒸饭：将滤干水分的糯米，扎紧纱布口后放入灭菌锅；于115-121℃灭菌20~25min，到米饭熟透为止。 2、淋饭：加少许冷开水淋洗糯米饭，边淋边拌，使米饭迅速冷却至35℃左右。 3、拌酒药（接种）：按干糯米的重量换算接种量( 0.35% ) ；将酒药均匀地撒在冷却的糯米饭中（稍微留下一点点酒曲最后用），拌匀。 4、搭窝：将拌好酒药的米饭装入容器后（不能压太紧），将饭粒搭成中心下陷的凹窝（中间低、周围高）；饭面和凹窝中均匀撒上少许酒药，倒入少量的冷开水，盖上盖子或保鲜膜； 5、保温培养：28℃培养约24-48小时，待凹窝内有少许液体渗出即可食用
1、举出几例微生物大规模表达的产品,及其产生菌的特点？ A.蛋白酶表达产物一般分泌至胞外，能利用廉价的氮源，生长温度较高， 生长速度快 ,纯化、分离及分析快速；安全性高，得到 FDA的批准的菌种。 B.单细胞蛋白生长迅速，营养要求不高，易培养，能利用廉价的培养基或生 产废物。适合大规模工业化生产，产量高，质量好。安全性高，得到 FDA的批准的菌种。 C.不饱和脂肪酸生长温度较低，安全性高，能利用廉价的碳源，不饱和脂 肪酸含量高， D.抗生素生产性能稳定，产量高，不产色素，，能利用廉价原料 F.氨基酸代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单 2、工业化菌种的要求？ A能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 B有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强C. 遗传性能要相对稳定 D.不易感染它种微生物或噬菌体 E.产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关） F.生产特性要符合工艺要求 4、讨论：微生物（包括动、植物）可以生产我们所需的一切产品，但是涉 及到工业化生产，对于某一种特定的产品，为何只有特定的微生物才具有大量 表达的潜力？ 在不同的环境条件下，微生物细胞对遗传信息作选择性的表达，实现代谢 的自动调节。代谢的协调能保证在任何特定时刻、特定的细胞空间，只合成必 要的酶系（参与代谢的多种酶）和刚够用的酶量。一旦特定物质的合成达到足 够的量，与这些物关系支持细胞自身的增殖（生产细胞），不支持（人的）目
的产物的过量生产（生产特定的初级代谢产物）。而工业化生产要求特定表达 某种或某类物质，只有正常代谢被打破，代谢协调失常的微生物才能达到要求 5、自然界分离微生物的一般操作步骤？ 样品的采取→预处理→培养→菌落的选择→初筛→复筛→性能的鉴定→菌种保藏 6、从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集培养？ 自然界中目的微生物含量很少，非目的微生物种类繁多，进行富集培养， 使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下 的劣势种变成人工环境下的优势种，使筛选变得可能。 7、菌种选育分子改造的目的？ 防止菌种退化 ; 解决生产实际问题 ; 提高生产能力 ; 提高产品质量 ; 开发新产品 . 8、以目前的研究水平，土壤中能够培养的微生物大概占总数的多少？什么 是 16sRNA同源性分析？ 目前能够培养的微生物不到总数的 1%。以 16sRNA为靶基因，设计引物， 建立 pcr 扩增体系，再通过 DNA 测序进行细菌同源性分析。 9、什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？ 自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过 程。
实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数(5学时) 实验目的： １、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。 2、了解市售酸奶的生产工艺。 3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。 实验原理: 乳酸菌在乳中生长繁殖,发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸,导致乳的ｐH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。 乳酸菌属于兼性厌氧微生物,在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。实验内容: （一）酸奶制作 1、10%脱脂奶粉溶解于热水(80℃左右)中,充分搅拌均匀，配成调制乳； 2、添加蔗糖:为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶口味,在调制乳中加人4-8%的蔗糖。 ３、灭菌：方法有两种：将乳加热至90℃，保温5min； 4、接种:往冷却到43－4５℃灭过菌的乳中加入乳酸菌，接种量为2%－５%。 5、分装:酸奶受到振动,乳凝状态易被破坏,因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进行分装,须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到小容器中，加盖后送入恒温室培养，在小容器中发酵制成酸奶。 6、发酵:发酵的温度保持在40-43 ℃，一般发酵时间为3－6h。 发酵终点的确定有两种方法: 1)检测发酵奶的酸度，达到65－７0 T°。 2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差,而且瓶中部有细微颗粒出现。 7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出,用冷风迅速将其冷印到1０℃以下,一般2 h,使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。 8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。 ９、感官指标 １）色泽：色泽均匀一致，呈乳白色,或稍带微黄色。 2）组织状态:凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。 3)气味：具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味,无霉味和其他外来不良气味。（二）乳酸菌活菌检测 ①、检测培养基：蛋白胨15g,牛肉膏５ｇ，葡萄糖20g，氯化钠５ｇ，碳酸钙10ｇ, 琼脂粉20ｇ，水１000ｍl,115~121℃灭菌20mｉn,灭菌后放置水浴52℃保温备用。
发酵工程习题及思考题库 一、填空题 1. 淀粉水解糖的制备可分为酸解法、酶解法和酸酶结合法 三种。 2. 糖酵解途径中的三个重要的关键酶是己糖激酶、磷酸丙糖激酶、丙酮酸激酶。 3. 甘油的生物合成机制包括在酵母发酵醪中加入亚硫酸氢钠 与乙醛起加成反应和在碱性 条件 下乙醛起歧化反应。 4. 微生物的吸氧量常用呼吸强度；耗氧速率两种方法来表示，二者的关系是 5. 发酵热包括生物热；搅拌热；蒸发热和辐射热等几种热。 6. 发酵过程中调节pH 值的方法主要有添加碳酸钙法；氨水流加法和尿素流加法。 7. 微生物工业上消除泡沫常用的方法有化学消泡和机械消泡两种。。 8. 一条典型的微生物群体生长曲线可分为迟滞期、对数期；稳定期；衰亡期四个生长时期。 9. 常用菌种保藏方法有斜面保藏法、沙土管保藏法、液体石蜡保藏法；真空冷冻保藏法等。 10. 培养基应具备微生物生长所需要的五大营养要素是碳源、氮源；无机盐；生长因子和水。 11. 提高细胞膜的谷氨酸通透性，必须从控制磷脂的合成着手或者使细胞膜受损伤。 12. 根据微生物与氧的关系，发酵可分为有（需）氧发酵；厌氧发酵两大类。 13. 工业微生物育种的基本方法有自然选育、诱变育种；代谢控制育种；基因重组和定向育种等。 14. 肠膜明串珠菌进行异型乳酸发酵时，产物为乳酸；乙醇；CO2。 15. 诱导酶指存在底物时才能产生的酶，它是转录水平上调节酶浓度的一种方式。 16. 发酵工业的发展经历了自然发酵，纯培养技术的建立，通气搅拌的好气性发酵技术的建立， 人工诱变育种代谢控制发酵技术的建立，开拓新型发酵原料时期，与基因操作技术相结合的 现代发酵工程技术 等六个阶段。 17. 去除代谢终产物主要是通过改变细胞的膜的通透性来实现。 18. 获得纯培养的方法有稀释法，划线法，单细胞挑选法，利用选择培养基分离法等方法。 19. 生长因子主要包括维生素，氨基酸，碱基，它们对微生物所起的作用是供给微生物自身不能 合成但又是其生长必需的有机物质。 20. 微生物生长和培养方式，可以分为分批培养，连续培养，补料分批培养三种类型。 21. 发酵动力学主要内容为细胞生长动力学、基质消耗动力学及产物形成动力学。 22. 影响种子质量的主要因素包括培养基，种龄与接种量，温度，pH 值，通气和搅拌，泡沫，染 菌的控制和种子罐级数的确定。 23. 空气除菌的方法有加热杀菌法，静电除菌法，介质过滤除菌法。 24. 发酵产物的浓缩和纯化过程一般包括发酵液预处理，提取，精制。 25. 菌种扩大培养的目的是为每次发酵罐的投料提供数量相当的代谢旺盛的种子。 26. 在微生物研究和生长实践中，选用和设计培养基的最基本要求是目的明确，营养协调，物理 化学条件适宜和价廉易得。 27. 液体培养基中加入CaCO3的目的通常是为了调节pH 值。 28. 实验室常用的有机氮源有牛肉膏，蛋白胨等，无机氮源有 硫酸铵，硝酸钠， 等。为节约成 本，工厂中常用尿素、液氨等作为氮源。 29. 乳酸菌进行同型乳酸发酵时通过EMP 途径，产物为乳酸，肠膜明串珠菌进行异型乳酸发酵时 通过HMP 途径，产物为乳酸、乙醇和二氧化碳 。 30. 操纵子是由结构基因，操纵基因和启动子组成。 31. 微生物发酵培养（过程）方法主要有分批培养、补料分批培养、连续培养、半连续培养四种。 32. 发酵过程控制的目的就是得到最大的比生产率和最大的得率。 () X c Q r O ?=2
实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时） 实验目的： 1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。 2、了解市售酸奶的生产工艺。 3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。 实验原理： 乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。 乳酸菌属于兼性厌氧微生物，在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。实验内容： （一）酸奶制作 1、10%脱脂奶粉溶解于热水（80℃左右）中，充分搅拌均匀，配成调制乳； 2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶口味，在调制乳中加人4-8％的蔗糖。 3、灭菌：方法有两种：将乳加热至90℃，保温5min； 4、接种：往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加入乳酸菌，接种量为2%-5%。 5、分装：酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进行分装，须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到小容器中，加盖后送入恒温室培养，在小容器中发酵制成酸奶。 6、发酵：发酵的温度保持在40-43 ℃，一般发酵时间为3-6h。 发酵终点的确定有两种方法： 1）检测发酵奶的酸度，达到65-70 T°。 2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，而且瓶中部有细微颗粒出现。 7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，用冷风迅速将其冷印到10℃以下，一般2 h，使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。 8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。 9、感官指标 1）色泽：色泽均匀一致，呈乳白色，或稍带微黄色。 2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。 3）气味：具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。（二）乳酸菌活菌检测 ①、检测培养基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g， 琼脂粉20g，水1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。
发酵工程实验指导书 辽宁石油化工大学环境与生物工程学院主编
《发酵工程》实验指导书 实验学时：24学时 适用专业：生物工程 生物技术是当前优先发展的高新技术之一，本课程是为了和生物工程专业理 论教学相配合，通过实践教学，培养学生对生物工程专业知识的具体实际应用的 能力。 发酵工程实验是以实验操作为主的技能课程，是生物工程专业学生的必修课， 是在学生学习了《生物化学及实验》、《微生物学及实验》等专业基础课及专业 实验课的基础上开设的，课程目的在于通过本课程的实验训练，使学生对整个微 生物生产过程有一个全面的认识和理解，既可培养他们实际操作的技能，又可达 到提高他们理论联系实际能力的目的。通过学习，使学生能掌握发酵工程常用的 实验方法和常见的发酵工程设备，为以后的学习和科研工作打下良好的基础。 本实验指导书包括： 实验一、细菌增殖曲线的测定（6学时） 实验二、土壤中放线菌的分离与纯化（6学时） 实验三、发酵菌株的初筛 实验四、枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育（6学时）（必做） 实验五、淀粉酶的固态发酵（6学时） 实验六、发酵过程中糖的利用（6学时） 实验七、玉米淀粉液化和糖化（6学时） 实验八、淀粉酶的固定化生产（6学时） 实验九、摇床培养确定酵母菌体的培养和营养条件（6学时）（必做） 实验十、小型连续发酵实验（6学时） 实验十一、甜酒酿的制作（6学时） 备注：实验一至实验七为基础实验，实验八至实验十一为设计性和综合性实验，除必做实验外，其他可选做。 实验总时间为24学时，包括设计实验、准备实验、进行实验、书写实验预习 及最终报告及所需仪器药品清单等。
实验一发酵菌株的初筛 一、实验目的与要求 目的： 1、从已分离到的细菌或真菌中筛选出能产生生理活性物质的菌株。 2、学习淀粉酶、蛋白酶产生菌的筛选方法。 要求： 1、复习微生物学及实验过程所学到的微生物培养的方法和过程，了解影响微生物生长各种条件因素。 2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。 3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。 4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。 二、实验原理 淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。 蛋白酶也是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。根据三氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根据透明圈大小还能判断产酶活力。 本实验以淀粉酶或蛋白酶产生菌株的筛选为例，介绍发酵菌种的初步筛选方法。 三、实验主要仪器设备及材料 1.菌株：自然界中分离到的目的菌株 2.淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.2%。琼脂2%，pH 7.2-7.4。 3.蛋白酶产生菌筛选培养基：葡萄糖0.05,氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.05%，
1.决定摇瓶溶氧量的因素有哪些它们如何影响摇瓶溶氧量 2.采用磷钼蓝法测定发酵液中的植酸酶活性实验中，空白对照中并未发生酶和底物的水解反应，但经过显示后，颜色却呈较深的蓝色，试解释其原因。 答：磷钼蓝作为显色液，是需要现配现用的，因为磷钼蓝比较容易被氧化，产生蓝色还原物。当对样品和空白对照进行水浴显色时，空白对照因为受热，被氧化的程度深，所以空白对照中并未发生酶和底物的水解反应，但经过显示后，颜色却呈较深的蓝色。 3.红曲米发酵实验中，为何要添加酸水无菌酸水如何制得 答：此题课堂上未讲 4.产植酸酶黑曲霉的分离实验中，为何选用植酸钙而不选用植酸钠 因为在植酸盐为产植酸酶黑曲霉的唯一磷来源，将植酸钙加入培养基中，可以使培养基变得混浊，待植酸钙被利用后会产生较明显的透明圈，以便从透明圈中分离出产植酸酶黑曲霉，而用植酸钠则不会产生透明圈 5.产植酸酶黑曲霉的分离实验中，为什么不将脱氧胆酸钠溶液和氯霉素眼药水加入到筛选培养基中一起灭菌 答：氯霉素眼药水是由特定的厂家生产的，在生产过程中就已经进行了灭菌，另外氯霉素本身就具有杀菌作用，所以在试验中不需要灭菌；脱氧胆酸钠会与培养基中的铁盐成分在高温时发生反应。 6.请详细说明产植酸酶黑曲霉的分离实验的实验原理。 答：利用透明圈法，提供唯一磷源，设计筛选培养基从样品中分离目标微生物—产植酸酶黑曲霉7.产植酸酶黑曲霉的摇瓶发酵实验中，摇瓶的作用有哪些 答：1、气体和营养分布均匀2、温度保持恒定，不会出现局部高低温3、代谢产物分散4、避免影响其他菌丝生长 8.植酸酶酶活力测定实验中，若显色后的反应体系测定吸光度值为，说明什么问题该如何调整实验方案 答：这种现象说明了待测物的浓度过大，调整方案是稀释待测物 9.植酸酶酶活力测定实验中，做标线的目的是什么 答：标线是反应吸光度与无机磷浓度之间的关系，从而使得我们测了样品的吸光度后即可在标线上读出无机磷浓度，进行酶活力的计算 10.简述灭菌锅的使用方法及步骤。 答使用方法：1、向灭菌锅内注水至三脚架上边缘2、打开灭菌锅进行预热3、放入内锅，再待灭菌物整齐排放在锅内 4、把排气管捋直，放入排气槽内，盖上盖子
精心整理实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时） 实验目的： 1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。 2、了解市售酸奶的生产工艺。 3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。 实验原理： 乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。 乳酸菌属于兼性厌氧微生物，在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下 实验内容： 1、10% 2 3 4 5 6 1 2 7 8 9 1 2 3 121℃灭菌 10－1样品溶液；再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水三角瓶中，稀释至10－2，以此类推稀释至10－8，即稀释了1亿倍; ③、倒培养平板，从上述已稀释了1亿倍的乳酸菌悬液中取1ml，在无菌操作台上注入9.0cm培养皿中，再将已经灭了菌的保持 在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，与菌悬液充分混合均匀（倒入培养基后，马上用手转动培养皿，转动几下，让其混合均匀），然后等其凝固再移入培养箱中培养，注意最后一步倒平皿必须在超净台无菌操作，以免杂菌污染。每次稀释均要换灭好菌的移液管。 ④、培养条件：37℃恒温培养箱培养48～72h。 ⑤、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了1亿倍，所以一个透明圈菌落代表1亿/克，如果有200个透明圈，则是200亿/ 克。 实验器材及试剂： 菌种：市售酸奶试剂：白糖奶粉培养基各成分
器材：培养箱、电炉、铝锅5L，培养皿，酸奶发酵瓶（自带） 实验结果： 1、详细描述自己制作的酸奶结果： 答：制作后酸奶与市场所售酸奶比较，比市场所售酸奶更稠密，酸奶的香味与酸味明显，制作成功 2、记录个人酸奶中各菌数测定的平行数据，计算最终平均值。 答：最终培养基上未出现乳酸菌菌落，全部为杂菌菌落，因此无法统计酸奶中的菌含量 3、同时用图片记录实验过程中各现象与结果并对图进行注释。 答：制备乳酸菌时，瓶子上方留有一部分空间，并未使乳酸菌完全处于无氧环境中发酵，但乳酸菌是兼性厌氧菌，因此在存在少量氧气的环境中，乳酸菌也可以生长，酸奶制备成功。但在平板接种时，由于污染杂菌，乳酸菌并未长出。乳酸菌计数失败。 思考题： 实验目的： 1 2 3 实验原理： 的一种， )， 细胞。 实验内容： 1 2 每置37℃控温摇床培养。转速200r·min-1，至芽孢率达90%以上时停止，约需24h。 3、固体发酵培养基：麸皮60%，稻草粉10%，玉米粉5%，豆粕25%，硫酸镁0.05%，硫酸铵0.5%，料水比为1:1.1。 4、三角瓶固体发酵培养： 每250mL三角瓶装量20-30g（湿重），固体发酵培养基原料试剂混合料，加水，料水比为1:1.1，搅拌均匀，培养基经121℃灭菌30min，降温后接种量为2%(V/M：V—液体菌种体积数，M—固体发酵培养基的质量)，然后置37℃培养箱中静止培养，间时拍打，使其均匀生长。至脱落芽孢率为80%以上时，停止发酵，约需48h。 （二）枯草芽孢菌活菌检测 ①、检测培养基：葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，琼脂粉2%，pH7.0。115℃灭菌20min，灭菌后放置水浴 52℃保温备用。 ②、稀释：取10克样品放入添加90ml无菌水的带玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm震荡30min，即为10－1样品溶液； 再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水的三角瓶中，稀释至10－2，……以此类推稀释至10－8，即稀释了1亿倍;
发酵工程综合实 验报告 实验题目 蛋白酶的发酵工艺研究 院系名称 生物与食品工程学院 学院：生物与食品工程学院 2015年 7月 31日 学生姓名 杨益坤 学 号 2012214114 专业班级 生物技术12-1班 指导教师 杨 柳
目录 标题错误!未定义书签。 摘要错误!未定义书签。 关键词2 1.引言2 2.材料与方法3 2.1材料3 2.1.1菌种3 2.1.2试剂3 2.1.3培养基4 2.1.4实验仪器4 2.2方法4 2.2.1蛋白酶酶活测定4 2.2.2总可溶性糖测定5 2.2.3枯草芽孢杆菌发酵实验6 2.2.4发酵罐实验6 2.2.5蛋白酶性质实验7 3.结果与分析7 3.1透明圈观察7 3.2标准曲线8 3.2.1酪氨酸标准曲线8 3.2.2葡萄糖标准曲线9 3.3不同装液量摇瓶发酵实验9 3.4小型发酵罐发酵实验11 3.5蛋白酶性质研究12 3.5.1最适pH测定及pH影响酶稳定性的研究12 3.5.2最适温度测定及p温度影响酶稳定性的研究13 3.6小结15 4.致16 5.参考文献17
蛋白酶的发酵工艺研究Study on Protease Fermentation Conditions 摘要： 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能够产生大量的蛋白酶，是进行蛋白酶研究的良好材料。本次实验目的在于学习蛋白酶的定性定量测定方法，考察营养及环境对酶生产的影响，以及熟悉小型发酵罐的使用。 我们控制装液量为唯一变量，测定酶活及总糖变化，最终确定最佳装液量条件为60ml。在此基础上，我们进一步确定了最适温度为40℃，最适pH为5。我们挑选透明圈较大的菌落在小型发酵罐进行发酵，定时取样测定酶活与总糖，绘制发酵曲线，从而了解菌体生长情况。 Abstract: Bacillus subtilis can produce much protease and can be a good meterial for research about protease.The purposes of this experiment are learning how to measure protease qualitatively and quantificationly,investigating how the nutrition and environment influence the output of protease,and trying to be familiar with small-sized fermentation cylinder. We controlled fluid volume as the only variable quantity,measured enzyme activity and total sugar quantity,finally confirmed that the best fluid colume condition is 60ml.On this basis,we moved forward a single step to conclude that the best temperature is 40℃ and the best pH is 5.We chose the bacterial colony with bigger transparent circle to ferment in the small-sized fermentation cylinder,measured enzyme actity and total sugar quantity at regular time,then drew the fermentation curve,consequently we could know how was the situation of the growing bacterium.
第一篇微生物工业菌种与培养基 一、选择题 2．实验室常用的培养细菌的培养基是（） A 牛肉膏蛋白胨培养基 B 马铃薯培养基 C 高氏一号培养基 D 麦芽汁培养基 3．在实验中我们所用到的淀粉水解培养基是一种（）培养基 A 基础培养基 B 加富培养基 C 选择培养基 D 鉴别培养基 7．实验室常用的培养放线菌的培养基是（） A 牛肉膏蛋白胨培养基 B 马铃薯培养基 C 高氏一号培养基 D 麦芽汁培养基 8．酵母菌适宜的生长pH值为（） A 5.0-6.0 B 3.0-4.0 C 8.0-9.0 D 7.0-7.5 9．细菌适宜的生长pH值为（） A 5.0-6.0 B 3.0-4.0 C 8.0-9.0 D 7.0-7.5 10.培养下列哪种微生物可以得到淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、多肽类抗生素、氨基酸、 维生素及丁二醇等产品。 A 枯草芽孢杆菌 B 醋酸杆菌 C 链霉素 D 假丝酵母 二、是非题 1.根据透明圈的大小可以初步判断菌株利用底物的能力( ) 2.凡是影响微生物生长速率的营养成分均称为生长限制性基质。（） 3.在最适生长温度下，微生物生长繁殖速度最快，因此生产单细胞蛋白的发酵温度应选择最适生长温度。（） 4.液体石蜡覆盖保藏菌种中的液体石蜡的作用是提供碳源( ).
5.种子的扩大培养时种子罐的级数主要取决于菌种的性质、菌体的生长速度、产物品种、 生产规模等（） 6.碳源对配制任何微生物的培养基都是必不可少的．（） 7.亚硝基胍能使细胞发生一次或多次突变,尤其适合于诱发营养缺陷型突变株,有”超 诱变剂”之称. 9.参与淀粉酶法水解的酶包括淀粉酶、麦芽糖酶和纤维素酶等。（） 三、填空题 1.菌种扩大培养的目的 是。 2.进行紫外线诱变时,要求菌悬液浓度:细菌约为 ,放线菌为 ,霉 菌为 . 3.培养基应具备微生物生长所需要的六大营养要素是_ ___、__ __、__ __、___ ___、 __ __和____ ___。 4.碳源物对微生物的功能是__ __和 __ __，微生物可用的碳源物质主要有___ _、___ _、 __ _、__ _、__ __等。 5.工业发酵常用的有机氮源主要有_ _、_ _、_ __、 _ __、__ _等。 7.常用的纯种分离方法有, , 三种. 9.在微生物研究和生长实践中，选用和设计培养基的最基本要求是__ _、 _ _、_ _、 _ _和__ _。
《发酵工程实验》 实验五、一级种子的制备 一、实验目的 1、了解发酵工业菌种的制备过程及质量控制。 2、熟悉发酵实验的一级菌种制备。 二、实验原理 菌种制备的主要手段是扩培，其出发点是尽可能培养出高活性的、能满足大规模发酵需要的纯种。由于现代生产菌种的生产性能已非常高，因此，菌种在培养过程中自发突变往往以负向突变为主，加上平时操作中可能有污染，导致发酵菌种容易退化。因此，菌种的管理主要有两点：分离纯化和扩大培养。前者目的为分离出单细胞菌落，保证菌种的性能稳定。后者目的是为发酵生产提供充足的高活性菌种，分斜面菌种、一级菌种和二级菌种。 在进行各级菌种的扩培时，菌种的质量要达到发酵要求。比较简单的做法是用显微镜观察细胞的形态是否正常、测定种子培养基的pH值是否正常及细胞生长繁殖活力等。 三、实验器材与试剂 1、菌种 实验二中筛选到的-淀粉酶产生菌(酵母)。 2、培养基（W/V） （1）斜面培养基（已制备） （2）摇瓶种子培养基：蔗糖20g/L，蛋白胨5.0g/L，磷酸氢二钠4.0g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH为5.0-5.5。250ml三角瓶中装培养基50ml，8层纱布封口，0.1MPa 灭菌20min（现用现配）。 四、实验步骤 1、斜面接种 挑取保藏菌种接种到斜面培养基上，28℃培养24h。仔细观察斜面菌苔生长情况（菌苔的颜色、边缘等特征是否正常），有无感染杂菌。 2、镜检 在无菌条件下，挑取斜面菌苔少许，在载玻片上制成涂片，在显微镜下检查菌苔形态特征，大小、均匀情况。 3、摇瓶培养
挑取经镜检确定后的活化斜面菌苔3-5环，接入上述液体培养基中，28℃恒温摇床培养(180rpm)，培养12h。观察摇瓶菌液外观稠度、静置沉降情况。镜检菌液中菌体细胞的形态是否正常（大小均匀程度等）及测定培养液中pH。 五、注意事项 1、出现污染征象的斜面培养活化菌苔坚决不能使用。 2、菌种的污染，势必导致发酵的失败，轻者产量降低，严重的不积累产物。因此，在菌种制备过程中，都要树立牢固的无菌概念，力求细致、到位。
实验一淀粉酶生产菌的筛选 一、实验目的 学习淀粉酶产生菌的筛选方法。 二、实验原理 淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域有广泛用途。淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。 三、实验用品 1．样品 淀粉含量丰富的土样。 2．培养基 肉汤培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至1000ml，。121℃灭菌20min。 初筛平板培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂18g，加水至1000ml，。121℃灭菌20min。 Lugol碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水即可。 3．器材 高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，电子天平，电炉，恒温振荡器，恒温培养箱；烧杯，量筒，三角瓶，培养皿，移液管，洗耳球，试管，试管架，接种针，涂布棒。 四、实验方法 1．培养基制备： 配制肉汤培养基45ml，分装于250ml三角瓶中，纱布封口，灭菌。配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。
2．倒平板： 将融化的初筛平板培养基冷却至50～60℃，以无菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，至盖满底部。冷却凝固待用。 3．样品预处理： 取5g土样接入45ml肉汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。另取4支试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每支试管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液，加入到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-3试管中，依此类推直至10-5试管。 4．平板涂布分离： 分别从不同稀释度的试管中吸取悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24～48h。 5．菌株检测： 待初筛平板长出菌落后，根据菌落不同挑取菌落进行保存并编号。同时，将检测试剂（Lugol碘液）加入到平板中，涂布均匀，菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株，记住其编号，以便进行下一步实验。 6．保存菌种： 将得到的菌株转接至斜面培养基上，30℃培养48～72h，待菌苔长好后，4℃保存。 五、思考题 微生物菌种的分离筛选通常包括哪几个部分？