小鼠实验操作
（一）、实验动物的选择原则
1、尽量选择与人体结构、机能、代谢及疾病特征相似的动物；
2、选用的实验动物的解剖、生理特点应符合实验目的；
3、根据人与实验动物对同一刺激的反应差异，选用具有明显反应的动物；
4、根据生物医学研究必须达到的精确度，选用结构功能简单又能反映研究指标的动物；
5、选用患有人类类似疾病的近交系或突变系动物；
6、选用与实验设计、技术条件、实验方法等相适应的标准化动物；
7、在不影响实验目的与结果的前提下，选择最易获得、最经济、便于操作管理的动物；
8、供实验用的动物应具备质量合格证。
（二）、常用实验动物的特点
1、小白鼠
是实验室最常用的一种动物。易于大量繁殖，且价廉，适用需要大量动物的实验，如药物筛选、半数致死量测定、药物效价比较、抗感染、抗肿瘤药物及避孕药物的研究等。
2、大白鼠
与小白鼠相似。一些在小白鼠身上不便进行的实验可选用大白鼠，如药物抗炎作用的实验常选用大白鼠踝关节制备关节炎的模型。此外，也可用大白鼠直接记录血压、作胆管插管，或用大白鼠观察药物的亚急性或慢性毒性。大白鼠的血压和人相近，且稳定，现常用于抗高血压药物实验。
3、豚鼠
是实验室常用动物之一。对组织胺很敏感，容易致敏，常用于平喘药和抗组胺药的实验。对结核菌亦敏感，故也用于抗结核药的研究。此外还用于离体心脏及平滑肌实验，其乳头肌和心房常用于电生理特性及心肌细胞动作电位实验，研究抗心律失常药物的机理。
（三）、实验动物选择的注意事项
由于动物对外界刺激的反应存在个体差异，在选择实验动物时，还应注意动物的年龄、体重、性别、生理状态、健康状况及其品系、等级等因素对实验的影响。
二、实验动物的性别鉴别与编号
（一）、实验动物的性别鉴别
药理学实验常用的动物中，较大的动物(如家兔、猫、犬等)可以从生殖器分辨其性别，而较小的动物(如小白鼠、大白鼠、豚鼠等)的性别鉴别，通常以肛门与生殖孔之间的距离来判断，距离近者为雌性，距离远者为雄性。
（二）、实验动物的编号
药理实验中常用多只动物同时进行实验，为避免混乱应将动物进行编号。实验动物编号的目的在于将观察范围内的同种动物进行区别，以便于观察。常用的方法有染色法、耳缘剪孔法、烙印法和号牌法等，可根据实验目的、动物种类和具备的条件选用，一般编号应具有清晰易辨、简便耐久的特点。猫、犬、兔等较大的动物可用特别的号码牌固定于身上。小白鼠、大白鼠及白色家兔等用黄色苦味酸涂于动物不同部位进行染色标记而编号。例如在小白鼠，右前肢皮肤外侧涂色标记为1号，腹部右外侧皮肤涂色标记为2号，右后肢皮肤外侧涂色标记为3号，头部皮肤涂色标记为4号，背部正中皮肤标记为5号，尾巴根部标记为6号，7、8、9号在左侧同1、2、3号，第10号不涂黄色。大白鼠的编号与小白鼠相同。
第二节实验动物的捉拿、给药和处死方法
（一）、小白鼠、大白鼠
1、捉拿法：小白鼠可采取双手法和单手法两种形式。
双手法：右手提起鼠尾，放在鼠笼盖或其他粗糙面上，向后方轻拉，小白鼠则将前肢固定于粗糙面上。此时迅速用左手拇指和食指捏住小白鼠颈背部皮肤(图1)，并以小指与手掌尺侧夹持其尾根部，固定于手中。
单手法：小白鼠置于笼盖上，先用左手食指与拇指抓住鼠尾，手掌尺侧及小指夹住尾根部，然后用左手拇指与食指捏住颈部皮肤。
大白鼠容易激怒咬人，捉持时左手应戴防护手套或用厚布盖住大鼠，先用右手抓住鼠尾，再用左手拇指和食指握住头部，其余手指与手掌握住背部和腹部(图2)。不要用力过大，切勿捏其颈部，以免窒息致死。
2、给药方法
小白鼠
（1）、灌胃(po)：左手固定小鼠，右手持灌胃器，灌胃针头自口角进入口腔，紧贴上腭插入食道(图3)，如遇阻力，将灌胃针头抽回重插，以防损伤。常用灌胃量为～ ml/10g。
（2）、皮下注射(ih)：可用腹部、背部、腹股沟的皮下，此处皮肤比较松弛，也可由助手协助。注药量一般为～ ml/10g。（3）、肌肉注射(im)：一人抓住小鼠头部皮肤和尾巴，另一人持连4号针头的注射器，将针头刺入后腿外侧肌肉。注射量一般不超过～ ml/只。
（4）、静脉注射(iv)：将小鼠置入固定器，酒精涂擦尾部，以使血管扩张。自尾部末端刺入，刺入血管后抽针芯可见回血。常用注射量为～ ml/10g。
（5）、腹腔注射(ip)：将小鼠固定后，从下腹部外侧进针，深度较皮下注射深(图4)。常用注射量为～ ml/10g。
大鼠灌胃、腹腔注射、皮下注射及尾静脉注射与小鼠相似。静脉注射也可在麻醉下行舌下静脉注射。
3、处死方法
（1）、颈椎脱位法：
术者左手持镊子或用拇指、食指固定小鼠头后部，右手捏住鼠尾，用力向后
上方牵拉，听到鼠颈部喀擦声即颈椎脱位，脊髓断裂，鼠瞬间死亡。
（2）、打击法：用手抓住鼠的尾并提起，朝地面用力撞击鼠头致死（也可用小木锤用力打击鼠头
（3）、吸入麻醉法：吸过量的乙醚。
（4）、大量放血法：可采用眼眶动、静脉放血致死。
（5）、空气栓塞法：将空气急速注入静脉致死。小白鼠可注入空气。
（三）、豚鼠
1、捉拿法：
豚鼠性情温顺不咬人，可用左手直接从背侧握持前部躯干，体重小者用一只手捉持，体重大者宜用双手，右手托住臀部(图6)
2、给药方法
灌胃（见图6）、皮下注射、肌肉注射及腹腔注射方法基本同小鼠，给药量稍多。静脉注射可选后脚掌外侧静脉或颈外静脉
3、处死方法
豚鼠可采用注射麻醉法，即注射戊巴比妥钠麻醉处死。豚鼠可注射麻醉剂量的3倍以上的量腹腔内注射。还可采用吸入麻醉法。
第二节实验动物的取血方法
一、小鼠和大鼠
1、剪尾取血法：
将清醒鼠装入深颜色的布袋中，将鼠身裹紧，露出尾巴，用酒精涂擦或用温水浸泡使血管扩张，剪断尾尖后，尾静脉血即可流出，用手轻轻地从尾根部向尾尖挤捏，可取到一定量的血液。取血后，用棉球压迫止血。也可采用交替切割尾静脉方法取血。用一锋利刀片在尾尖部切破一段尾静脉，静脉血即可流出，每次可取～ ml，供一般血常规实验。三根尾静脉可替换切割，由尾尖向根部切割。由于鼠血易凝，需要全血时，应事先将抗凝剂置于采血管中，如用血细胞混悬液，则立即与生理盐水混合。
2、眼球后静脉丛取血法：
左手持鼠，拇指与中指抓住颈部皮肤，食指按压头部向下，阻滞静脉回流，使眼球后静脉丛充血，眼球外突。右手持1％肝素溶液浸泡过的自制吸血器，从内呲部刺入，沿内下眼眶壁，向眼球后推进4～5 mm，旋转吸血针头，切开静脉丛，血液自动进入吸血针筒，轻轻抽吸血管(防止负压压迫静脉丛使抽血更困难)，拔出吸血针，放松手压力，出血可自然停止。也可用特制的玻璃取血管(管长7～10 cm，前端拉成毛细管，内径～ mm，长为1 cm，后端管径为 cm)。必要时可在同一穿刺孔重复取血。此法也适用豚鼠和家兔。
3、眼眶取血法：
左手持鼠，拇指与食指捏紧头颈部皮肤，使鼠眼球突出，右手持弯镊或止血钳，钳夹一侧眼球部，将眼球摘出，鼠倒置，头部向下，此时眼眶很快流血，将血滴入预先加有抗凝剂的玻璃管内，直至流血停止。此法由于取血过程中动物未死，心脏不断跳动，一般可取鼠体重4％～5％的血液量，是一种较好的取血方法，但只适用一次性取血。
4、心脏取血：
动物仰卧固定于鼠板上，用剪刀将心前区毛剪去，用碘酒、酒精消毒此处皮肤，在左侧第3～4肋间用左手食指摸到心搏，右手持连有4～5号针头的注射器，选择心搏最强处穿刺，当针头正确刺入心脏时，鼠血由于心脏跳动的力量，血自然进入注射器。
5、断头取血：
实验者带上棉手套，用左手抓紧鼠颈部位，右手持剪刀，从鼠颈部剪掉鼠头迅速将鼠颈端向下，对准备有抗凝剂的试管，收集从颈部流出的血液，小鼠可取血～ ml，大鼠可取血5～10 ml。
6、颈动静脉、股动静脉取血：
麻醉动物背位固定，一侧颈部或腹股沟部去毛，切开皮肤，分离出静脉或动脉，注射针沿动静脉走向刺入血管。20 g小鼠可抽血 ml，300 g大鼠可抽血8 ml。也可把颈静脉或颈动脉用镊子挑起剪断，用试管取血或注射器抽血，股静脉连续多次取血时，穿刺部位应尽量靠近股静脉远心端。
二、豚鼠
1、心脏取血：
需二人协作进行，助手以两手将豚鼠固定，腹部面向上，术者用左手在胸骨左侧触摸到心脏搏动处，一般在第4～6肋间、选择心跳最明显部位进针穿刺。针头进入心脏，则血液随心跳而进入注射器内，取血应快速，以防在试管内凝血。如认为针头已刺入心脏，但还未出血时，可将针头慢慢退出一点即可。失败时应拔出重新操作，切忌针头在胸腔内左右摆动，以防损伤心脏和肺脏而致动物死亡。此法取血量大，可反复采血。
2、背中足静脉取血：
助手固定动物，将其右或左后肢膝关节伸直提到术者面前，术者将动物脚背用酒精消毒，找出背中足静脉，以左手的拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右手拿注射针刺入静脉，拔针后立即出血，呈半球状隆起，用纱布或棉花压迫止血。可反复取血，两后肢交替使用。
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol MEF细胞铺制： 1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置 15min以上。 2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一个T25培 养瓶中加入5ml MEF完全培养液。 3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm， 离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1 × 106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后至于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。 5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸 除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。 复苏： 1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中是之迅速融解， 取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞，小鼠iPS细胞完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液2 ml， 吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免起泡。 5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。 传代： 1. 一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。 2. 吸除废液。 3. 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结 2008-06-19 00:00 来源：丁香园点击次数：1517 关键词：MEF小鼠胚胎成纤维细胞 知识总结 分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。 2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。 4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/ED TA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。 6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。 7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。 8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。 9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。 10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。
11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。 12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。 13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。 注释： 我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。 培养基成分： 88％DMEM 10％FBS 1％NEAA 1% 双抗 对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。 小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代 1、移去MEF培养基 2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。 3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法 胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。 具体步骤 一、ES培养基 在LIF存在的条件下维持细胞培养。 二、EB培养基 使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。 1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。 2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。 3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液
4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。 5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。 6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。 7. 形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。 三、ITSFn培养基 在最少量培养基中选择神经前体细胞 1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。 2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
第18卷 第1期2001年3月实验动物科学与管理 LABORATORY ANIMAL SCIENCE AND ADMINSTRATION Vol .18 No .1Mar .2001 小鼠胚胎移植技术方法比较 管 彤,王凤山,王 静,王晓军,于国德,杨梦礼 (天津市劳动卫生职业病研究所,天津 300204) 摘要:以近交系小鼠C 57BL 6J 、BDF 1小鼠作为供体胚小鼠,封闭群昆明种小鼠作为代母,对实验小鼠胚胎移植的三种方法,即:对小鼠受精卵(或2个细胞期胚)经由代母输卵管口移植、经由代母输卵管壁移植及对小鼠进行子宫移植(8细胞期胚)的方法了进行实验研究,并对各方法适于使用的动物对象、实验要求、产仔率、优势与不足等做了进一步的探讨,为今后的实验动物与动物实验提供参考依据。关键词:近交系小鼠;输卵管口(壁);移植;子宫移植 中图分类号:S865.13 文献标识码:A 文章编号:1006-6179(2001)01-0029-03 收稿日期:2000-07-07 第一作者简介:管彤(1968-),女,助理研究员,主要从事野生小鼠资源开发及实验小鼠胚胎毒理学研究。 自五十年代以来人类建立了受精卵和早期胚胎的采集技术之后,很快就完成了早期胚向代母体内 输卵管及子宫移植的胚胎移植技术的开发和研究[1] 。小鼠的胚胎移植技术对于实验动物学研究及生命科学研究具有重要价值。人类由小鼠进行发育生物学研究,包括胚胎的发生、发育、突变基因的研究、转基因动物的研究、基因打靶技术及小鼠胚胎冷冻种子库技术等涉及胚胎体外操作的各种研究,均需要进行胚胎移植入代母体内来完成。按照胚胎发 生的阶段不同,移植部位也不同[2] 。1～2个细胞期胚胎进行输卵管口移植,8细胞期至桑椹期胚进行 子宫移植。1992年,日本学者Nakagata [3] 又报道了经由输卵管壁进行输卵管移植的技术,以解决移植中一些代母品系输卵管口较小、较短的问题。 本文主要是将此三种移植方法引入,使之在本实验室成为常规后,将其应用于实验小鼠并进行了方法上的比较,重点比较了方法上的难易程度、产仔率、方法选择的前提因素。 1 材料与方法 1.1 实验动物 实验动物作为参比对照的成年近交系C 57BL 6J 小鼠、B DF 1小鼠(♀C 57BL 6J ×♂DBA 2)和作为代母的昆明种封闭群小鼠。 1.2 试剂 PMSG (pregnant mare serum gonadotropin )、HC G (human chorionic gonadotropin )、胚胎移植用Injection Medium 培养液、M 2培养基等。1.3 假孕代母的准备 1.3.1 昆明种雄性小鼠的结扎 为输卵管移植及子宫移植用代母(昆明种封闭群小鼠)交配用的雄性昆明种小鼠进行输精管结扎手术,以便制备假孕代母。进行输精管结扎手术的雄性昆明种小鼠应提前三周施行手术,术后备用。1.3.2 制备假孕代母 胚胎移植前一日(子宫移植,前三日)将已施行输精管结扎手术术后三周的昆明种雄性小鼠以1∶2与其雌性小鼠进行同笼交配,次日检查阴道栓有无,以阴道栓形成者作为移植用代母。1.4 卵的采集 1.4.1 超排卵 [4] 取出生后8～10周的C 57BL 6J 及B DF 1雌性小鼠进行PMSG 处理(腹腔注射,5IU 只),48h 后进行HC G 超排卵处理,方法、剂量相同,HC G 处理14～17h 后可进行受精卵的采集(子宫移植,为HC G 处理后第三日)。 1.4.2 交配 取已注射PMS 、HCG 后的C 57BL 6J 、B DF 1雌性小鼠与其相应的C 57B L 6J 、BDF 1雌性小鼠进行同笼
小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 一、实验材料 1.主要仪器设备 (1)倒置显微镜（Olympus，Japan） (2)CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司） (3)100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂） (4)6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm） (5)Eppendroff管 (6)1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿 (7)离心机 (8)5ml冻存管 (9)两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊） 2.主要试剂配制 (1)MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液 ——低糖DMEM母液 1)用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公 司）； 2)将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并 冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。 3)每升培养基中添加3.7gNaHCO3。 4)搅拌直至完全溶解。 5)用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容 器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。 6)立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。 ——MEF培养液 取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的 新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。 (2)PBS 在500ml超纯水中依次溶入 NaCl 4.0g KCl 0.1g Na2HPO4.12HO2 1.445g KH2PO40.1g 于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。 (3)0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液 在100ml超纯水中分别溶解 胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799) 0.25g EDTA 0.02g
0234091班 81人灾害毒理学实验 实验一小鼠胚胎成纤维细胞培养实验 一．实验目的 明确细胞培养室的建设与日常管理规定，了解细胞培养实验中常用的仪器设备的使用方法、注意事项和保养方法。 二．实验器材与试剂 1. 主要仪器 高压蒸汽灭菌器；超净台；电热干燥箱；自动双重纯水蒸馏器；CO2培养箱；电热恒温培养箱；液氮罐；低温冰箱；超低温冰箱；倒置显微镜（Olympus，Japan）； 100ml的玻璃培养瓶；6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm）；Eppendroff管；1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；5ml冻存管；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿；解剖器械；离心机；漏斗和量筒；培养皿；酒精灯等。 2.主要试剂及配制 ⑴ MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液 ①低糖DMEM母液 用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水； 将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。 每升培养基中添加3.7gNaHCO3。 搅拌直至完全溶解。 用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。 立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。 ②MEF培养液 取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。PBS缓冲溶液 ⑵ PPS------含0.05%吐温－20的pH7.4的磷酸盐缓冲液的配置 在500ml超纯水中依次溶入 NaCl 4.0g KCl 0.1g Na2HPO4.12HO2 1.445g KH2PO4 0.1g 于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。 ⑶ 0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液的配置 在100ml超纯水中分别溶解 胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799) 0.25g EDTA 0.02g NaCl 0.7g Na 2HPO 4 .12H 2 O 0.024g