生物化学实验
―教案―
侯沁文
目录
实验一糖得颜色反应 (1)
实验二糖得还原作用 ................................................................................... 错误!未定义书签。实验三多糖得实验 ....................................................................................... 错误!未定义书签。实验四糖得旋光性与变旋现象 ................................................................... 错误!未定义书签。实验五血糖得定量测定(葡萄糖氧化酶法)................................................. 错误!未定义书签。实验六人血清中总胆固醇得测定 ............................................................... 错误!未定义书签。实验七牛奶中粗脂肪含量得测定 . (7)
实验八牛奶中酪蛋白得提取 ....................................................................... 错误!未定义书签。实验九牛奶中酪蛋白含量得测定 ............................................................... 错误!未定义书签。实验十氨基酸得纸层析 ............................................................................... 错误!未定义书签。实验十一醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 ....................................... 错误!未定义书签。实验十二蛋白质得颜色反应 ....................................................................... 错误!未定义书签。实验十三蛋白质得沉淀反应 . (14)
实验十四SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量........... 错误!未定义书签。实验十五双缩脲法测定蛋白质浓度 ........................................................... 错误!未定义书签。
实验十六考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 ................................................... 错误!未定义书签。实验十七紫外光吸收法测定蛋白质浓度 .. (18)
实验十八血清谷丙转氨酶得测定 ............................................................... 错误!未定义书签。实验十九过氧化物酶得作用 ....................................................................... 错误!未定义书签。实验二十溶菌酶得提纯结晶 ....................................................................... 错误!未定义书签。实验二十一酵母RNA得提取..................................................................... 错误!未定义书签。实验二十二RNA得定量测定(苔黑酚法)................................................... 错误!未定义书签。实验二十三DNA得提取及含量测定.......................................................... 错误!未定义书签。实验二十四荞麦中总黄酮得定性定量研究 ............................................... 错误!未定义书签。
实验一糖得颜色反应
[实验目得及要求]
1、掌握莫式(Molisch)试验鉴定糖得原理与方法。
2、掌握塞式(Seliwanoff)试验鉴定酮糖得原理与方法。
3、掌握杜式(Tollen)试验鉴定酮糖得原理与方法。
[实验原理]
1.莫式试验:糖经无机酸(浓硫酸、浓盐酸)脱水产生糠醛或糠醛衍生物,后者在浓无机酸作用下,能与а-萘酚生成紫红色缩合物。
2.塞式试验:酮糖在浓酸得作用下,脱水生成5-羟甲基糠醛,后者与间苯二酚作用,呈红色反应;有时亦同时产生棕红色沉淀,此沉淀溶于乙醇,成鲜红色溶液。
3.杜式试验:戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛,后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质。
[实验仪器及用品]
仪器:水浴锅。
器皿:吸管、试管。
实验药品:蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、а-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。
[实验试剂]
莫式试剂:а-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至100ml。现用现配,并贮于棕色试剂瓶中。
塞式试剂:间苯二酚50mg,溶于100ml盐酸(V H2O:V HCl=2:1),现用现配。
杜式试剂:2%间苯三酚乙醇溶液(2g间苯三酚溶于100ml95%乙醇中)3ml,缓缓加入浓盐酸15ml 及蒸馏水9ml。临用时配制。
[实验内容及步骤]
一、莫式实验
于4支试管中,分别加入1 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液与少许纤维素(棉花或滤纸浸在1 ml水中),然后各加莫式试剂2滴,摇匀,将试管倾斜,沿管壁慢慢加入浓硫酸1、5 ml(切勿振摇！),硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层,观察液面交界处有无紫色环出现。
二、塞式试验
于4支试管中,分别加入0、5 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液,然后各加塞式试剂
2、5ml,摇匀,同时置沸水浴内,比较各管颜色及红色出现得先后顺序。
三、杜式试验
于3支试管中加入杜式试剂1ml,再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液与1%阿拉伯糖溶液,混匀。将试管同时放入沸水浴中,观察颜色得变化,并记录颜色变化得时间。
四、实验现象记录
仔细观察实验中得颜色变化,对于塞式试验与杜式试验还需记录下颜色变化得时间。
实验二糖得还原作用
[实验目得及要求]
掌握糖得还原反应来鉴定糖得原理与方法。
[实验原理]
费林(Fehling)试剂与本尼迪(Benedict)试剂均为含Cu2+得碱性溶液,能使具有自由醛基或酮基得糖氧化,其本身则被还原成红色或黄色得Cu2O,此法常用作还原糖得定性或定量测定。
[实验仪器及用品]
实验仪器:水浴锅
实验器皿:吸管、试管
实验试剂:硫酸酮、氢氧化钠、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、无水碳酸钠、淀粉、蔗糖、葡萄糖。[实验试剂]
1、费林试剂
试剂A:CuSO4·5H2O 34.5 g,溶于蒸馏水并稀释至500 ml。
试剂B:氢氧化钠125 g,酒石酸钾钠137 g,溶于蒸馏水并稀释至500 ml。
临用时将试剂A与试剂B等体积混合。
2、本尼迪试剂:柠檬酸钠(Na3C6H3O7·11H2O)及50 g无水碳酸钠,溶于400 ml蒸馏水中。另溶解8.5 g硫酸铜于50 ml热水中。将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中,边加边搅拌,如有沉淀可过滤。此混合液可长期使用。
[实验内容及步骤]
于3支试管中加入费林试剂A与B各1 ml,混匀,分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液与1%淀粉溶液1 ml,置沸水浴中加热数分钟,取出,冷却,观察各管得变化。
另取3支试管,分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液与1%淀粉溶液1 ml,然后每支试管加本尼迪试剂2 ml,置沸水浴中加热数分钟,取出,冷却,与上面结果比较。
实验三多糖得实验
[实验目得及要求]
1.熟悉淀粉多糖得碘试验反应原理与方法。
2.进一步了解淀粉得水解过程。
[实验原理]
淀粉广泛分布于植物界,谷、果实、种子、块茎中含量丰富,工业用得淀粉主要来源于玉米、山芋、马铃薯。本实验以马铃薯为原料,利用淀粉不溶或难溶于水得性质来制备淀粉。
淀粉遇碘呈蓝色,就是由于碘被吸附在淀粉上,形成复合物,此复合物不稳定,极易被醇、氢氧化钠与加热等使颜色褪去,其她多糖与碘呈特异得颜色,此类呈色物质极不稳定。
淀粉在酸催化下加热,逐步水解成分子较小得糖,最后水解成葡萄糖。
[实验仪器及用品]
器材:研钵、布氏漏斗、抽滤瓶、表面皿、白瓷板、胶头滴管、电炉、石棉网、纱布、试管、烧杯、吸管、量筒、试管夹。
试剂:碘化钾、碘、淀粉、氢氧化钠、本尼迪试剂,浓硫酸、碳酸钠。
[实验内容及步骤]
一、马铃薯淀粉得制备
将马铃薯去皮,在研钵中充分研碎,加水混合,用纱布过滤,除去粗颗粒,滤液中得淀粉很快沉到底部,多次用水洗淀粉,抽滤,滤饼放在表面皿上,在空气干燥中即得。
二、淀粉与碘得反应
1.置少量自制淀粉于白瓷板上,加1-3滴稀碘液(配制2%碘化钾溶液,加入适量碘,使溶液呈淡黄棕色即可),观察颜色变化。
2.取试管1支,加0、1%淀粉5 ml,再加2滴稀碘液,摇匀后,观察其颜色变化。将管内液体分成3份,其中1份加热,观察颜色就是否褪去。冷却后,颜色就是否全部恢复。另2份加入乙醇或10%NaOH 溶液,观察颜色变化并解释之。
三、淀粉得水解反应
在一小烧杯中加入1%淀粉溶液25 ml及20%硫酸1 ml,放在石棉网上小火加热,微沸后每隔两分钟取出反应液2滴置于白瓷板上做碘试验。与此同时另取反应液三滴,用10%碳酸钠中与后,做本尼迪试验,记录试验结果并解释之。
实验四糖得旋光性与变旋现象
[实验目得及要求]
1.了解糖得变旋现象,掌握用糖得旋光性测定糖浓度得方法。
2.学会使用旋光仪。
[实验原理]
光就是一种电磁波,光波振动得方向与光得前进方向垂直。普通光得光波在各个不同得方向上振动。但如果让它通过一个尼科尔(Nicol)棱镜(用冰洲石制成得棱镜),则透过棱镜得光就只在一个方向
(偏振面)上振动,这种光就叫做平面偏振光。偏振光能完全通过晶轴与其偏振面平行得尼科尔棱镜,而不能通过晶轴与其偏振面垂直得尼科尔棱镜。
当平面偏振光通过某种介质时,有得介质对偏振光没有作用,即透过介质得偏振光得偏振面保持
不变。而有得介质却能使偏振光得偏振面发生旋转。这种能旋转偏振光得偏振面得性质叫做旋光性。具有旋光性得物质叫做旋光性物质或光活性物质。具有不对称结构得手性化合物都有旋光性。
能使偏振光得偏振面向右旋得物质,叫做右旋物质;反之,叫做左旋物质。通常用"d"(拉丁文dextro 得缩写,"右"得意思)或"+"表示右旋;用"l"(拉丁文laevo得缩写,"左"得意思)或"-"表示左旋。偏振光得偏振面被旋光物质所旋转得角度,叫做旋光度,用"α"表示。
旋光度得大小不仅取决于物质得本性,还与溶液得浓度、液层得厚度、光得波长、测定温度以及溶剂得性质等等有关。
偏振光通过厚度为1dm,浓度含有1g/ml得待测物质得溶液所测得得旋光度称为比旋光度[α],它就是物质得一个特性常数,如下式所示:
[α]λt=α/cl
式中t:测定时得温度;
λ:测定时所用光源得波长;
α:实测得旋光度; c:溶液得浓度(g/ml); l:玻管得长度(dm)。
一个有旋光性得溶液放置后其比旋光度改变得现象称为变旋。变旋得原因就是糖从α-型变为β-型或由β-型变为α-型。一切单糖都有变旋现象。无α-,β-型得糖类即无变旋性。 [实验仪器及用品]
仪器:旋光仪、电子天平。 器皿:容量瓶、烧杯、玻棒。
试剂:未知浓度得蔗糖溶液、10%葡萄糖溶液。 [实验内容及步骤]
一、利用糖得旋光性测定糖得浓度
1.转开样品管螺母,洗净玻管,然后向管中注满蒸馏水,盖上玻片,注意管中不能有气泡,玻片上得水渍必须擦干。
2.把样品放入旋光仪内,打开电源,待钠光源稳定1-2min 后,转动刻度盘,使目镜中两半圆得亮度相等,记下刻度盘得读书,以此为零点。
3.用蔗糖代替蒸馏水测其旋光度,并按公式计算出蔗糖得浓度。 二、糖得变旋现象
用新配制得10%葡萄糖溶液按上法测其旋光度并计算比旋光度,以后每隔2h 测定其旋光度,计算比旋光度直至比旋光度不再改变,说明α-,β-型互变已达平衡。
实验五 血糖得定量测定(葡萄糖氧化酶法)
[实验目得及要求]
掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量得原理与方法。 [实验原理]
D-葡糖糖
D-葡萄糖酸+ H 2O 2 [实验仪器及试剂]
试管、移液管、UNICO-2000型分光光度计、恒温水浴锅。
酶试剂:葡萄糖氧化酶(GOD)、过氧化物酶(POD)、4-氨基安替吡啉(4-AAP)。 酚试剂:苯酚。
标准葡萄糖溶液:100 mg/dL (5、55 mmol/L)。 [实验步骤]
GOD POD H 2O 2+4-AAP+苯酚 红色醌化物+H 2O
按下表加入各反应物:
计算 血糖含量=A 样/A 标×标准溶液浓度 [实验注意事项]
1、 分离血清要求使用未溶血样品,否则测定结果偏大。
2、 要求在30 min 内分离血清,糖酵解在全血中以7%/h 进行。
3、 样本在4℃-8℃可稳定24h,样本放置时间过长会使结果偏低。
实验六 人血清中总胆固醇得测定
[实验目得及要求]
学会利用氧化酶法测定血清中总胆固醇含量得原理与方法。 [实验原理]
胆固醇脂+H 2O 胆固醇+游离脂肪酸
胆固醇+O 2 ⊿4
-胆甾烯酮+H 2O 2 2H 2O 2+4-AA+4-氯仿 醌亚胺(红色)+4H 2O CEH:胆固醇脂酶 POD:过氧化物酶 CHOD:胆固醇氧化酶 4-AA:4-氨基安替吡啉
醌亚胺在500nm 有特征吸收,且生成量与样本中得胆固醇含量成正比,可通过测定标准品反应生成得醌亚胺得吸光度值,计算出样本中胆固醇得浓度。 [实验仪器及试剂]
试管、移液管、UNICO-2000型分光光度计、恒温水浴锅。 标准血清、样本血清、蒸馏水、酶试剂盒。 [实验步骤]
按下表加入各反应物:
l CEH
CHOD POD
标准血清 _____ 20 _____ 样本血清 _____ _____ 20 A 500nm
各管混匀,37℃反应实验七 牛奶中粗脂肪含量得测定
[实验目得及要求] 学习与掌握粗脂肪得定量测定法─索氏提取法。
[实验原理]
本实验用重量法,利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性,用脂溶性溶剂将脂肪提取出来,借蒸发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通常使用得脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30oC -60 oC 得石油醚。用此法提取得脂溶性物质除脂肪外,还含有游离脂肪酸、磷脂、固醇、芳香油及某些色素等,故称为“粗脂肪”。
索氏提取器 (如图所示)利用溶剂回流及虹吸原理,使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取,既节约溶利萃取效率又高。萃取前先将固体物质研碎,以增加固液接触得面积。然后将固体物质放
在滤纸套内,置于提取器中,提取器得下端与盛有溶剂得圆底烧瓶相连,上面接回流冷凝管。加热圆底烧瓶,使溶剂沸腾,蒸气通过提取器得支管上升,被冷凝后滴入提取器中,溶剂与固体接触进行萃取,当溶剂面超过虹吸管得最高处时,含有萃取物得溶剂虹吸回烧瓶,因而萃取出一部分物质,如此重复,使固体物质不断为纯得溶剂所萃取,将萃取出得物质富集在烧瓶中。 [实验仪器及试剂]
索氏提取器、干燥箱、电子分析天平、滤纸、棉线、干燥器、烘箱。 全脂牛奶、无水乙醚或石油醚。 [实验内容及步骤]
1、牛奶中水分含量得测定
准确称取一定量牛奶,吸附于70℃过夜烘干得层析滤纸上,70℃烘干后(约20分钟)称量,计算水分含量。
水分含量%=(M 牛奶-M 干物质)/M 牛奶×100% M 干物质=M 带有干物质得层析滤纸-M 层析滤纸 2、牛奶中粗脂肪含量得测定
A 样本
A 标准
×标准血清浓度
胆固醇含量=
将洗净得索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号,103-105℃烘干2小时,取出,置于干燥器中冷却,然后用电子分析天平称重,并记录。将测完水分含量带有干物质得层析滤纸用定性滤纸包裹,称量后置索氏抽提瓶,连接已干燥至恒重得脂肪接受瓶,由冷凝管上端加入无水乙醚,加量为接受瓶得2／3体积,恒温水浴加热,控制水温,以每小时回流3-5次为宜至抽提完全为止(用滤纸试)。取下接受瓶,在水浴上蒸干乙醚,再于100℃～105℃干燥2小时,取出放干燥器内冷却30分钟,称重,重复操作至恒重。取出滤纸包,于户外晾至无乙醚味,置入恒温箱内,烘干,然后移入干燥缸内冷却后称重,重复操作至恒重。
计算:(1)粗脂肪含量%=(M提取前纸包-M提取后纸包)/M干物质×100%
(2)粗脂肪含量%=(M接受瓶+粗脂肪-M接受瓶)/M干物质×100%
[注意事项]
1、乙醚为易燃有机溶剂,实验室应保持通风并禁止任何明火。
2、抽提用得乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物,挥发残渣含量低。因水与醇可导致水溶性物质溶解,如水溶性盐类、糖类等,使得测定结果偏高,被测样品也要事先烘干。过氧化物会导致脂肪氧化,在烘干时也有引起爆炸得危险。
3、装样品得滤纸筒一定要严密,不能往外漏样品,但也不要包得太紧影响溶剂渗透。放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管,否则超过弯管得样品中得脂肪不能提尽,造成误差。
实验八牛奶中酪蛋白得提取
[实验目得及要求]
掌握一种提取酪蛋白及检测牛乳质量得方法。
[实验原理]
酪蛋白就是乳蛋白质中最丰富得一类蛋白质,占乳蛋白得80%-82%,酪蛋白不就是单一得蛋白质,就是一类含磷得复合蛋白质混合物,以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸得羟基相结合。它还含有胱氨酸与蛋氨酸这两种含硫氨基酸,但不含半胱氨酸。它在牛乳中得含量约为35g/L,比较稳定,利用这一性质可以检测牛乳中就是否掺假。
酪蛋白在其等电点(pH4、6)时由于静电荷为零,溶解度很低,利用这一性质,将牛乳调到pH4、6,酪蛋白就可从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇,这个性质被用来从酪蛋白粗制品中将脂类杂质除去。
[实验仪器及用品]
温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、水浴锅、烧杯、量筒、表面皿、天平、离心机。
市售全脂牛奶、无水乙醇、无水乙醚、pH4、7乙酸钠缓冲液0、2mol/L。
[实验内容及步骤]
1、酪蛋白等电点沉淀
将100mL牛乳放到500mL烧杯中,加热到40℃,加入到同样40℃得乙酸钠缓冲液中,调到pH4、7。此时有絮状得蛋白质沉淀析出。将悬浮液冷却至室温,放置分层,3000 r/min离心15 min,收集沉淀。
2、水洗
将pH4、7醋酸-醋酸钠缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍,洗涤粗制品三次,离心10分钟,得到沉淀蛋白。
3、去脂
向粗制品中加入10 ml无水乙醇,搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中,用乙醚-乙醇混合液洗涤沉淀两次,最后用乙醚洗沉淀2次,抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去,在表面皿上摊开除去乙醚,干燥后得到得就是酪蛋白纯品。准确称重后,计算出每100mL牛乳所制备出得酪蛋白质量(g/100 mL),并与理论产量(3.5g/100mL)相比较,求出实际获得百分率。
实验九牛奶中酪蛋白含量得测定
[实验目得及要求]
1、学会用紫外吸收光谱法测定核酸蛋白混合物中蛋白质含量得方法。
2、掌握A224、0nm-A23
3、3nm测定蛋白含量得原理与方法。
[实验原理]
蛋白质中含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸,在紫外光280nm波长处有最大吸收。核酸及其衍生物有吸收紫外线得性质,其最高吸收峰在260nm处。由于核酸在280nm处也有光吸收,因此当蛋白质与核酸共同存在时,测定其中任何一种物质均存在干扰。核酸在230nm波长附近吸收值极小,如果将核酸测定值以230nm为中心,两侧存在对称而又相等得等吸收点,224nm波长处得吸收值与233、3nm波长处得吸收值相等。蛋白质则不同,从240nm波长处向短波长处移动时,其吸收值对波长得减小吸收值呈线性增加。因此,在240nm以下短波长一侧得核酸等吸收点中,如果测定蛋白质与核酸混合光密度值,两点间得光密度之差与蛋白质成比例关系。该方法就是格罗夫斯等1968年建立起来得,能够对浓度为5-180微克/毫升得样品作微量测定。该方法有快速,灵敏,不破坏样品原有性质得优点,在测定完蛋白质含量后可用于其她分析。
[实验仪器及试剂]
试管、移液管、容量瓶、烧杯、玻璃棒、UNICO-2000型分光光度计。
pH7磷酸缓冲液。
[实验内容及步骤]
用pH7得磷酸缓冲液溶解上次实验制得得酪蛋白,配置成5-180g/ml得溶液,测定其在224 nm 波长处与233、3 nm波长处得光密度值。按公式C蛋白质(mg/ml)=(A224-A233、3)×210,计算浓度并反推回至每100 ml牛奶中得蛋白含量。
[注意事项]
1、在用紫外吸收光谱定量测定蛋白质时,280nm波长处蛋白质吸收光谱主要由色氨酸与酪氨酸引起,但在224-240nm波长处得紫外吸收谱不仅由这些氨基酸引起,与苯丙氨酸,组氨酸,蛋氨酸,胱氨酸及半胱氨酸也有关,因此与其她吸收紫外线得不纯物质共同存在时,就会受到显著影响,这一点也应引起注意。
2、pH值对核酸测定得等吸收点有影响。
实验十氨基酸得纸层析
[实验目得及要求]
了解并掌握氨基酸纸层析法得原理与方法。
[实验原理]
用滤纸为支持物进行层析得方法,称为纸层析法。纸层析所用得展层溶剂大多由水与有机溶剂组成,滤纸纤维与水得亲与力弱,因此在展层时,水就是固定相,有机溶剂就是流动相。溶剂由下向上移动得,称为上行法;由上向下得,称下行法。将样品点在滤纸上,进行展层,样品中得各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们得分配系数不同,不同氨基酸随流动相移动得速率就不同,形成距原点距离不等得层析点,于就是便将这些氨基酸分离开来。
溶质在滤纸上得移动速率用R f表示:
R f=原点到层析点中心得距离/原点到溶剂前沿得距离
只要条件不变,R f就是常数,故可根据R f值作定性依据。
[实验仪器及用品]
实验器材:滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、微量注射器(10l)、电吹风、722型分光光度计。
实验试剂:
氨基酸混合液
碱相熔剂: V正丁醇:V12%氨水:V95%乙醇=13:3:3
酸相溶剂: V正丁醇:V80%甲酸:V水=15:3:2
显色贮备液:V0、4mol/L茚三酮-异戊醇:V甲酸:V水=20:1:5
[实验内容及步骤]
一、标准氨基酸单向上行层析法
1.滤纸准备;
2.点样;
3.展层与显色。
二、混合氨基酸双向上行纸层析
1、准备
2.点样;
3.展层与显色;
4.定性鉴定与定量测量。
三、数据记录与处理
1.计算出每种标准氨基酸得R f值;
2.混合氨基酸得R f值;
3.对照标准氨基酸得R f值,指出氨基酸得名称。
[实验注意事项]
１、必须选用新华1号滤纸。
２、点样时,样点得直径不能超出0.5mm。
实验十一醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质
[实验目得]
学习醋酸纤维薄膜电泳得操作,了解电泳技术得一般原理。
[实验原理]
醋酸纤维薄膜电泳就是用醋酸纤维素薄膜作为支持物得电泳方法。带电物质在电场力作用下,向着与其电性相反得电极移动得现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定得等电点,如将蛋白质置于pH 值低于其等电点得溶液中,则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之,则向正极移动。因为蛋白质分子在电场中移动得速度与其带电量、分子得形状及大小有关,所以,可用电泳法将不同得蛋白质分离开来。血清中含有多种蛋白质,它们得等电点都在pH 7、5以下。将血清置于pH 8、6得缓冲液电泳时,所有得血清蛋白都带有负电荷,在电场中将向正极移动。由于各种血清蛋白在相同pH时所带电荷数量不等,分子颗粒大小不一,因而泳动速度不同,经电泳被分离开来。血清蛋白质得等电点与分子量见下表。
均一泡沫状疏松薄膜,厚约120μm,具有一定得吸水性。
[实验材料、仪器及试剂]
1.材料:健康人血清或鸡血清。
2.仪器:电泳仪、电泳槽。
3.试剂:
(1)醋酸纤维素薄膜;
(2)pH8、6巴比妥缓冲液(离子强度0、06～0、07):取巴比妥0.83克,巴比妥钠6.38克,加蒸馏水加热溶解后,定容至500ml。
(3)染色液:取氨基黑10 B 0.5克,溶于50ml甲醇中,再加冰醋酸10ml,蒸馏水40ml混匀。
(4)漂洗液:95%乙醇4、5ml,冰醋酸5ml,蒸馏水50ml混合。
(5)透明液:95%乙醇80ml,冰醋酸20ml混合。
[实验方法]
1.准备薄膜:将切割整齐得2、5×6cm得薄膜条,浸入巴比妥缓冲液中浸透后,取出,用吸水纸吸去多余缓冲液。
2.点样:仔细辩认薄膜得粗糙面与光滑面,在粗糙面距离薄膜一端1.5cm处,用铅笔轻轻划一条直线。用玻棒蘸上血清样品,涂于盖玻片边缘处(边缘长度应比膜条宽度窄),将此边缘按压在直线上。注意:样品应点在薄膜得粗糙面一侧。待血清完全渗入薄膜后,将膜面翻转,点样面(粗糙面)朝下,置电泳槽中,薄膜点样端放于负极一侧。
3.电泳:打开电源,调节电压110～130V,电流0、4～0.6m A/cm宽,电泳时间45～60分钟,电泳完毕后,关闭电源。
4.染色漂洗:将薄膜从电泳槽中取出,直接浸入染色液中约5分钟,再转入漂洗液中反复浸洗3～4次,直至背景颜色脱净为止。此时,正常血清蛋白在薄膜上显示出五条区带。从前端至点样处得方向分别为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白及γ-球蛋白。
5.定量测定:将膜条用滤纸压平吸干,按区带分段剪开,分别浸在体积0、4mol/L氢氧化钠溶液中,并剪取相同大小得无色带膜条作空白对照,进行比色。或者将干燥得电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3分钟后,取出贴于洁净玻璃板上,干燥后,即为透明薄膜图谱,可用光密度计直接测定。
[注意事项]
1.点样好坏就是电泳图谱就是否清晰得关键,点样量要适当。
2.漂洗时应多漂洗几次,直至无蛋白区底色脱净为止。
实验十二蛋白质得颜色反应
[实验目得及要求]
掌握鉴定蛋白质得原理与方法。
[实验原理]
蛋白质分子中得某种或某些基团与显色剂作用,可产生特定得颜色反应,不同蛋白质所含氨基酸不完全相同,颜色反应亦不同。颜色反应不就是蛋白质得专一反应,一些非蛋白质物质亦可产生相同颜色反应,因此不能仅根据颜色反应得结果来决定被测物就是否就是蛋白质。颜色反应就是一些常用蛋白质定量测定得依据。
双缩脲反应:将尿素加热,两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中,能与硫酸铜结合成红紫色得络合物,此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似,故能呈此反应。
黄色反应:蛋白质分子中含有苯环结构得氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)。遇硝酸可硝化成黄色物质,此物质在碱性环境中变为黄色得硝苯衍生物。
茚三酮反应:蛋白质与茚三酮共热,则产生蓝紫色得还原茚三酮、茚三酮与氨得缩合物。此反应为一切蛋白质及α-氨基酸所共有。含氨基酸得其她物质亦呈此反应。
[实验仪器及用品]
实验器材:鸡蛋白、吸管、滴管、试管、水浴锅、电炉。
实验试剂:卵清蛋白、0、1%茚三酮、尿素、10%NaOH、浓硝酸、1%硫酸铜溶液。
[实验内容及步骤]
1、双缩脲反应
(1)取少许结晶尿素放在干燥试管中,微火加热,尿素熔化并形成双缩脲,释出得氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现,停止加热,冷却。然后加10%NaOH溶液1ml摇匀,再加2滴
1%CuSO4溶液,混匀,观察有无紫色出现。
(2)另取一支试管,加蛋白质溶液10滴,再加10%NaOH溶液10滴及1% CuSO4溶液2滴,混匀,观察就是否出现紫玫瑰色。
2、黄色反应
于一试管内,加入蛋白质溶液10滴及浓硝酸3-4滴,加热,冷却后再加10%NaOH溶液5滴,观察颜色变化。
3、茚三酮反应
取1ml蛋白质溶液置于烧杯中,加2滴茚三酮试剂,加热至沸,即有蓝紫色出现。
[实验注意事项]
1.在双缩脲反应中,硫酸铜不能多加。
2.茚三酮反应需在pH5-7下进行。
实验十三蛋白质得沉淀反应
[实验目得及要求]
1、熟悉蛋白质得沉淀反应。
2、进一步掌握蛋白质得相关性质。
[实验原理]
多数蛋白质就是亲水胶体,当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解得盐后,即产生沉淀。
蛋白质盐析作用:向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度,蛋白质即沉淀析出,这种作用称为盐析。
乙醇沉淀蛋白质:乙醇为脱水剂,能破坏蛋白质质点得水化层使其沉淀出来。
重金属盐沉淀蛋白质:蛋白质与重金属离子结合成不溶性盐类而沉淀。
[实验仪器及用品]
实验器材:试管、吸管、吸滤瓶、布式漏斗。
实验试剂:蛋白质试液、硫酸铵结晶体、饱与硫酸铵溶液、95%乙醇、结晶氯化钠、1%醋酸铅、5%鞣酸溶液、1%硫酸铜溶液、饱与苦味酸溶液、1%醋酸溶液。
[实验内容及步骤]
一、蛋白质盐析作用
1、取蛋白质溶液5ml,加入等量饱与硫酸铵溶液,微微摇动试管,使溶液混合静置几分钟,球蛋白即析出。
2、将上述混合液过滤,滤液中加硫酸铵粉末,至不再溶解,析出得即为清蛋白。再加水稀释,观察就是否溶解。
二、乙醇沉淀蛋白质
取蛋白质溶液1ml,加晶体NaCl少许,待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀。观察有无沉淀析出。
三、重金属盐沉淀蛋白质
取试管2支,各加蛋白质2ml,一管内滴加1%醋酸铅溶液,另一管内滴加1%CuSO4溶液,至有沉淀生成。
四、生物碱试剂沉淀蛋白质
取2支试管各加2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液4-5滴,向一管中加5%鞣酸溶液数滴,另一管内加饱与苦味酸溶液数滴,观察结果。
实验十四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定
蛋白质相对分子质量
[实验目得及要求]
了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法得原理,并学会用这种方法测定蛋白质得相对分子质量。
[实验原理]
聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同得大分子化合物分开,就是由于这些大分子化合物所带电
荷得差异与分子大小不同之故,如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计得程度,这些化
合物在凝胶上得迁移率则完全取决于相对分子质量。
SDS就是一种阴离子去污剂,它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷得复合物,其负电荷远远超过了蛋白质分子原有得电荷,也就消除或降低了不同蛋白质之间原有得电荷差别,这样就使电
泳迁移率只取决于分子大小这一因素,就可根据标准蛋白质得相对分子质量得对数对迁移率所作得
标准曲线来求得未知蛋白质得相对分子质量。
[实验仪器及用品]
实验器材:直流稳压电泳仪、垂直平板电泳槽、移液器、微量注射器、烧杯、试管、滴管、直尺。
实验试剂:凝胶贮备液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%SDS、样品缓冲液、电极缓冲液、10%过硫酸铵、1、5%琼脂、染色液、脱色液、待测分子质量得样品。
[实验内容及步骤]
1.装配电泳槽。
2.分离胶得选择与配制。
3.分离胶得灌制。
4.浓缩胶得配制与灌注。
5.样品得制备:
(1)标准蛋白质样品得制备。
(2)待测蛋白质样品得制备。
6.电泳。
7.染色与脱色。
8.相对分子质量得计算。
9.数据记录与处理:以标准蛋白质相对分子量得对数对相对迁移率作图,得到标准曲线。根据待测蛋白质样品得相对迁移率,从标准曲线上查出其相对分子质量。
实验十五双缩脲法测定蛋白质浓度
[实验目得及要求]
了解并掌握双缩脲法测定蛋白质浓度得原理与方法。
[实验原理]
具有两个或两个以上肽键得化合物皆有双缩脲反应,在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫色配合物,在540nm处有最大吸收。在一定浓度得范围内,蛋白质与浓度与双缩脲反应所呈得颜色深浅成正比,可用比色法定量测定。
[实验仪器及用品]
实验器材:容量瓶、试管、吸管、722型(或7220型)分光光度计。
实验试剂:
1、双缩脲试剂:0.175g CuSO4·5H2O溶于约15 ml蒸馏水,置于100 ml容量瓶中,加入30 ml浓氨水,30 ml冰冷得蒸馏水与20 ml饱与NaOH溶液,摇匀,室温放置2h,再加蒸馏水至刻度,摇匀备用。
2、牛血清白蛋白(2 mg/ml)溶液
3、未知浓度蛋白样品
[实验内容及步骤]
一、标准曲线得绘制
将6只10 ml容量瓶编号,按下表加入试剂,即得6种不同浓度得蛋白质溶液。
3、0ml。0号为对照管,加入3、0ml蒸馏水。各管加入双缩脲试剂2、0ml,充分混匀,即有紫色出现,用540nm 光测定各管吸光度,绘制浓度-吸光度曲线。
二、样液得测定
取未知浓度得蛋白质溶液3、0ml置试管内,加入双缩脲试剂2、0ml,混匀,测其540nm吸光度。
三、数据记录与处理
根据标准溶液得吸光度,在坐标纸上绘制出浓度-吸光度曲线,测出未知液得吸光度后,在标准曲线上查出未知液得浓度。
实验十六考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
[实验目得及要求]
学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。
[实验原理]
考马斯亮蓝能与蛋白质得疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250得磷酸溶液呈棕红色,最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色,其最大吸收峰改变为
595nm,考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物得高消光效应导致了蛋白质定量测定得高敏感度。
在一定范围内,考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后,在595nm下,吸光度与蛋白质含量呈线性关系,故可用于蛋白质浓度得测定。
[实验仪器及用品]
实验器材:旋涡混合器、试管、吸管、722型分光光度计、容量瓶、量筒、电子分析天平。
实验试剂:(1)0、9%NaCl;(2)标准蛋白液:牛血清白蛋白(0、1 mg/ml);(3)染液:考马斯亮蓝G250(0、01%),称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中,再加入100 ml浓磷酸,加蒸馏水定容到1000 ml;(4)样品液:取牛血清白蛋白(0、1 mg/ml)溶液,用0、9%NaCl稀释至一定浓度。
[实验内容及步骤]
一、标准曲线得绘制
取7支干净试管,按下表进行编号并加入试剂。
二、样液得测定
另取一干净试管,加入样品1、0 ml及考马斯亮蓝染液4、0 ml,混匀,室温静置3min,于波长595nm 处比色,读取吸光度。
三、数据记录与处理
根据标准溶液得吸光度,在坐标纸上绘制出浓度-吸光度曲线,测出未知液得吸光度后,在标准曲线上查出未知液得浓度。
实验十七紫外光吸收法测定蛋白质浓度
[实验目得及要求]
1、了解紫外光吸收法测定蛋白质浓度得原理。
2、熟悉紫外分光光度计得使用。
[实验原理]
蛋白质组成中含有酪氨酸与色氨酸等芳香族氨基酸,在紫外光280nm波长处有最大吸收峰,一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比,故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质浓度。
由于核酸在280nm波长处也有光吸收,对蛋白质测定有一定得干扰作用,但核酸得最大吸收峰在260nm处,如同时测定260nm得光吸收,通过计算可以消除其对蛋白质测定得影响。因此如溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm得吸光度,方可计算测得溶液中得蛋白质浓度。
[实验仪器及用品]
实验器材:UV-9100型分光光度计、容量瓶、试管、吸管。
实验试剂:卵清蛋白液、未知浓度蛋白质溶液、0、9%氯化钠。
[实验内容及步骤]
一、直接测定法
在紫外分光光度计上,将未知得蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中,以生理盐水做对照,测得
280nm与260nm两种波长得吸光度,代入下式计算蛋白质浓度:
C=1.45A280nm-0.74A260nm
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
《动物生物化学实验》复习题 一.填空题 1、生物化学实验的常用技术包括、、等。 2、牛奶中的主要蛋白质是，其占牛奶蛋白质总量的，其在pH值为的缓冲液中容易沉淀。 3、将制备酪蛋白时所得乳清，徐徐加热。即出现沉淀。此为乳清中的 和。 4、Folin-酚试剂由和组成。 5、福林酚法测定蛋白质含量时，样品蛋白质含量的适宜范围为ug/mL。 6、酶促反应速度最大时的环境温度称为，能使酶活性降低或丧失的物质称为，而对淀粉酶起此作用的物质是。 7、酶促反应速度最大时的pH称为，能使酶活性从无到有或使酶活性增加的物质称为，而对淀粉酶起此作用的物质是。 8、淀粉酶具有高度的性，催化蔗糖水解。 9、。DNA主要存在于，在细胞中，它与结合形成。 10、脱氧核糖核蛋白体在mol/L的NaLl溶液中溶解度小，在mol/L的NaLl溶液中溶解度大。 11、SDS-PAGE根据凝胶的形状特点包括和两种体系。 12、不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的分辨率，是因为电泳时会产生三大效应，即，和电荷效应。 13、层析系统由互不相溶的两相：和组成。二．是非题 （）1、酪蛋白在稀碱溶液中易溶解。 （）2、酪蛋白是一种不含硫的蛋白质。 （）3、Folin-酚法是一种光谱技术，主要仪器是可见光分光光度计。 （）4、Folin-酚法测定蛋白质含量时，样品应进行适当稀释。 （）5、Folin-酚法是测定蛋白质含量的常用方法。 （）6、Folin-酚法应该用同种蛋白质做对照。 （）7、做温度对淀粉酶活性影响时，沸水浴中试管取出后即可直接加入碘液观察结果。（）8、NaCl中Na+1是唾液淀粉酶的激活剂。 （）9、CuSO4中Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂剂。
生物化学实验的答案 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】
生物化学实验的答案 一、理论考试部分 1.醋酸纤维薄膜电泳时，点样的一端应靠近电极的哪一端为什么 2. 答：负极。因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 3.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的意义是什么？ 答：空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 4.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳的原理？ 答：血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为8.6时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 5.何谓R f值？影响R f值的主要因素是什么？ 答：Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关， 6.什么是盐析盐析会引起蛋白质变性吗一般我们用什么试剂做盐析的实验 答：盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性。一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析。 7.简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答：还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 8.依据我们所做的实验，说明影响蛋白质沉淀的因素是什么影响蛋白质变性的因素是什 么沉淀和变性有何联系 答：水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下蛋白质颗粒因失去电荷和脱水而沉淀。这些因素包括溶液的酸碱度、盐溶液的浓度、温度、重金属离子以及有机溶剂等。变性蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性。 8. 什么是碘值脂肪的不饱和程度越大，碘值越大吗在测定碘值的实验中，氯仿的作用是什么 答：每100g脂肪所吸收的碘的克数，即脂肪的碘值。脂肪的不饱和度越大，碘值就越大。氯仿作为溶剂，去溶解脂肪。
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
生物化学实验 （二）
绪论 ?随着生物化学的发展和生物化学教学内容的不断丰富，生物化学实验也在不断更新和提高。 ?本门课程在以往教学工作的基础上，结合生物化学实验教学，力求使学生能够更加深刻地学习生物化学课程。 本实验课实验项目覆盖了当今生物化学研究中常用的技术和方法。
绪论 一、实验目的 ?掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法； ?掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能； ?培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。
?二、通过生物化学实验应该做到 ?学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 ?训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。 ?学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。 ?掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。
?三、实验室规则 ?１、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静，不得喧哗吵闹、迟到早退。 ?２、爱护仪器，厉行节约。试剂、药品、蒸馏水等应节约使用，不得浪费。如不慎损坏仪器，应及时报告老师，说明原因；贵重、精密仪器，应先熟悉使用方法，在老师的指导下，严格按操作规程操作；发现故障，应立即报告老师，不得擅自处理。仪器使用完毕后，一定要填写使用记录。
绪论 ?３、取用试剂时，应仔细辨明标签，以免取错。取完试剂后，应及时将瓶盖盖好，放回原处，切忌乱拿乱放。 ?４、注意安全。对于有毒、腐蚀的试剂应避免其直接接触人体及衣物；乙醚、丙酮等易燃试剂应远离火源，以免发生意外。 ?５、注意实验室卫生、整洁。废弃液体应倒入水槽，实验用过的和棉花、废纸、沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器，不得随意乱扔。实验结束后应将实验台整理好，并清扫、整理实验室。关好水、电、门、窗，方可离开实验室。
食品生物化学实验要求 1.学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不 许进入实验室。每大组实验人数28人，4人一小组。 2.实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。学生在试剂配制过程中， 掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。 3.实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作， 如有损坏，照价赔偿。 4.卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆 放整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。 一、10食品科学食品生物化学实验项目表 1. 淀粉的显色、水解和老化（4学时） 2. 蛋白质的功能性质（4学时） 3. 牛奶中酪蛋白等电点测定和氨基酸的分离鉴定（4学时） 4. 或果胶的提取（4学时） 5. 酶的性质实验（4学时） 实验总课时：16学时
二、食品生物化学实验指导书 实验一淀粉的显色、水解和老化 一、实验目的和要求 1、了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2、掌握淀粉水解的条件和产物的实验方法。 3、淀粉的老化原理和方法 二、实验原理 1、淀粉与碘的反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。 近年来用先进的分析技术（如X射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。 在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。 淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。 表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色 淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。 2、淀粉的水解淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C6H12O5）m→(C6H10O5)n→C12H22O11→C6H12O6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
生物化学实验 一、名词解释： 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题： 1. 测定蛋白质含量的方法有，，和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2，其活性大小以来表示，当CAT与H2O2反应结束，再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳，这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶，其自由基的引发剂是，催化剂是______________；光聚合法适于制备大孔径的_________________胶，催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________，_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前，必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，表示E对S的亲合力愈，Km愈大，表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热，注意预热及样品槽空时必须_________（打开、合上）样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中，____________形成固定相，____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的，在具有自由基团体系时，两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种：和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________和________________。 三、问答题： 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些？ 参考答案： 生物化学实验 一、名词解释： 1、电泳：指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法：用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生化复习资料 考试： 名：10个（三、四） 选：10个（不含1、6、11、12） 3章重点维生素的载体、作用，嘌呤、嘧啶合成区别，核糖作用，一碳基团载体，ACP，载体蛋白，乙酰辅酶A缩化酶，生物素 填：20空（1、2、8） 简答：3个（1、6、7、8） 简述：3个（9、10、11、12） 血糖来源和去路，葡萄糖6-磷酸的交叉途径 实验与计算：（1、7） 一、名词解释 1、肽键：是一分子氨基酸的羧基与另一分子氨基酸的氨基脱水缩合而成的酰胺键（-CO-NH-），称为肽键。是蛋白质结构中的主要化学键（主键） 2、盐析： 3、酶的活性中心：在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同肽链上的基团，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近，形成的具有一定的构象，直接参与酶促反应的区域。又称酶活性部位 4、米氏常数：是反应最大速度一半时所对应的底物浓度,即当v = 1/2Vm时，Km = S 意义：Ｋm越大，说明E和S之间的亲和力越小，ES复合物越不稳定。米氏常数Km对于酶是特征性的。每一种酶对于它的一种底物只有一个米氏常数。 5、氧化磷酸化：是在电子传递过程中进行偶联磷酸化，又叫做电子传递水平的磷酸化。 6、底物水平磷酸化：是直接由底物分子中的高能键转变成A TP末端高能磷酸键叫做底物水平的磷酸化。 7、呼吸链：线粒体能将代谢物脱下的成对氢原子(2H)通过多种酶和辅酶的链锁反应体系逐步传递,最后与激活的氧结合为水,由于该过程利用氧气与细胞呼吸有关,所以将这一传递体系叫做呼吸链。 8、生物氧化：糖类、脂肪和蛋白质等有机化合物在生物体内经过一系列的氧化分解，生成CO2和水释放能量的总过程叫做生物氧化。 9、葡萄糖异生作用：由非糖前体物质合成葡萄糖的过程。 10、戊糖磷酸通路：指机体某些组织以6-磷酸葡萄糖为起始物在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸进而代谢生成磷酸戊糖为中间代谢物的过程。 11、激素敏感激酶： 12、酮体：脂肪酸在肝脏中氧化分解所生成的乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮三种中间代谢产物，统称为酮体。 13、饲料蛋白质的互补作用：把原来营养价值较低的不同的蛋白质饲料混合使用，可能提高其营养价值和利用率。 14、氮平衡：是反映动物摄入氮和排除氮之间的关系以衡量机体蛋白质代谢概况的指标。 15、从头合成途径：利用氨基酸等作为原料合成 16、补救合成途径：利用体内游离的碱基或核苷合成
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净； 3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果； 4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。
动物生物化学实验教学改革的研究 摘要：依据高校教育改革的深入和创新素质教育的全面推进，针对动物生物化学实验教学实际情况，进行了改革探索研究。主要通过大学生研究训练计划（SRP）项目和毕业论文于实验教学中的实施，使之互相影响并促进动物生物化学实验教学改革，其旨是发挥实验教学的作用，提高学生创新和实践能力，为国家培养合格人才。 关键词：动物生物化学实验教学 SRP 毕业论文改革 《动物生物化学》实验课程是动物医学和动物科学专业的重要基础课，既具有基础性，又具有前沿性，是研究生命活动变化规律的学科，对验证和巩固动物生物化学理论知识，掌握动物机体内发生的生物化学机制并且运用动物生物化学实验原理和方法来诊断、治疗和预防疾病等都有非常重要的作用，目前的动物生物化学实验教学模式只是注重理论课程内容的复证，同时也在响应国家要求培养适应创新型高水平创新人才的号召，进行动物生物化学实验的优化组合，更新替换陈旧实验内容，对本科生开放一些实验室，虽然起到了一定的作用，但还是不能满足于学生主动性和创造性的全面发挥。因此，本实验室针对动物生物化学实验课程进行
了更深层次的改革探索，首先将动物生物化学实验教学从以前的理论教学中分离出来成为一门独立的32学时的实验课程，对以前的实验项目进行大幅度删减，替换一些重复的和与学生创新性结合不紧密的实验项目，增加了适应学生创新和实践思维发展的综合设计性的大实验，同时把大学生训练计划（SRP）项目和学生毕业论文纳入到实验教学中，使两者相互促进提高并融为一体，影响且促进实验教学进行相应改革，一方面可以满足理论课程需求并且使之提高，另一方面也提高了低年级农科类本科学生的专业兴趣及创新和动手能力，对学生今后走向工作岗位，胜任相关工作与独立开展科学研究都具有非常重要的作用。基于此，本文就动物生物化学实验课程的教学改革实践进行了探索性的分析。 一、加强大学生训练计划（SRP）项目于实验课中实施，促进实验教学改革 为提高学生创新和实践的能力，使SRP项目融入实验教学课堂，首先使大学生实践训练计划（SRP）项目的内容与实验课进行有机结合，通过SRP项目的实施推动动物生物化学实验课程教学发生相应调整改革，大学生训练计划（SRP）项目的启动实施要求动物生物化学实验课程进行相应的改革从以下几方面陈述。 首先，改变以前课前教师为主体，准备好实验所需的试剂、器材和实验所需要的设备，然后在学生动手做实验前，
生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部
实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理． 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、．抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计． 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95％乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL
4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、．乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)， 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。 5、准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)
得率： 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球
《生物化学实验》容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事的科学态度。 二、实验容
包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据； （3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。 3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性
糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电加热板或电 炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻璃棒1根； 100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）；不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若干。每个洗 手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。 四、实验操作 取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎，加入5～10ml蒸馏水，在研钵中磨成均浆，转入锥形瓶中，用蒸馏水少量多次冲洗研钵，洗出液也转入锥形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中，同法残渣再提取2~3次，将提取液合并至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。贴好标签，保存至冰箱中，用于实验二。 五、实验结果与讨论 1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。 2、结合实验二结果计算含量 六、实验注意事项 （1）若有干扰，可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质，乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质，若色素较多可脱脂。 （2）加热时应小心，避免灼伤皮肤。 七、思考题 1、可溶性糖在植物物质代中的作用。
生物化学实验须知 一、实验目的 1．培养学生严谨的科学作风，独立工作能力及科学的思维方法。 2．学习基础的生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。 3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。 4．培养学生的书面及口头表达能力。 二、实验的总要求 1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。 2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。为达到此目的，实验者应注意：①一切步骤都按正规操作法进行；②样品与试剂勿过量取用；③宜粗者勿细（例如粗天平称量物品即足够准确时，不用分析天平，用量筒取液足够准确时，不用吸量管）；④试剂、仪器防止污染及破损，保持实验环境的整洁。⑤注意力集中，避免差错。 3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观，不得于实验后追记，应直接记在实验报告本中，而且无论实验成功与失败，都应记下。对于失败的实验，要分析其原因。 4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。对师长尊敬，对同学要团结友爱。实验后应清洗整理用过的仪器及清理自己的实验场所。 三、实验报告 实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。实验报告的内容包括下列各项：实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤、实验记录、计算（定量测定、解释）、讨论或小结。实验记录除应包括“实验总要求”的第3项要求外，还应包括原始记录。原始记录是随做随记的第一手记录，应由指导教师签字认可。书写实验报告要字迹工整，语句通顺。书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。 四、组织与分组 1．每一个班学习委员负责①实验报告的收集与分发；②安排清扫值日名单； ③反映同学学习情况及对教学工作的意见；④其它临时性的工作。 2．一般实验都为两个学生单独进行。有的实验要4人一组，由相邻两学生组成固定小组。小组的成员在指导教师的同意下，可作适当的调整。
《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时：实验学时：32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书： 1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010 参考资料： 1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011 五、实验项目数据表
2）要求：0：必修1选修 3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计 4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 （一）蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。