生物化学实验
一、糖的颜色反应及还原作用
实验一：糖的颜色反应
实验1.1莫氏实验
一、目的
掌握莫氏（molisch）实验鉴定糖的原理和方法。
二、原理
糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与α-萘酚生成紫红色缩合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称“紫环反应”，其反应如下图：
利用这一性质可以鉴定糖。
三、实验器材
1、棉花或滤纸。
2、吸管1.0ml(K4)、2.0ml(K1)。
3、试管1.5K15cm(K4)。
四、实验试剂
1、莫氏试剂：称取α-萘酚5g，溶于95%乙醇并稀释至100ml。此试剂需新鲜配置，并贮于棕色试剂瓶中。
2、1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml。
3、1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml.
4、1%淀粉溶液：讲1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混合溶液合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅。最后以沸蒸馏水稀释至100ml。
五、操作
于4支试管中，分别加入1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1ml水中）。然后各加莫氏试剂2滴1，摇匀，讲试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5ml(切勿振摇！)硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。
六、注意事项
1、试管中加入各种糖后，应做好标记，浓硫酸加入的方式应保持一致。
2、莫氏反应非常灵敏，所用的试剂应洗净，不可再样品中混入纸屑等杂物。
3、当糖浓度过高时，由于浓硫酸对他的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈现紫色，需稀释后再做。
思考题：
1、解释α-苯酚反应的原理。
2、用莫氏试验鉴定糖时需注意哪些？
试验1.2塞氏试验
一、目的
掌握塞氏（Seliwanoff）实验鉴定酮糖的原理和方法。
二、原理
酮糖在浓酸的作用下，脱水生产5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应，有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，呈鲜红色沉淀2，以果糖为例，其反应如下：
三、实验器材
1、吸管0.5ml(K3)、5.0ml(K1)。
2、试管1.5cmK15cm（K3）。
3、水浴锅。
四、实验试剂
O):V(HCl)=2:1],临用
1、塞氏试剂：溶50mg间苯二酚于100ml盐酸中[V(H
2
时配制。
2、1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml。
3、1%葡萄糖溶液：见实验1.1。
4、1%蔗糖溶液：见实验1.1。
五、操作
于3支试管中分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%果糖溶液各0.5ml。各加塞氏试剂2.5ml，摇匀。同时至沸水浴内。比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。
六、注意事项
1、试管中加入各种糖后，应做好标记，并按顺序置于沸水锅内。
2、实验过程中，要仔细观察溶液颜色的变化情况。
思考题
1、在塞氏实验中，反应产生的沉淀为何能够溶于乙醇溶液并产生鲜红色？
2、蔗糖为何有塞氏反应？
实验1.3杜氏实验
一、目的
掌握杜氏（Tollen）实验鉴定戊糖的原理和方法。
二、原理
戊糖在浓硫酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质：本实验虽常用以鉴定戊糖，但并非戊糖的特有反应。果糖、半乳糖和糠醛等都是呈阳性反应、戊糖反应最快，通常在45s内即产生樱桃红色沉淀。
三、实验器材
1、吸管1.0ml(K3)
2、试管1.5cmK15cm(K3)
3、水浴锅
四、实验试剂
1、杜氏试剂：2%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100ml95%乙醇中）3ml，缓缓加入浓盐酸15ml及蒸馏水9ml即得，临时用配制。
2、1%阿拉伯糖溶液：称取阿拉伯糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。
3、1%葡萄糖溶液，见实验1.1。
4、1%半乳糖溶液：称取半乳糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。
五、操作
于三支试管中加入杜氏试剂1ml，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，摇匀。将试管同时加入沸水浴中，观察颜色变化，并记录颜色变化的时间。
六．注意事项
1、试管中加入各种糖后，应做好标记，并按顺序置于沸水浴锅中。
2、实验过程中，要仔细观察溶液颜色的变化情况。
思考题
1、在Tollen反应分析位置样品时，应注意些什么问题？
2、列表总结和比较本实验三种颜色反应的原理及其应用。
二、多糖的性质
多糖的实验
一、目的
1、熟悉淀粉多糖的碘实验反应原理和方法。
2、进一步了解淀粉的水解过程。
二、原理
淀粉分布于植物界，谷、果实、种子、块茎中含量丰富，工业用的淀粉主要来源于玉米、山芋、马铃薯。本实验以马铃薯为原料，利用淀粉不溶于或难溶于水的的性质来制备淀粉。
淀粉遇碘呈蓝色1，是由于碘被吸附在淀粉上，形成一复合物，此复合物不稳定，极易被醇、氢氧化钠和加热等使颜色褪去，其他多糖大多数能与碘呈特异的颜色，此类呈颜色物质也不稳定。
淀粉在酸催化下加热，逐步水解成分子较小的糖、最后水解成葡萄糖，
（C
6H
10
O
5
）（C
4
H10O5）C
17
H
22
O
11
C
4
H
12
O
4
淀粉各种糊精麦芽糖葡萄糖
淀粉完全水解后，失去与碘的作用，同时出现单糖的还原性。
三、实验器材
1、马铃薯3、布氏漏斗（K1）、抽滤瓶500ml（K1）
2、纱布、研钵（K1）4、表面皿10cm（K1）、白瓷板、皮头滴管
5、试管1.5cmK15cm(K4)8、量筒25ml（K1）
6、电炉、石棉网9、吸管1.0ml(K1)
7、烧杯50ml（K1）10、木质试管
四、实验试剂
1、稀释液：配制2%碘化钾溶液，加入适量碘，使溶液呈淡棕黄色即可。
2、0.1%淀粉：称取淀粉1g，加少量水，调匀，倾入沸水，边加边搅，并以热水稀释至1000ml，可加数滴甲苯防腐。
3、10%NaOH溶液:称取NaOH10g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。
4、本尼迪特试剂：见实验2.
5、20%硫酸（V/V）：量取蒸馏水78ml置烧杯中，加入浓硫酸20ml（相对密度1.84）.摇匀，冷却后贮于试剂瓶中。
6、10%碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠10g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。
五、操作
1、马铃薯淀粉的制备
讲生马铃薯去皮，在研钵中充分研碎，加水混合，用纱布过滤，除去粗颗粒，滤液中的淀粉很快沉到底部，多次用水洗淀粉，抽滤，滤饼放在表面皿上，在空气中干燥即得。
2、淀粉与碘的反应
（1）置少量自制淀粉于白瓷板上，加1至3滴稀碘液，观察颜色变化。
（2）取试管1支，加0.1%淀粉液5ml，再加2滴稀碘液，摇匀后，观察其颜色变化。将管内液体分成3分，其中1分加热，观察颜色是否褪去。冷却后，颜色是否全部恢复。另2份分别加入乙醇或10%NaOH溶液，观察颜色变化并解释之。
3、淀粉的水解
在一小烧杯内加入1%淀粉溶液25ml及20%硫酸1ml，放在石棉网上小火加热，微沸后每隔2min取出反应2滴置于白瓷板上做碘试验。与此同时另取反应液3滴，用10%碳酸钠溶液中和后，做本尼迪特试验（参阅试验2），记录试验结果并解释之。
六、注意事项
1、淀粉提取时可适当加热以促进淀粉聚沉，但温度不能超过50℃，否则会因溶解度增大而减少产量。
2、用水洗涤淀粉时需待淀粉沉降完全后再小心倾出上清液，亦可直接用滴管吸去上清液。
思考题
淀粉有没有还原性？如何验证？
三、植物组织中可溶性总糖的测定
一、目的
掌握蒽酮比色法定糖的原理和方法。
二、原理
糖在浓硫酸作用下，脱水生成糠醛或羟基糠醛，糠醛或羟基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在60nm处有最大吸收。在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。
蒽酮法几乎可以测定所有的糖类物质，不但可以测定戊糖于己糖，而且可以测定寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素、糖原等（因为反应液中的浓硫酸可以将多糖水解成单糖而发成反应），所以用蒽酮法测出的糖含量，实际上是溶液中的总糖含量。
此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅。
三、实验器材
1、新鲜植物叶片5、水浴锅、电炉
2、吸管1.0ml（K2）、5ml（K1）、0.1ml6、电子分析天平
（K1）、0.2ml(K1)、0.5ml(K3).7、容量瓶100ml（K1）、玻璃漏斗。
3、试管1.5cmK15cm(K7)8、量筒、研钵、三角烧杯
4、紫外可见分光光度计。
四、实验试剂
1、蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000ml80%（V/V）的硫酸中，当日配制使用。
2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100ml葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）
五、操作
1、制作标准曲线
取干净试管6支，按表6进行操作。
以吸光度为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标作为图得标准曲线。
取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎、加入3ml蒸馏水，在年播种磨成匀浆，转入锥形瓶，并用12ml蒸馏水冲洗研钵2至3次，洗出液也转入锥形瓶中。用塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，冷却后过滤并定容至100ml，此为待测液，吸取待测液0.5ml于试管中，加蒸馏水0.5ml，浸于冰水浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值有标准曲线查算出样品液的糖含量。
六、计算
（总糖）=[(CKV)/m]K100%
式中（总糖）：总糖的质量分数（%）；
C:从标准曲线上查出的糖含量（mg/ml）;
V:样品稀释后的体积（ml）
m:样品的质量（mg）
七、注意事项
1、若提取物中过多色素会干扰显色，须事先除去。
2、参见实验8注意事项。
思考题
1、本实验蒽酮法用于测定植物叶片的可溶性糖，非可溶性糖可用此方法除去
吗？
2、制作标准曲线时应注意哪些问题？
三、蒽酮-硫酸比色定糖法
一、目的
掌握蒽酮比色法定糖的原理和方法。
二、原理
蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以和游离得的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸起反应，反应溶液呈蓝绿色，在620nm出有最大吸收。
蒽酮可与其他一些糖类发生反应，单显现的颜色不同，当样品中存有含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈红色，对于以上特定的糖类，反应较稳定。本法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。
三、实验器材
1、无蛋白滤液或其他材料4、紫外可见光光度计
2、吸管1.0ml（K2）、5ml（K1）、0.1ml5、水浴锅
（K1）、0.2ml(K1)、0.5ml(K3).6、电炉
3、试管1.5cmK15cm(K7)7、电子分析天平。
四、实验试剂
1、蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000ml体积分数为80%(V/V)的硫酸中，当日配制使用。
2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml），100mg葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000ml （可滴加几滴甲苯作为防腐剂）。
3、标准唐宇溶液（0.1mg/ml）:100mg糖原溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作为防腐剂）。
五、操作
1、创作标准曲线
取干净试管6支，按表5进行操作。
3、样品含糖量测定
吸去1ml无蛋白糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出用哪个自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光光度值由标准曲线查算查出样品液的糖含量。
四、计算
=[CV/m]K100%
式中，糖的质量分数（%）
C:从标准曲线上查出的糖质量浓度（mg/ml）
V:样品稀释后的体积
m:样品的质量
五、注意事项
1、蒽酮试剂中硫酸的浓度为80%。因为蒽酮不能溶于低于80%的硫酸溶液中，测
定样品含水量不能多，试管应干燥污水，否则蒽酮会在测定液中析出而影响测定。
2、不同显色温度和时间对产物的吸光度影响较大，沸水浴时间过长，糠醛衍生
物遭破坏，颜色会消退。
3、试剂为浓硫酸，操作时要小心，注意安全。
思考题
1、蒽酮法中硫酸起什么作用？
2、有哪些糖可用蒽酮法测定？
六、脂肪酸价的测定
一、目的
了解脂肪酸价测定的原理和方法。
二、原理
天然优质长期暴露在空气中会发生臭味，这种现象称为酸败，酸败是由于油脂水解释放出的脂肪酸，在空气中被氧化成醛或酮，从而有一定的臭味，酸败的程度用酸价来表示，酸价是中和的1g油脂的游离脂肪酸所需KOH的毫克数。油脂中的游离脂肪酸与KOH发生中和反应，从KOH标准溶液消耗量可计算出游离脂肪酸的量。反应时如下：
O
RCOOH+KOHRCOOK+H
2
三、实验器材
1、油脂（猪油、豆油等均可）4、三角烧杯（锥形瓶）100ml（K3）
2、电子分析天平5、量筒50ml（K1）
3、碱式滴定管25ml（K1）6、水浴锅。
四、试剂
1、0.100mol/LKOH标准溶液。
2、1%酚酞指示剂：用70%至90%乙醇配制。
3、中性醇醚混合液：取95%乙醇（C.P.）和乙醚（C.P.）按1:1等体积混合；或苯醇混合液：取苯(C.P.)和95%乙醇（C.P.）等体积混合；上述混合液加入酚酞指示剂数滴，用0.100mol/L，KOH溶液中和至红色。
五、操作
准确称量油脂1至2.000g于100ml三角烧瓶中，加入醇醚混合液150ml，振荡溶解（固体脂肪需水浴溶化再加入混合溶液）或40℃水浴中溶化至透明，溶液由红色变为无色，继续用0.100mol/LKOH标准液滴定至淡红色，1min不褪色为终点，记录KOH的用量V(ml)。
六、计算
脂肪的酸价=[(cVK56.1)]/m
式中c：标准KOH物质的量浓度（mol/L）
V:样品消耗KOH的体积（ml）
56.1：每摩尔KOH的质量（g/mol）
m:样品质量（g）
七、注意事项
去油脂的量尽量根据样品大致酸价取样，或者先做预实验，在做正式试验。
思考题
1、实验中能否用相同浓度的NaOH替代KOH作为滴定用碱。
2、造成食品酸价升高的因素有哪些？有何办法可防止油脂的水解、氧化和酸
败？
六、卵磷脂的提取与鉴定
一、目的
了解用乙醇作为溶剂提取卵磷脂的原理和方法。
二、原理
软磷脂在脑、神经组织、肝、肾上腺和红细胞中含量较多，蛋黄中含量特别多。卵磷脂易溶于醇、乙醚等脂溶剂，可利用这些脂溶剂提取。
新提取得到的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后因所含不饱和脂酸被氧化而呈现黄褐色，卵磷脂中的胆碱基在碱性溶液中可分解成三甲胺，三甲胺有特异的鱼腥臭味，可鉴别。
三、实验器材
1、鸡蛋黄。5、试管1.5cm×18cm（×1）。
2、烧杯50ml（×1）。6、吸管2ml（×1）。
3、量筒50ml（×1）。7、电子天平。
4、蒸发皿（×1）。
四、实验器材
1、95%乙醇（C.P.）。
2、10%氢氧化钠溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml。
五、操作
1、提取
于小烧杯内置蛋黄约2g，加入热95%乙醇15ml，边加边搅，冷却，过滤，将滤液置于蒸发皿内，蒸汽浴上蒸干，残留物即为卵磷脂。
2、鉴定
取卵磷脂少许，置于试管内，加10%NaOH溶液约2ml，水浴加热，看是否
产生鱼腥味。
六、注意事项
卵磷脂粗品因被氧化或色素的存在而颜色较深，可用丙酮进一步提纯。
思考题
1、卵磷脂提取过程中，加入热95%的乙醇的作用是什么？
2、卵磷脂的生物学功能有哪些？
七、血清胆固醇的定量测定（硫酸铁法）
一、目的
学习胆固醇测定的一种方法，学会制备无蛋白血清液。
二、原理
血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇及其酯则溶在无水乙醇中。在乙醇提取液中加磷酸铁试剂（即浓硫酸和三价铁溶液），胆固醇及其酯与试剂形
成比较稳定的紫红色化合物，呈色程度与及其酯含量成正比，可用比色法（560nm）定量测定。
胆固醇的结构如下：
三、实验器材
1、人血清。4、离心管0.6cm×4cm（×2）。
2、紫外光可见分光光度计。5、试管1.5cm×15cm（×3）。
3、离心机（4000r/min）。6、吸管0.1ml（×1）、1ml（×3）、5ml（×1）。
四、实验试剂
1、10%三氯化铁溶液：10gFeCl3·6H2O（A.R.）溶于磷酸（A.R.），定容至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏，可用一年。
2、硫酸铁试剂（P·S·Fe试剂）：取10%FeCl3溶液1.5ml于100ml棕色瓶内，加浓硫酸（A.R.）至刻度。
3、胆固醇标准贮液：准确称取胆固醇（C.P.）80mg，溶于无水乙醇，定容至100ml。
4、胆固醇标准溶液：将贮液用无水乙醇准确稀释10倍即得，此标准溶液含0.08mg/ml胆固醇。
5、无水乙醇。
五、操作
1、胆固醇的提取
吸取血清0.1ml置于干燥离心管内，先加无水乙醇0.4ml，摇匀后再加无水乙醇0.2ml，摇匀，10min后离心（3000r/min）5min，取上清液备用。
2、比色测定
取干燥试管3支，编号，分别加入无水乙醇1.0ml（空白管）、胆固醇标准溶液1.0ml（标准管）、上述乙醇提取1.0ml（样品管），各管皆加入硫酸铁试剂1.0ml，摇匀，10min后，分别转移至比色杯内，用紫外可见分光光度计在560nm处比色。
六、计算
m=÷0.04×100
式中m：100ml血清中胆固醇的质量（mg）；
A1：样品液的吸光度；
A0：标准液的吸光度；
C0：标准液中胆固醇浓度，即0.08mg/ml；
0.04：1ml血清胆固醇乙醇提取液相当于0.04ml的血清；
100：100ml血清。
100ml人血清中胆固醇的质量正常值为110~220mg。
七、注意事项
硫酸铁实际中含磷酸、硫酸，还有三氯化铁，称量三氯化铁时，注意防潮，要快速称量，因其氧化性，称量后注意清洁残留物。不要用称量纸类，要用烧杯称量，再缓慢加入磷酸。用时，小心加入硫酸即成；配置好的磷酸铁试剂，放入通风橱内，用时小心，防止腐蚀。
思考题
测定血清中胆固醇的含量，有何临床意义？胆固醇对人的作用有哪些？如何控制膳食中的胆固醇？
八．维生素C的定量测定——磷钼酸法
一、目的
1、了解维生素C的测定方法。
2、加深理解维生素C的理化性质。
二、原理
钼酸铵在一定条件下（有硫酸和偏磷酸根离子存在）与维生素C反应生成蓝色结合物，在一定浓度范围内（样品控制浓度在25至250μg/ml）吸光度与浓度成直线关系，在偏磷酸存在下，样品所存在的还原糖及常见的还原性物质均无干扰，因而专一性好，且反应迅速。
MoOI-+维生素CMo(MoO4)3+维生素C
三、实验器材
1、松针、绿色蔬菜、橘子、广柑等富含维生素C的生物材料。
2、紫外可见光光度计
3、水浴锅
4、离心机4000r/min7、试管1.5cmK15cm（K10）
5、组织捣碎机8、试管架
6、吸管0.10ml(K2),0.20ml(K2)9、吸管架
四、实验试剂
1、5%钼酸铵：5g钼酸铵加蒸馏水定容至100ml。
2、草酸（0.05mol/L）-EDTA(0.2mmol/L)溶液：称取H
2C
2
O
4
-2H
2
O6.3g和
EDTA-Na
2`2H
2
O0.0744g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml。
3、硫酸（1:19）：称取19份体积蒸馏水加入1份体积硫酸。
4、冰乙酸（1:5）：称取5份体积水加入1份体积冰乙酸即成。
5、偏磷酸-乙酸溶液：取粉碎好的偏磷酸3g，加入48ml（1:5）冰乙酸，溶解后加蒸馏水稀释至100ml；必要时过滤；此试剂放冰箱中可保存3天。
6、标准维生素C溶液（0.25mg/ml）:准确称取维生素C25mg，用蒸馏水溶液，加适量草酸-EDTA溶液，然后用蒸馏水稀释至100ml，放冰箱贮存，可用一周。
五、操作
1、制作标注曲线
取试管9支，按表52进行操作。
30℃水浴15min后，测定，以吸光度值为纵坐标，维生素质量（μg）为横坐标作图。
3、样品测定
将所用生物材料如青菜、松针，洗净擦干，真确称量5.000至10.000g，加入草酸-EDTA溶液至50ml，组织捣碎机中匀浆2min，取上清液离心（4000r/min）5min(也可准确称量5.000g，加入研钵内，加入少许草酸-EDTA溶液，捣碎，如此反复三次，最后一并倒入100ml容量瓶内，然后用草酸-EDTA溶液定容至100ml，取上清，离心。)，取上清液0.5ml，加蒸馏水0.5ml，其余按做标准曲线第三步（即加草酸-EDTA）做起，根据吸光度值查标准曲线。
六、计算
m=[(m
b V
1
)/m
1
V
2
K103]
式中m:100g样品中含抗血酸的质量（mg）
m
B
：查标准曲线所得维生素C的质量（μg）
V
1
：稀释总体积（ml）
m
1
：称样质量（g）
生物化学实验的答案 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】
生物化学实验的答案 一、理论考试部分 1.醋酸纤维薄膜电泳时，点样的一端应靠近电极的哪一端为什么 2. 答：负极。因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 3.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的意义是什么？ 答：空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 4.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳的原理？ 答：血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为8.6时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 5.何谓R f值？影响R f值的主要因素是什么？ 答：Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关， 6.什么是盐析盐析会引起蛋白质变性吗一般我们用什么试剂做盐析的实验 答：盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性。一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析。 7.简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答：还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 8.依据我们所做的实验，说明影响蛋白质沉淀的因素是什么影响蛋白质变性的因素是什 么沉淀和变性有何联系 答：水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下蛋白质颗粒因失去电荷和脱水而沉淀。这些因素包括溶液的酸碱度、盐溶液的浓度、温度、重金属离子以及有机溶剂等。变性蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性。 8. 什么是碘值脂肪的不饱和程度越大，碘值越大吗在测定碘值的实验中，氯仿的作用是什么 答：每100g脂肪所吸收的碘的克数，即脂肪的碘值。脂肪的不饱和度越大，碘值就越大。氯仿作为溶剂，去溶解脂肪。
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
生物化学实验习题及参 考答案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（ ） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为（）
第一章糖类 提要 糖类是四大类生物分子之一，广泛存在于生物界，特别是植物界。糖类在生物体内不仅作为结构成分和主要能源，复合糖中的糖链作为细胞识别的信息分子参与许多生命过程，并因此出现一门新的学科，糖生物学。 多数糖类具有(CH2O)n的实验式，其化学本质是多羟醛、多羟酮及其衍生物。糖类按其聚合度分为单糖，1个单体；寡糖，含2-20个单体；多糖，含20个以上单体。同多糖是指仅含一种单糖或单糖衍生物的多糖，杂多糖指含一种以上单糖或加单糖衍生物的多糖。糖类与蛋白质或脂质共价结合形成的结合物称复合糖或糖复合物。 单糖，除二羟丙酮外，都含有不对称碳原子(C*)或称手性碳原子，含C*的单糖都是不对称分子，当然也是手性分子，因而都具有旋光性，一个C*有两种构型D-和L-型或R-和S-型。因此含n个C*的单糖有2n个旋光异构体，组成2n-1对不同的对映体。任一旋光异构体只有一个对映体，其他旋光异构体是它的非对映体，仅有一个C*的构型不同的两个旋光异构体称为差向异构体。 单糖的构型是指离羧基碳最远的那个C*的构型，如果与D-甘油醛构型相同，则属D系糖，反之属L 系糖，大多数天然糖是D系糖Fischer E论证了己醛糖旋光异构体的立体化学，并提出了在纸面上表示单糖链状立体结构的Fischer投影式。许多单糖在水溶液中有变旋现象，这是因为开涟的单糖分子内醇基与醛基或酮基发生可逆亲核加成形成环状半缩醛或半缩酮的缘故。这种反应经常发生在C5羟基和C1醛基之间，而形成六元环吡喃糖(如吡喃葡糖)或C5经基和C2酮基之间形成五元环呋喃糖(如呋喃果糖)。成环时由于羰基碳成为新的不对称中心，出现两个异头差向异构体，称α和β异头物，它们通过开链形式发生互变并处于平衡中。在标准定位的Hsworth式中D-单糖异头碳的羟基在氧环面下方的为α异头物，上方的为β异头物，实际上不像Haworth式所示的那样氧环面上的所有原子都处在同一个平面，吡喃糖环一般采取椅式构象，呋喃糖环采取信封式构象。 单糖可以发生很多化学反应。醛基或伯醇基或两者氧化成羧酸，羰基还原成醇；一般的羟基参与成脂、成醚、氨基化和脱氧等反应；异头羟基能通过糖苷键与醇和胺连接，形成糖苷化合物。例如，在寡糖和多糖中单糖与另一单糖通过O-糖苷键相连，在核苷酸和核酸中戊糖经N-糖苷键与心嘧啶或嘌呤碱相连。 生物学上重要的单糖及其衍生物有Glc, Gal，Man, Fru,GlcNAc, GalNAc,L-Fuc,NeuNAc (Sia),GlcUA 等它们是寡糖和多糖的组分,许多单糖衍生物参与复合糖聚糖链的组成，此外单糖的磷酸脂，如6-磷酸葡糖，是重要的代谢中间物。 蔗糖、乳糖和麦芽糖是常见的二糖。蔗糖是由α-Glc和β- Fru在两个异头碳之间通过糖苷键连接而成，它已无潜在的自由醛基，因而失去还原，成脎、变旋等性质，并称它为非还原糖。乳糖的结构是Gal β(1-4)Glc，麦芽糖是Glcα(1-4)Glc,它们的末端葡萄搪残基仍有潜在的自由醛基，属还原糖。环糊精由环糊精葡糖基转移酶作用于直链淀粉生成含6,7或8个葡萄糖残基，通过α-1,4糖苷键连接成环，属非还原糖，由于它的特殊结构被用作稳定剂、抗氧化剂和增溶剂等。 淀粉、糖原和纤维素是最常见的多糖，都是葡萄糖的聚合物。淀粉是植物的贮存养料，属贮能多糖，是人类食物的主要成分之一。糖原是人和动物体内的贮能多糖。淀粉可分直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉分子只有α-1,4连键，支链淀粉和糖原除α-1,4连键外尚有α-1,6连键形成分支，糖原的分支程度比支链淀粉高。纤维素与淀粉、糖原不同，它是由葡萄糖通过β-1.4糖苷键连接而成的，这一结构特点使纤维素具有适于作为结构成分的物理特性，它属于结构多糖。 肽聚糖是细菌细胞壁的成分，也属结构多糖。它可看成由一种称胞壁肽的基本结构单位重复排列构成。胞壁肽是一个含四有序侧链的二糖单位，G1cNAcβ(1-4)MurNAc，二糖单位问通过β-1,4连接成多糖，链相邻的多糖链通过转肽作用交联成一个大的囊状分子。青霉素就是通过抑制转肽干扰新的细胞壁形成而起抑菌作用的。磷壁酸是革兰氏阳性细菌细胞壁的特有成分;脂多糖是阴性细菌细胞壁的特有成分。 糖蛋白是一类复合糖或一类缀合蛋白质。许多内在膜蛋白质和分泌蛋白质都是糖蛋白。糖蛋白和糖脂中的寡糖链，序列多变，结构信息丰富，甚至超过核酸和蛋白质。一个寡糖链中单糖种类、连接位置、异
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
生物化学实验理论考试题答案 1.醋酸纤维薄膜电泳时点样端应靠近电极的哪一端，为什么？ 答；电泳时点样端应靠近负极，因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 2.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的作用,为什么？ 答；空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 3.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜的电泳原理？ 答；血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为8.6时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 4.何谓Rf值？影响Rf值的因素？ 答;Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关，对同一种物质来讲Rf是一个常量。 5.什么是盐析？盐析会引起蛋白质的变性吗？一般用什么试剂? 答;盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性，因为蛋白质的结构并未发生改变，去掉引起盐析的因素蛋白质仍能溶解；一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析 6.简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答;还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 7.影响蛋白质沉淀的因素是什么？沉淀和变性有什么联系？ 答;水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、?-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用? D、沉淀作用? 10、有关变性的错误描述为（） A、蛋白质变性后，其一级结构和空间结构改变 B、蛋白质变性后，其理化性质和生物学活性改 变C、加热、紫外线照射、超声波等可以引起蛋白质变性D、变性蛋白质粘度增加，易被酶水解，易沉淀 11、双链DNA热变性后（） A、黏度下降 B、沉降系数下降 C、浮力密度下降 D、紫外吸收下降 12、酶的活化和去活化循环中，酶的磷酸化和去磷酸化位点通常在酶的哪一种氨基酸残基上（）
《生物化学实验Ⅰ》总复习思考题 部分是自己做的，部分是百度的，各位看官如果要借鉴请酌情考虑，后果自负。 ——江湖游子 1. 请掌握下列生物化学实验常用仪器的正确操作使用方法，并能回答以下问题： （1）离心机使用时为什么要平衡？普通离心机与高速离心机在平衡时有什么不同要求？ 平衡是为了让转动物体重心正好在转轴上，如果不在，会对转轴产生很大作用力，有时整台机器会跟着晃动。这对机器损耗很大。转速越高的离心机不光重量很重，使用时还要特别放平衡，就连离心管里面的试液都要放置等量，离心管还要对称放入转子试管孔内，以确保转子平衡运行，而且在调节转速时，还要使用分段升速法。 (2)为什么用高速组织捣碎机进行动、植物组织捣碎时，需采用间歇式方式进行操作？ 为了防止产热过高，破坏组织内的蛋白质。防止蛋白变性。 (3)用真空泵进行减压抽滤时，为什么要连接缓冲瓶？ 防止负压产生，引起水泵里的水或油泵里的油倒吸，进入滤瓶中，污染滤液。 2.为什么肝糖元只能从刚宰杀的动物肝脏中获取？在提取肝糖元过程中，三氯乙酸、95%乙醇各起什么作用？糖元水解产物中如果存在提取中残留蛋白质时，在用班氏试剂检测水解产物，有什么影响！ 动物死亡后，体内的细胞还能存活一段时间，由于进行细胞呼吸作用，肝细胞会消耗肝糖元，所以必须用新鲜的肝脏细胞。三氯乙酸是固定作用（蛋白质能被三氯乙酸沉淀）；乙醇：糖元不溶于乙醇，可以提取糖元。班氏试剂使用时需要加热，而加热会时残留的蛋白质变性水解，对最终测得的水解产物颜色可能有影响。（水解的产生的氨气结合铜离子，是铜离子的氧化性失去，导致生产绛蓝色沉淀，实验将失败） 3.请阐述分光光度仪的主要部件及其功能；阐述紫外与可见光的光波长范围；在紫外与可见光范围内测定物质吸光度时，对光源与吸收池有何要求？光电管的功能是什么？为什么说光电管是分光光度仪最脆弱和最易损的部件？ 光源（钨灯）：发光。 单色器：把混合光波分解为单一波长光的装置。 吸收池：盛放待测流体（液体、气体）试样的容器。该容器应具有两面互相平行、透光且有精确厚度的平面。它藉助机械操作能把待测试样间断或连续地送到光路中，以便吸收测量的辐射（光）通量。 检测器：将单色器分出的光信号进行光电转换，电信号在工作站显示成出峰。 测量装置：通过测得的电流表·记录器·数字示值读书单元的数据来绘制吸收曲线。 紫外光：200至350nm 可见光波长:350至760nm 紫外测定：其应用波长范围为200～400nm的紫外光做光源，在低于350nm的紫外光区工作时，必须采用石英池或熔凝石英池。 可见光测定：用波长为400～850nm的可见光作光源，可以用玻璃池·石英池·熔凝池。 光电管的功能：光电转换，将光信号转化成电信号。 光电管容易产生光电管疲劳：所以不测定时必须将试样室盖盖好，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。
生物化学实验的答案 一、理论考试部分 1.醋酸纤维薄膜电泳时，点样的一端应靠近电极的哪一端？为什么？ 答：负极。因为血清中各种蛋白质在PH 为的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 2.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的意义是什么？ 答：空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 3.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳的原理？ 答：血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 4.xxR f 值？影响R f 值的主要因素是什么？ 答：Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关， 5.什么是盐析？盐析会引起蛋白质变性吗？一般我们用什么试剂做盐析的实验？ 答：盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性。一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析。 6?简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答：还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的
3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5 硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5 硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 7.依据我们所做的实验，说明影响蛋白质沉淀的因素是什么？影响蛋白质变 性的因素是什么？沉 xx 变性有何联系？ 答：水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下蛋白质颗粒因失去电荷和脱水而沉淀。这些因素包括溶液的酸碱度、盐溶液的浓度、温度、重金属离子以及有机溶剂等。变性蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性。 8.什么是碘值？脂肪的不饱和程度越大，碘值越大吗？在测定碘值的实验中，氯仿的作用是什么？ 答：每100g 脂肪所吸收的碘的克数，即脂肪的碘值。脂肪的不饱和度越大，碘值就越大。氯仿作为溶剂，去溶解脂肪。 9.简述薄层层析法分离糖类的原理？答:薄层层析的实质就是吸附层析，也就 是在铺有吸附剂的薄层上，经过反 复地被吸附剂吸附以及被扩展剂扩展的过程。而吸附剂对不同的物质的吸附力不同，从而使糖在薄层上的泳动速度不同达到分离的目的。 10.等电点的定义？蛋白质在等电点时有哪些特点？ 答：当溶液的PH为一定数值时，其中的蛋白质正负电荷相等，即净电荷为 零，此时的PH值就是该蛋白质等电点。蛋白质在等电点时的溶解度最小。 11.在蛋白质显色实验的黄色反应中，反应原理是什么？实验结果为什么会出现深浅不一的黄色？
大学生生物化学实验技能大赛初赛试题及答案 一、选择题 1、下列实验仪器中，常用来取用块状固体药品的仪器是（）。 A. 药匙 B. 试管夹 C. 镊子 D. 坩埚钳 2、托盘天平调零后，在左盘衬纸上置氧化铜粉末，右盘衬纸上置1个5g砝码，游码标尺示数如下，此时天平平衡。则被称量的氧化铜质量为（）。 A. 8.3 g B. 7.7 g C. 3.3 g D. 2.7 g 3、用减量法从称量瓶中准确称取0.4000 g分析纯的NaOH固体，溶解后稀释到100.0 mL，所得NaOH溶液的浓度为（）。 A. 小于0.1000 mol/L B. 等于0.1000 mol/L C. 大于0.1000 mol/L D. 三种情况都有可能 4、已知邻苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4）的摩尔质量为204.2 g/mol，用作为基准物质标定0.1 mol/L NaOH溶液时，如果要消耗NaOH溶液为25 mL左右，每份应称取邻苯二甲酸氢钾（）g左右。 A. 0.1 B. 0.2 C. 0.25 D. 0.5 5、NaHCO3纯度的技术指标为≥99.0%，下列测定结果哪个不符合标准要求？（）。 A. 99.05% B. 99.01% C. 98.94% D. 98.95% 6、精密称取马来酸氯苯那敏对照品12 mg，应选取（）的天平。 A. 千分之一 B. 万分之一 C. 十万分之一 D. 百万分之一 7、实验室标定KMnO4溶液，常用的基准物质是（）。 A. Na2CO3 B. Na2S2O3 C. Na2C2O4 D. K2Cr2O7 8、标定氢氧化钠常用的基准物质是（）。 A. EDTA B. K2Cr2O7 C. 草酸 D. 邻苯二甲酸氢钾 9、下列物质可以作为基准物质的是（）。 A. KMnO4 B. Na2B4O7·7H2O C. NaOH D. Na2S2O3 10、下列物质中，可以用直接法配制标准溶液的是（）。 A. 固体NaOH B. 浓HCl C. 固体K2Cr2O7 D. 固体Na2S2O3
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生物化学实验 一、名词解释： 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题： 1. 测定蛋白质含量的方法有，，和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2，其活性大小以来表示，当CAT与H2O2反应结束，再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳，这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶，其自由基的引发剂是，催化剂是______________；光聚合法适于制备大孔径的_________________胶，催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________，_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前，必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，表示E对S的亲合力愈，Km愈大，表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热，注意预热及样品槽空时必须_________（打开、合上）样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中，____________形成固定相，____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的，在具有自由基团体系时，两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种：和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________和________________。 三、问答题： 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些？ 参考答案： 生物化学实验 一、名词解释： 1、电泳：指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法：用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。
实验一胆固醇的提取2012-11-15 16:20:00 生物师范班题目 1.比色法测定样品的理论基础是什么？ 被测样品必须要有颜色。 2. 胆固醇含量在多少范围时，与值呈良好的线性关系？ 在400mg/ml范围内。 3.在提取胆固醇的过程中，为什么要加无水乙醇？ 促使蛋白质沉淀。 4.在试管中加入1ml磷硫铁试剂，会产生什么现象？（至少写2点） 产生紫红色化合物。产生热量。 5.在无水乙醇中加磷硫铁试剂时，正确的加法是什么？将产生什么现象？请准确描述 该现象。 沿管壁慢慢加入。溶液分层。上层是无水乙醇，下层是磷硫铁试剂。 1. 胆固醇提取过程中，无水乙醇为什么要分两次加入？ 目的是使蛋白质以分散很细的沉淀颗粒析出。 2.我们用比色法测定胆固醇含量的仪器名称是什么？ 分光光度计 3. P-S-Fe试剂配置时，能用稀硫酸吗？为什么？ 不能。因为FeCl3本身是亲水性物质，稀硫酸中含有水，会降低P-S-Fe试剂的浓度，从而导致反应不能发生。 4.请简述移液枪的使用步骤。 根据所要吸取的溶液的体积选定合适量程的移液枪。 调好量程。 插枪头。 吸取液体。 将移液枪的量程调至最大。 5. 请简述0.08mg/ml胆固醇标准溶液的配置方法。 准确称取胆固醇80mg，溶于无水乙醇，定容至100ml 将贮液用无水乙醇准确稀释10倍既得。
实验二总糖和还原糖测定2012-11-15 16:20:00 生物师范班 1. 请写出还愿糖与非还原糖结构的不同之处 拥有自由的醛基和酮基 2. 对没有还原性的糖，用什么方法进行糖含量的测定？ 酸水解的方法将非还原性的糖降解呈还原糖。 3. DNS之所以能和还原糖反应，是因为其结构中含有__________? 硝基 4. 如果将DNS和其与还原糖反应的产物同时进行比色，谁的A值更大？为什么？ 产物的更大，因为产物生成棕红色，颜色越深，吸光度越高。 5. 还原糖提取过程中，为什么要离心两次？ 因为这样可以更好地将还原糖全部提取出来。第二次洗涤沉淀。 海洋技术班 1.单糖都是还原糖吗？为什么？ 是的，因为有自由醛基和酮基 2.为什么能用比色法测定还原糖的量？ 因为还原糖的量与光吸收值呈线性关系。 3.DNS的全称是？ 3,5-二硝基水杨酸 4.总糖提取过程中，碘液的作用是什么？ 确认淀粉水解完全。 5.请简述标准曲线的作用。 通过标准曲线来算出未知样品的浓度。
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净； 3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果； 4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。
生物化学实验方法手册 Markus R Wenk National University of Singapore, Singapore Aaron Zefrin Fernandis National University of Singapore, Singapore A Manual For Biochemistry Protocols 2007,127pp. Paperback ISBN 978-981-270-066-7 Markus R Wenk等编 该书是生物医学研究手册丛书的第三卷，其前两卷分别是《初级哺乳动物细胞培养手册》和《生物医学研究中的显微镜技术》，后续还将推出《生物材料及骨架编织技术手册》和《知识产权管理手册》，这五卷均由世界科学出版社出版。 本手册共分为6章，各章内容分别是：1.蛋白纯化；2.蛋白分析；3.脂肪分析；4.哺乳动物细胞培养；5.显微镜学； 6.分析与鉴定。作者希望这本手册不仅仅是将各种生物化学实验方法的简单罗列，更希望读者能够通过这本手册掌握生
物化学实验技巧进而理解这些方法背后的原理。这本手册将给广大读者带来一个全景式的生物化学，尤其对于那些初次踏入生物化学领域的读者，选择这本手册会是一个不错的开始。 这本手册的编者都是科研一线人员，所编著的方法实用且前沿，并且详尽地介绍了生物化学中可能会使用的实验方法。 本手册适合从事生物化学、分子生物学的相关人员，在实验中它是一本不错的参考工具。 程恩隽，博士生 (国家纳米科学中心） Chengenjun, DoctoralCandidate (National Center for Nanoscience and Nanotechnology ,China)
《生物化学实验》容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事的科学态度。 二、实验容
包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据； （3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。 3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性
糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电加热板或电 炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻璃棒1根； 100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）；不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若干。每个洗 手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。 四、实验操作 取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎，加入5～10ml蒸馏水，在研钵中磨成均浆，转入锥形瓶中，用蒸馏水少量多次冲洗研钵，洗出液也转入锥形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中，同法残渣再提取2~3次，将提取液合并至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。贴好标签，保存至冰箱中，用于实验二。 五、实验结果与讨论 1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。 2、结合实验二结果计算含量 六、实验注意事项 （1）若有干扰，可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质，乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质，若色素较多可脱脂。 （2）加热时应小心，避免灼伤皮肤。 七、思考题 1、可溶性糖在植物物质代中的作用。