第38卷 第6期2007年12月
解 剖 学 报
ACT A ANAT OMIC A SI NIC A
V ol 138,N o 16
Dec.2007
卵丘细胞凋亡对体外培养卵母细胞发育潜能的影响
杨永杰
1,2
张燕君
23
李媛
1,33
(11山东省立医院生殖医学中心;21山东大学生命科学学院;
31山东大学生殖医学研究中心,济南 250021)
[摘要] 目的 研究体外培养中卵丘细胞凋亡对卵母细胞结构的影响,探讨体外受精中可用卵丘细胞凋亡率预测卵母细胞发育潜能的原因。方法 对G V 期人卵丘2卵母细胞复合体进行体外成熟培养,用HE 染色、DAPI 染色和原位末端标记(T UNE L )法标记3种方法对单卵卵丘细胞凋亡率进行检测。分为凋亡率高和低的2组,用光镜和透射电镜观察卵母细胞的结构。对M Ⅱ期卵母细胞进行体外受精,培养2d 后在光镜下评价胚胎质量。结果 卵丘细胞凋亡率低的卵母细胞结构和发育潜能良好;卵丘细胞凋亡率高的卵母细胞发育潜能差,存在各种结构异常,包括围卵周隙不均,对应不同部位的细胞质发育不同步;细胞质中出现堆积不均的细胞器团、次级溶酶体、及可能由溶酶体降解造成的大量空隙;线粒体外膜和嵴模糊、膨大,呈现凋亡迹象;第一极体碎裂;透明带异常增厚或变薄。相应的卵丘细胞微绒毛和细胞连接减少。结论 揭示了卵丘细胞凋亡对卵母细胞结构的影响,揭示了卵丘细胞凋亡率影响卵母细胞发育潜能的原因。
[关键词] 卵丘细胞;卵母细胞;凋亡;发育潜能;体外成熟;原位末端标记;人[中图分类号] Q248 [文献标识码] A [文章编号] 052921356(2007)062697
[收稿日期] 2007203202 [修回日期] 2007204212[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(30772328)
[作者简介] 杨永杰(1975—
),女(汉族),山东省济南市人,硕士。3通讯作者(T o whom correspondence should be addressed )
E 2mail :sdliyuan @https://www.doczj.com/doc/e410823099.html, T el :(0531)85187859
zhangyj @https://www.doczj.com/doc/e410823099.html, T el :(0531)82603579
THE EFFECTS OF CUMU L US CE LL APOPTOSIS ON DEVE LOPMENTAL
POTENTIAL OF HUMAN OOCYTE IN VITRO
Y ANG Y ong 2jie
1,2
,ZH ANG Y an 2jun 23,LI Y uan 1,3
3
(11Reproductive Center o f Shandong Provincial Hospital ;21School o f Life Sciences ,Shandong Univer sity ;
31Reproductive Center o f Shandong Univer sity ,Ji ’nan 250021,China )
[Abstract ] Objective T o study the effect of cumulus cell apoptosis on the structure of human oocyte cultured in vitro and to probe into the reas on why cumulus cell apoptosis rate can be used clinically to predict the developmental potential of oocyte.Methods Cumulus 2enclosed oocyte com plexes (C OCs )at the G V stage were cultured in vitro .The apoptosis rate of cumulus cells for every C OC was evaluated with HE staining ,DAPI staining and T UNE L labeling methods.O ocytes were divided into tw o groups according to their cumulus cell apoptosis rate.S tructure of oocytes was observed under light microscope and transmission electron microscope.Mature oocytes at M Ⅱstage were fertilized and cultured in vitro for tw o days.Then the embry os were evaluated according to their m orphology under light microscope.R esults The oocytes with low cumulus cell apoptosis rate had a normal structure and a promising developmental potential ,while the oocytes with high cumulus cell apoptosis rate had deformed structures and a poor developmental potential.S ome deformed oocytes had uneven perivitelline space.F or oocytes with a small perivitelline space ,the organelle development was slow com pared with those with a large perivitelline space.S ome had unevenly piled organelles.Secondary lys os omes and large space probably caused by the decopm ounding of lys os omes were found in the ooplasm of these oocytes.The deformed oocytes appeared to have lots of s w ollen mitochondria with blurred cristae and membrane.S ome of these oocytes had fractured first polar bodies and abnormally thick or thin zona pellucida.The cell junctions and microvilli of cumulus cells reduced as well.Conclusion The effect of cumulus cell apoptosis on the structure of oocyte cultured in vitro was revealed.The reas on why cumulus cell apoptosis rate prognosticated the developmental potential of oocyte was dem onstrated in the aspect of oocyte structure.
[K ey w ords ] Cumulus cell ;O ocyte ;Apoptosis ;Developmental potential ;In vitro maturation ;T UNE L ;Human
人类卵泡的发育和成熟受到生殖激素、内分泌和旁分泌肽类细胞生长因子规则而有序的调节。卵
丘细胞在其中起着重要作用。D owns 等[1]
发现,FSH 能诱导体外培养的卵丘2卵母细胞复合体中的卵母细胞出现生发泡破裂(germinal vesicle break down ,G VBD ),但不能使裸卵发生G VBD 。卵丘细胞通过旁分泌机制调控卵母细胞的减数分裂过程。小分子物质通过缝隙连接从卵丘细胞进入卵母细胞内调节
卵母细胞的发育[2]
。卵丘细胞的功能状况直接影响卵母细胞的成熟及发育潜能。
体内外的研究都发现,在卵母细胞的正常成熟过程中,存在卵丘细胞凋亡现象,卵丘细胞凋亡率影
响卵母细胞和随后胚胎的发育潜能[3]
。对卵丘细胞凋亡影响卵母细胞发育潜能的原因已有一些报道[4]
,但迄今未见卵丘细胞凋亡对卵母细胞结构影响的详细报道。本研究对G V 期人卵丘复合物进行体外成熟培养,用HE 染色、4,62联脒222苯基吲哚(DAPI )染色和原位末端标记(T UNE L )3种方法检测单卵卵丘细胞的凋亡率,用光镜和透射电镜研究卵丘细胞凋亡率对卵母细胞结构的影响,试图从卵母细胞结构方面揭示卵丘细胞凋亡率影响卵母细胞发育潜能的原因。
材料和方法
11卵丘2卵母细胞复合体的获取和体外培养
卵丘2卵母细胞复合体(cumulus 2enclosed oocyte com plexes ,C OCs )来自于接受卵母细胞体外成熟2胚
胎移植治疗的88例年龄26～32岁,平均(2718±317)岁的患者。患者于月经周期10～12d 肌注人绒毛膜促性腺激素(HCG,Sigma )10000I U ,36h 后在异丙酚静脉麻醉下行未成熟卵取卵术。
取出的C OCs 在保温条件下立即送入细胞培养室,在体视显微镜下挑选G V 期C OCs 411个,置于含有01075I U FSH 、015I U hCG 、10μg ΠL EG F 、0129mm ol ΠL 丙酮酸钠、10%胎牛血清的T C M 2199(G ibco )培养液中,在37℃、5%C O 2培养箱中培养30h 。21卵丘细胞的收集和凋亡检测
征求患者签字同意,收集卵丘细胞用于凋亡检
测。C OCs 体外培养30h 后,移入8×104
I U ΠL 透明质酸酶(Sigma )中30s ,然后用吸管轻轻吹打卵丘细胞。于4℃1000×g 离心10min ,收集单卵的卵丘细胞,P BS 漂洗、分散后,分为3份,分别用HE 染色、DAPI 染色和T UNE L 方法检测卵丘细胞的凋亡。
将单卵卵丘细胞涂片,自然干燥;HE 染色法检测卵丘细胞凋亡,按文献[5]报道的方法进行。光镜下观察500个卵丘细胞Π卵,计算卵丘细胞凋亡率。
将单卵卵丘细胞涂片,自然干燥,DAPI 染色法
检测卵丘细胞凋亡,按照文献[6]报道的方法进行。荧光显微镜下观察500个卵丘细胞Π卵,计算卵丘细胞凋亡率。
T UNE L 法检测卵丘细胞凋亡按照T UNE L 原位凋亡检测试剂盒(美国R&D )说明进行。将单卵卵丘细胞涂片,自然干燥,经固定、透化后,过氧化物酶封闭,末端脱氧核苷酸转移酶进行DNA 缺口的dUTP 标记,DAB 显色,甲基绿复染后封片,镜检观察500个卵丘细胞Π卵,计算卵丘细胞凋亡率。31卵母细胞结构观察
征求患者签字同意,收集G V 期卵母细胞2枚,未培养,用于培养前卵母细胞结构观察。培养30h 后,收集卵丘细胞凋亡率低的卵母细胞5枚,均为M Ⅱ期;收集卵丘细胞凋亡率高的卵母细胞14枚,其中G V 期2枚,M Ⅰ期2枚,M Ⅱ期10枚,用于卵母细胞结构研究。
卵母细胞在P BS 中洗1次,在215%的戊二醛(Sigma )中4℃固定过夜。然后用P BS 洗3次,2%琼脂糖(Sigma )预包埋,1%锇酸固定50min ,P BS 洗3次,乙醇、丙酮逐级脱水,环氧树脂812包埋,
LK B 2Ⅲ型超薄切片机切半薄切片,厚2～3μm 1%亚甲基蓝染色,光镜观察。
50～70nm 超薄切片经醋酸铀、枸橼酸铅双染后,透射电镜(日本电子1200ES )观察并摄片。41体外受精和胚胎的培养及评分
C OCs 体外培养30h 后(计为0d ),倒置显微镜下观察卵母细胞的成熟情况。有第一极体释放的为MII 期成熟卵母细胞,随后行卵胞浆内单精子注射。16～18h 后(1d ),卵细胞浆内出现双原核为正常受精,继续在胚胎培养液中培养24h 后(2d ),参照Dale 的标准[7]
,稍做修改后[8]
,进行胚胎质量评价:卵裂球均匀或轻度不均,核碎片≤15%,评为优质胚胎;卵裂球轻度不均或不均,核碎片>15%评为非优质胚胎。随后选择优质胚胎进行宫腔内移植。51数据处理
用SPSS 1010中ANOVA 模块进行统计学分析。
结果
11卵丘细胞凋亡与卵母细胞发育潜能的关系
111 HE 染色法检测卵丘细胞凋亡的结果:卵丘细胞的HE 染色结果表明,卵丘细胞核大,胞质较
少。未凋亡的细胞核染色浅而均一;凋亡细胞体积缩小,细胞核染色深,呈网纹状,染色质向核周边凝集(图1A )。
根据卵母细胞的发育命运进行分组,对HE 染色法检测的卵丘细胞凋亡率进行统计学分析,结果见表1。发育为妊娠胚胎的第1组其卵丘细胞的凋
?896? 解 剖 学 报38卷,6期
亡率最低,随着卵子发育潜能的降低,卵丘细胞的凋亡率增加。除第1组与发育为优质胚胎的第2组卵丘细胞的凋亡率差异不显著(P>0105),2d受精而不分裂的第4组和2d仍不成熟的第5组差异不显著(P>0105)外,其他各组之间有显著的差异(P< 0105)。
112 DAPI法检测卵丘细胞凋亡的结果:DAPI染色后在荧光显微镜下观察,正常卵丘细胞核染色浅而均匀;凋亡细胞染色质固缩,向外周聚集;凋亡细胞的细胞核呈致密浓染,有些呈碎块状致密浓染(图1B)。
DAPI法检测结果见表2。随着卵子发育潜能的降低,卵丘细胞的凋亡率增加。除第1组与发育为优质胚胎的第2组的卵丘细胞的凋亡率差异不显著(P>0105)外,各组之间都存在显著差异(P< 0105)。
113 T UNE L法检测卵丘细胞凋亡的结果:凋亡阳性细胞表现为棕黄色染色,凋亡阴性细胞核只被甲基绿染成淡绿色(图1C)。
T UNE L法检测结果见表3。第1、2组之间差异不显著(P>0105),其余各组卵丘细胞的凋亡率差异显著(P<0105)。
表1 卵母细胞发育潜能与卵丘细胞凋亡的关系(HE染色法)
T able1 Relationship between the developmental fate of the oocyte and the apoptosis of cumulus cells(HE staining)
组别groups
卵母细胞发育命运
developmental fate of oocytes
样本数
number
卵丘细胞凋亡率(%)
cumulus cell apoptosis rate
1发育为妊娠胚胎(pregnant embry os)21615701±112506c
2发育为优质胚胎(embry os of g ood quality)177616800±41167E202c
3发育为非优质胚胎(embry os of bad quality)98810652±011100b
42d受精而不分裂(fertilized but not divide at2d)68913863±011270a
52d仍不成熟(immatured at2d)45914900±014784a
注:与其他各组比较。标相同字母:P>0105;标不同字母:P<0105
N ote:C om pared with the other groups.Same characters indicate no significant difference(P>0105);Different characters indicate significant difference(P <0105).
表2 卵母细胞发育潜能与卵丘细胞凋亡的关系(DAPI染色法)
T able2 Relationship between the developmental fate of the oocyte and the apoptosis of cumulus cells(DAPI staining)
组别groups
卵母细胞发育命运
developmental fate of oocytes
样本数
number
卵丘细胞凋亡率(%)
cumulus cell apoptosis rate
1发育为妊娠胚胎(pregnant embry os)21615476±011734d
2发育为优质胚胎(embry os of g ood quality)177619394±71700E202d
3发育为非优质胚胎(embry os of bad quality)98811625±012265c
42d受精而不分裂(fertilized but not divide at2d)68818519±011130b
52d仍不成熟(immatured at2d)451114793±015260a
注:与其他各组比较。标相同字母:P>0105;标不同字母:P<0105
N ote:C om pared with the other groups.Same characters indicate no significant difference(P>0105);Different characters indicate significant difference(P <0105).
表3 卵母细胞发育潜能与卵丘细胞凋亡的关系(T UNE L标记法)
T able3 Relationship between the developmental fate of the oocyte and the apoptosis of cumulus cells(T UNE L labeling)
组别groups
卵母细胞发育命运
developmental fate of oocytes
样本数
number
卵丘细胞凋亡率(%)
granus ola cell apoptosis rate
1发育为妊娠胚胎(pregnant embry os)21510001±011074d
2发育为优质胚胎(embry os of g ood quality)177612600±010201d
3发育为非优质胚胎(embry os of bad quality)98818100±013512c
42d受精而不分裂(fertilized but not divide at2d)681011491±012311b
52d仍不成熟(immatured at2d)451416697±014406a
注:与其他各组比较。标相同字母:P>0105;标不同字母:P<0105
N ote:C om pared with the other groups.Same characters indicate no significant difference(P>0105);Different characters indicate significant difference(P <0105).
用上述3种方法得到的凋亡率结果相似,即发育为优质胚胎的卵母细胞,其卵丘细胞凋亡率小于810;发育潜能差的卵母细胞,卵丘细胞凋亡率大于810;以此标准将用于结构研究的卵母细胞分为两组:卵丘细胞凋亡率小于810的样本5个为A组,平均凋亡率为711600±013076;卵丘细胞凋亡率大于810的样本14个为B组,平均凋亡率为1010200±015248。
?
9
9
6
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V ol.38,N o.6杨永杰等.卵丘细胞凋亡对体外培养卵母细胞发育潜能的影响
21卵丘细胞凋亡率与卵母细胞结构
卵丘细胞凋亡率低的卵母细胞形态结构正常,
与我们先期报道的结果一致[9]
。卵丘细胞凋亡率高的卵母细胞中出现多种结构异常,主要有以下几个方面:
211 卵母细胞质及细胞器:在半薄切片中观察到,卵丘细胞凋亡率低的A 组卵母细胞,胞浆清亮,颗粒细(图2A )。卵丘细胞凋亡率高的B 组,卵母细胞结构存在多种异常。有些卵母细胞卵周隙不均匀(图2B ),在电镜下观察到,同一卵母细胞不同部位的细胞质发育不同步,卵周隙大的地方,卵母细胞与卵丘细胞失去连接,线粒体等细胞器向质膜下迁移较早;而卵周隙小、卵母细胞与卵丘细胞连接紧密的部位,细胞器的迁移相对滞后(图3A ,3B )。有些卵母细胞中有粗大的颗粒(图2C ,2D ,2E ),在电镜下发现是堆积不均的细胞器团(图3A ,3B )。有些卵母细胞中有由单位膜包裹的含有许多小脂滴的次级溶酶体(图3C )。一些卵母细胞中有大量空隙(图2D ,3D )。有些卵母细胞虽然在光镜下形态结构正常,但在电镜下观察到较多的线粒体外膜和嵴模糊并膨大,呈现凋亡迹象(图3E )。
212 第一极体:A 组的卵母细胞,第一极体圆或卵圆、表面光滑;B 组中有些卵母细胞的第一极体碎裂(图2F ),观察第一极体超微结构发现,其中含有碎裂的核物质,细胞器特别是皮质颗粒排列无序(图2F ,3F )。
213 透明带:卵丘细胞凋亡率低的卵母细胞,透
明带厚度正常,一般在10～15μm (图2A ,B ,F )。在
凋亡率高的卵母细胞,半薄切片中观察到有的透明带异常增厚(图2C ),有的则异常薄(图2D ,E ),有的透明带在不同部位厚度不均。 214 卵丘细胞:在A 组中,电镜下可见卵丘细胞之间存在着广泛的细胞连接,包括紧密连接、桥粒和缝隙连接(图3G )。B 组卵丘细胞凋亡率高,卵丘细胞间细胞连接减少。凋亡的卵丘细胞,微绒毛减少甚至消失,染色质过早过多凝集,广泛异染色质化,有的核碎裂,形成凋亡小体,通过胞吐作用排到细胞外(图3H )。31HE 、DAPI 、TUNE L 3种检测方法的相关性
3种检测方法用SPSS 1010分析软件中的correlation 进行相关性分析。T UNE L 与HE 染色方法的资料相关系数为01723(P <0101);HE 与DAPI 染
色方法的资料相关系数01730(P <0101)。3种检测方法所得结果显著相关。
讨论
11卵丘细胞凋亡与卵母细胞结构及其发育潜能的
关系 111 卵丘细胞凋亡对卵母细胞质的影响:卵母细胞生长期线粒体、皮质颗粒等细胞器增殖及外迁是
卵母细胞质成熟的标志之一[9,10]
。在卵丘细胞凋亡率高的一些卵母细胞中,观察到不同位置的细胞器外迁程度不同,显示不同部位的胞质成熟程度不同,这可能与不同位置卵丘细胞与卵母细胞的相互作用差异有关;一些卵母细胞中有大量不均匀分布的成团的细胞器;一些卵母细胞中观察到线粒体嵴减少并致密化、膜和嵴模糊,出现凋亡的线粒体。线粒体在细胞能量代谢中起中心作用,细胞器的迁移也由线粒体提供能量。细胞器外迁程度不一致和细胞器的成团分布可能都与线粒体的功能低下有关。一项研究显示,人类受精过程中总是选择带有优质线粒
体的卵母细胞[11]
。线粒体的结构和功能状态将直接影响卵母细胞的结构和成熟,从而影响其发育潜能。
文献报道[12]
,有些异常M Ⅱ期卵母细胞中,有被许多小脂滴填满的次级溶酶体,溶酶体分解将其内容物释放入胞浆,导致周围细胞质降解。我们在卵丘细胞凋亡率较高的卵母细胞的超微结构中也观察到含有小脂滴的次级溶酶体和胞质空隙。这与前人报道的结果一致。 112 卵丘细胞凋亡对第一极体的影响:在卵母细胞体外成熟中,第一极体的排出常作为卵母细胞成熟的标志,第一极体的形态常作为卵母细胞的评价指标之一。只有具备了核质成熟的卵母细胞,才能获得受精能力及胚胎良好的发育潜能。我们观察到在卵丘细胞凋亡率高的一些卵母细胞中,存在第一
极体形态异常。有研究者报道[13,14]
,控制性超排卵和卵母细胞体外成熟(in vitro maturation ,I VM )中,尽管细胞核能正常成熟,排出第一极体,但常常缺乏胞质的成熟。胞质成熟与核成熟不同步,导致受精前卵母细胞在M Ⅱ期停顿时间延长,从而造成核成熟异常,并影响第一极体的形态,影响卵子受精能力及卵裂。 113 卵丘细胞凋亡对透明带的影响:在正常卵母
细胞的外面,都有一层厚度为10～15μm 的透明带包
覆着。透明带在卵子受精至胚胎早期发育这一复杂的过程中起重要作用。受精后,透明带厚度是胚胎质量的一个标志[15]
。卵子老化、体外培养过久、受温度改变的刺激,常会使透明带增厚,透明带增厚影响胚胎孵出;而透明带厚度随年龄增加有变薄的趋势[16]
。
透明带是由卵丘细胞和卵母细胞共同分泌的糖蛋白形成的,卵丘细胞和卵母细胞的功能状态必然会影响透明带的结构。本研究发现,在卵丘细胞凋
?007? 解 剖 学 报38卷,6期
?
107?V ol.38,N o.6杨永杰等.卵丘细胞凋亡对体外培养卵母细胞发育潜能的影响
图1 卵丘细胞凋亡检测
A.HE 染色结果,未凋亡的卵丘细胞核染色浅而均一;凋亡细胞(↑)体积缩小,细胞核染色深,染色质向核周边凝集;标尺示10μm ;
B.DAPI 染色结果,正常卵丘细胞核中染色质均匀;凋亡细胞(↑)染色质固缩,细胞核呈致密浓染,标尺示10μm ;
C.T UNE L 标记结果,凋亡阳性细胞(↑
)表现为棕黄色染色,凋亡阴性细胞核只被甲基绿染成淡绿色。标尺示10μm 图2 卵母细胞光镜观察结果
A.G V 期卵母细胞,正常对照,标尺示30μm ;B ～F.卵丘细胞凋亡率高的卵母细胞,标尺示30μm ;
B.培养后仍为G V 期卵母细胞,围卵周隙不均匀;
C.培养后M Ⅰ期卵母细胞:细胞中有粗大的颗粒,透明带异常增厚;
D.培养后M Ⅱ期卵母细胞:细胞中有大量空隙和粗大的颗粒,透明带薄;
E.培养后M Ⅱ期卵母细胞:示卵母细胞中有粗大的颗粒,透明带薄;
F.培养后M Ⅱ期卵母细胞:第一极体破裂,可见碎裂的核物质
图3 高卵丘细胞凋亡率的卵母细胞超微结构
A ,B.培养后仍处于G V 期的同一卵母细胞的不同部位。卵周隙小的部位,线粒体等细胞器的迁移相对滞后,卵周隙大的地方细胞器向质膜下
迁移较早,标尺示5μm ;C.M Ⅱ期卵母细胞,示次级溶酶体包含许多由单位膜包裹的小脂滴,标尺示015μm ;D.M Ⅱ期卵母细胞,示胞质空隙
(↑),标尺示5μm ;E.M Ⅱ期卵母细胞,线粒体外膜和嵴模糊、膨大,呈现凋亡迹象,标尺示015μm ;F.M Ⅱ期卵母细胞,极体碎裂,极体碎块中含
有核物质及细胞器,标尺示5μm ;G.正常卵丘细胞间广泛的细胞连接(↑),标尺示5μm ;H.凋亡的卵丘细胞形成凋亡小体(↑),内含核碎片,标尺示5μm ;
Fig.1 Detection of the apoptosis of cumulus cells
A ,The result of HE staining.N on 2apoptotic cumulus cells were with light and uniform ly stained nucleus.In the apoptotic cells (↑
)peripheral chromatin was observed in deeply stained nucleus.Bar =10μm ;B ,The result of DAPI staining.N on 2apoptotic cumulus cells were with light and uniform ly stained nucleus.
Apoptotic cell (↑)nucleus was stained deeply and densely.Bar =10μm ;C ,The result of T UNE L labeling.Apoptotic cumulus cells (↑
)were stained positively in yellow 2brown.N on 2apoptotic cells were stained negatively in green.Bar =10μm
Fig.2 O ocytes observed in sem i 2thin slices under light m icroscope
A ,O ocyte at G V stage as normal control.Bar =30μm ;
B 2F.O ocytes with high cumulus cell apoptosis rate.Bar =30μm ;B ,Cultured oocyte still at G V stage ,
showing uneven perivitelline space ;C ,Cultured oocyte at M Ⅰstage ,with large granules in ooplasm and abnormally thick z ona pellucida ;D ,Cultured oocyte at M
Ⅱstage ,with a great deal of spaces and large granules in ooplasm and abnormally thin z ona pellucida ;E ,Cultured oocyte at M Ⅱstage ,with large granules in
ooplasm and abnormally thin z ona pellucida ;F.Cultured oocyte at M Ⅱstage ,with fractured first polar bodies and smashed nuclear substance Fig.3 Ultrastructure of the oocytes with high cumulus cell apoptosis rate
A ,
B ,Different parts of the same oocyte still at G V stage after culture.In the part with a small perivitelline space ,the organelle development lagged com pared
with the part with a large perivitelline space.Bar =5μm ;C ,O ocyte at M Ⅱstage ,showing the secondary lys os ome with lipid droplets enwrapped by unit membrane.Bar =015μm ;D ,O ocyte at M Ⅱstage ,showing the large spaces in the ooplasm (↑).Bar =5μm ;E ,O ocyte at M Ⅱstage ,showing the sw ollen m itochondria with blurred cristae and membrane.Bar =015μm ;F ,O ocyte at M Ⅱstage ,showing the fractured first polar body with smashed nuclear substance.Bar =5μm ;G,The extensive cell junctions (↑)am ong normal cumulus cells ,Bar =5μm ;H ,The apoptosis bodies (↑)with nuclear fragments in apoptotic cumulus cell.Bar =5μm
亡率高的一些卵母细胞中,存在透明带结构异常,与上述推测一致。
114 卵丘细胞的变化:卵丘细胞通过缝隙连接与卵母细胞相连,接受外界信号并传递给卵母细胞,对卵母细胞的成熟分裂起调控作用[17]
。体外培养中
发现,保留卵丘细胞可以促进更多的卵母细胞发育
成熟,增加优质胚胎率
[18]
。有研究发现,卵丘细胞
凋亡与卵母细胞核的成熟控制密切相关。卵母细胞核和细胞质成熟在I VM 中的不同步,可能与卵丘细胞和hCG 对卵母细胞核成熟调节失衡有关
[17]
。
本研究发现,凋亡率高的组中,卵丘细胞间连接减少,卵丘细胞微绒毛减少甚至消失,与此相对应,卵母细胞成熟度低、形态结构出现多种不正常,说明卵母细胞能否经体外培养正常发育与卵丘细胞的功能状态有关。所发现的围卵周隙不均、过大及透明带过厚等结构异常,会使卵丘细胞与卵母细胞的联系减弱,影响了卵母细胞的发育。卵丘细胞与卵母细胞的相互作用决定着卵母细胞是继续发育还是凋亡。
21关于TUNE L 标记、HE 染色和DAPI 染色3种检
测方法的相关性
形态学是鉴定细胞凋亡最可靠的方法。细胞凋亡最先出现的形态学变化是染色体的改变,如DNA 的核周聚集、DNA 链的断裂和凋亡小体的出现等。研究细胞凋亡的形态学方法有多种,不同的研究者用不同的方法检测卵丘细胞的凋亡
[19,20]
。本研究采
用HE 、DAPI 和T UNE L 3种方法对卵丘细胞凋亡率进行检测和比较,证明3种方法所得结果显著相关,可相互替代。T UNE L 方法检测DNA 断裂点,可检测出早期凋亡还未发生形态学变化的细胞,准确客观、灵敏度高,但价格较昂贵。HE 法对于细胞凋亡数较多,且形态容易辨别的组织细胞是一种较好方法;对于凋亡细胞数量少且细胞多发生核固缩的组织不太适用。HE 法检测凋亡灵敏性略差,但快速、简便、价廉,在对灵敏度要求不高的实验中仍是一种良好的方法。DAPI 检测法灵敏度较高、快速,但需要特殊设备即荧光显微镜。
由于卵丘细胞的凋亡率可用以预测卵母细胞和胚胎的发育潜能,当前应使各种卵丘细胞凋亡的检测方法标准化,对于卵丘细胞凋亡率用于卵母细胞
?
207? 解 剖 学 报38卷,6期
发育潜能的鉴别标准化,有利于临床应用。我们的研究有利于实现这一目标。
参考文献
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(编辑 安晓意)
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V ol.38,N o.6杨永杰等.卵丘细胞凋亡对体外培养卵母细胞发育潜能的影响
见表1。 3 讨论 子宫肌瘤育龄期妇女患病率高达20%～25%。我科根据子宫肌瘤“肝郁”、“脾虚”、“血瘀”的病机特点,以疏肝健脾、益气养血、化瘀散结组方制成子胞康胶囊,分别于月经前和月经后服用,不仅能够显著缩小或消除子宫肌瘤瘤体,且能明显降低患者血清雌、孕激素水平[3]。子宫肌瘤的发生主要与长期、大量的雌、孕激素刺激有关[4],本文结果显示:雌激素能使大鼠子宫肌层增厚,肌纤维肥大,结构紊乱;而子胞康胶囊鼠子宫肌层细长,排列规则,肌层厚度亦显著低于模型组,表明其可拮抗雌激素的作用,使子宫肌层的改变全部或部分恢复正常。同时,子胞康胶囊还能明显降低大鼠血清E2、P浓度,以上结果提示,调节雌、孕激素水平为子胞康胶囊治疗子宫肌瘤的作用机理之一。另外,从组织学观察中可见,模型组部分大鼠子宫积水、淤血,子宫内膜及卵巢有较明显的化脓性感染,并有大小不一的脓肿形成。而子胞康胶囊大剂量组完全无此现象,小剂量组偶尔可见脓肿形成,提示子胞康胶囊可能同时具有抗炎、抗菌及改善微循环作用,具体情况有待我们进一步研究。 参考文献 1 香卫红.消瘤丸对雌性激素负荷大鼠子宫肌层影响的实验研究.中医杂志,1998;39(6)∶346 2 盛一方.40例子宫肌瘤外周血和卵巢血的五项激素变化.上海医科大学学报,1995;22(1)∶69～71 3 王永林,苏旭春.雌激素高峰期以中医药治疗子宫肌瘤40例临床观察.湖南中医药导报,2000;6(3)∶23～24 4 孙梅.子宫肌瘤的病因学研究进展.国外医学妇产科分册,1997;24 (3)∶160～163 补肾中药对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响Ξ 李冬华,朱飞鹏1 (首都医科大学中医药学院,北京 100013;1国家食品药品监督管理局药品审评中心,北京 100038) 摘 要 目的:观察补肾中药活性成分对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响。方法:体外培养成骨细胞,观察补肾中药含药血清对成骨细胞增殖率和AL P活性的影响。结果:补肾中药含药血清对成骨细胞增殖能力和AL P活性有增强作用。结论:补肾中药活性成分对体外培养成骨细胞的增殖和功能有促进作用。 关键词 成骨细胞;增殖和功能;补肾中药 由肾主骨理论指导下的补肾法在骨代谢疾病的治疗中占有重要地位。现代医学的发展使得我们得以从细胞、分子水平揭示肾在骨代谢中的重要地位。本文通过体外培养成骨细胞,观察补肾中药活性成分对成骨细胞增殖和功能的影响,为补肾中药治疗骨代谢疾病提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 试验药物 补肾中药由菟丝子、何首乌等提取的活性部位组成,由复旦大学药学院提供。 1.2 试剂和仪器 M EM培养基干粉(美国GIBCO 公司产);新生小牛血清(NCS,美国GIBCO公司产);胶原酶Ⅱ(CollagenaseⅡ,Sigma公司产);胰蛋白酶(华美生物公司)。二氧化碳培养箱(德国产),倒置相差显微镜(日本Olympus公司产);光学显微镜(日本Nikon 公司产);酶标仪(美国Bio2Tek公司产)。 1.3 方法1.3.1 大鼠成骨细胞分离培养 出生24h内小鼠10只雌雄兼用,自来水冲洗后放入75%酒精内5min,无菌剪开头部皮肤,手术刀切下颅盖骨,清除骨表面的结缔组织,PBS反复冲洗至骨组织发白,用剪刀将骨组织剪碎至1mm×1mm大小的骨片,0.25%胰蛋白酶5ml 37℃预消化20min,弃消化液,0.1%Ⅱ型胶原酶5ml 37℃消化60min,移取消化液,离心1000rpm×10min,弃上清,加入适量培养液;将骨片再次用0.1%Ⅱ型胶原酶5ml37℃消化60min,移取消化液,离心1000rpm ×10min,弃上清,加入培养液适量;混匀二次消化的细胞,接种于25cm2培养瓶(3×105/瓶),在5%CO2、95%空气、37℃条件下培养24h后换液一次,以后每3天换液一次,细胞汇合后,0.25%胰蛋白酶消化,3×105/瓶分瓶接种于25cm2培养瓶(第一代细胞),继续培养,汇合后用于测定成骨细胞的增殖及功能等。 1.3.2 补肾中药含药血清制备 3月龄雄性SD大鼠30只分为3组:中药组、空白组和CMC对照组。中药 23中药药理与临床2005;21(2)Ξ北京市优秀人才培养专项经费资助
胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源 李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2 胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1 神经细胞 体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 1 Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 2 Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 3 Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 4 裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)
鱼类卵细胞的发育与成熟 1.卵原细胞反复进行有丝分裂，细胞数目不断增加，经过若干次分裂后，卵原细胞停止分裂，开始生长，向初级卵母细胞过渡。此阶段的卵细胞为第I时相卵原细胞，以第I时相卵原细 胞为主的卵巢称第I期卵巢。 2. 小生长期是卵母细胞的生长期，开始时，细胞质呈微粒状，细胞核卵形，占卵母细胞的大部分，其内壁四周排列着许多小核（或称核仁），中央为粒状的染色质，有时细胞质中可见卵黄核。卵母细胞进一步发育，卵膜外出现了一层滤泡膜，由单层上皮细胞组成，内有长形的核。小生长期发育到单层滤泡为止，这时的卵母细胞，称为卵母细胞成熟的第n时相，以第n时相卵母细胞为主的卵巢称为n期卵巢。性未成熟的鱼，常有相当长的时期停留在n 期。 第一时相图（1-3）：卵母细胞一般出现在体长为 6.0 cm 以 下的当年生幼鱼卵巢中。生殖上皮具有2—3 层增殖分生而成的密集的卵原细胞, 其大小不 一。胞径3.6—16.0卩m胞核2.5 —10.0卩m,浅紫色，可见交织状粗丝形染色质（图1）,附于生 殖上皮的第 1 时相卵母细胞形态不规则, 浅紫色, 具 1 个巨大的深紫色核仁（图2）。基质中第 1 时相的卵母细胞长椭圆形, 质膜外出现一层滤泡膜, 具2— 4 个深紫色滤泡细胞（图3）。 第二时相（4-7） （1）早期图: 卵母细胞排列紧密, 形态不一;多数呈多角形、少数为卵圆形。细胞核透亮, 核中 染色体逐渐解散, 但仍可看到呈细丝状残迹。胞质显嗜碱性, 成细颗粒状分布。核椭圆, 染色浅。核仁大小不一, 数量增多, 一般位于核膜内缘。单层滤泡膜, 5—7 个扁平滤泡细胞围 绕着卵母细胞（图4）。 ⑵中期：卵母细胞一般呈椭圆形，胞质深紫色。核与胞质间形成一条宽为0.2 —0.5卩m勺透明层（图5）, 透明层内物质密度很稀, 显得透亮。 （3）晚期：卵母细胞排列松散。一般呈圆球形, 胞质呈弱嗜碱性, 油球数量明显增多, 分布均匀。胞质中出现许多呈网状分布的纤维结构, 在网眼中仍有许多被苏木精染成深紫色的微细颗粒。这时细胞核迅速膨大, 核周透明层变薄渐消失, 核仁明显缩小, 绕核膜边缘分布（图6）。单层滤泡膜中出现微血管（图7）。 第 3 时相（8-13） （1）早期图：卵母细胞梨形，胞质浅紫色，油球均匀分布。核位中央，核仁圆形（图版1-8）。在胞质的皮质部分出现一层松散排列、大小不一的液泡（图版1-9），液泡直径2.0—3.0卩m均匀 分 布着浅紫色内容物，一般被认为是中性粘多糖物质。（2）中期：卵母细胞液泡2－3层，液泡间出现紫红色的微小卵黄粒。随着卵母细胞继续发育，卵黄数量增多，并向核方向逐渐扩散，细胞质向核外周堆集，呈紫色粗粒状。核圆形，核仁大小不均，分布在核膜周边（图版I-10）。滤泡膜分化为两层细胞：内层棒形，长4.0—10.0卩m排列紧密；夕卜层细胞扁平、细长，排列疏松（图版1-11）。⑶晚期：卵母细胞（图版I-12）饱满，细胞核近圆球形，位于卵母细胞中央。核膜略呈波纹状，在核膜内缘存在着十几个到数十个不等的细小核仁，一般未见粗大核仁存在。卵黄颗粒直径0.5—1.0 （im油球数量增多，分布不均匀。胞质的皮质部分首先出现一些染成紫红色的卵黄颗粒，以后卵黄颗粒渐增多，广泛分布于液泡之间的细胞质中。细胞膜中未见放射纹。滤泡膜内层细胞基本呈立方形，卜层细胞仍为扁平状（图版I-13）。 第 4 时相（14-4）
成骨诱导液： 地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C， OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphate PG(磷酸甘油)和Vc配好放四度， Vc尽量分装保存，减少与空气接触， 三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配 成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min 离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。于37 ℃，含体积分数5%CO2培养箱培养。48 h后换液，以后隔日换液1次。 成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过 程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。 成骨细胞鉴定：
活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。 Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。 碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min， 按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。 阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。 ? 茜素红染液 操作 1. 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用 1×PBS冲洗 1-2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。 2.吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1 mL茜素红染液染3-5 min。 3.吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2-3次。 4. 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
浅谈体外培养成骨细胞 张杰 （陕西理工学院生物科学与工程学院生物科学081班陕西汉中 723000） 【摘要】成骨细胞是骨形成和骨代谢的核心部分，随着体外细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，成骨细胞体外培养是研究骨代谢和成骨机制的重要手段。现就成骨细胞的来源、分化调控因子、复合移植及中医药方面和影响因素的研究进展作一综述。 【关键词】成骨细胞；细胞培养技术；移植；中药；影响因素； 成骨细胞是骨形成细胞，对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量平衡和损伤修复起关键作用。随着细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，研究表明培养出的成骨细胞具有良好的生物学特性，在不同环境下可以形成骨组织，现就成骨细胞的研究进展作一综述。 1 成骨细胞的来源 国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨为成骨细胞的常用来源。有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学活性及发生钙化的功能。有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖．代谢及钙化的能力发现，来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力，但碱性磷酸酶的生成较低，而且兔盖骨来源的成骨细胞在体外培养中可以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石(HA)结晶。骨膜是骨骼膜性成骨的细胞来源，若将体外培养的骨膜细胞移植入体内，在理论上能形成骨组织，修复骨缺损，很多学者对此展开了研究并取得成功。Turhani等【1】将骨膜细胞接种到HA支架上进行培养，观测到HA上细胞具有良好的活性，表达骨特定因子，如骨钙素和骨桥蛋白，三维HA 对骨膜间充质细胞的生长行为起着积极作用。从研究中可知，骨膜源性细胞(PDC)具有很强的增殖能力和分化成骨潜能间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞，主要存在于骨髓，还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织，如脂肪干细胞、血管内皮细胞、胚胎干细胞等。骨髓MSCs在体外适当的培养条件下，具有向成骨细胞方向分化潜能。Gronthos等【2】把人骨MSCs分离体外扩增后与HA／磷酸三钙载体复合，再植入裸鼠背部皮下，发现载体周围有骨髓和新骨组织形成，而且通过原位杂交显示新骨组织中的骨细胞是人来源。Cowan等【3】一和Wan等【4】研究发现小鼠脂肪来源基质细胞诱导分化的成骨细胞体内移植成功的修复了颅盖骨缺损。近年来对脐血干细胞的研究越来越多。并指出脐血MSCs具有多向分化潜能，Yang 等【5】一成功将脐血MSCs诱导分化为软骨细胞与成骨细胞。此外Wan等渴。报道外周血来源间充质细胞能够向成骨细胞分化，并参与骨损伤修复。Henning等研究羊水来源间充质细胞向成骨细胞诱导分化，研究结果显示其增殖、分化能力比成人组织来源的MSCs更强，作为组织工程种子细胞也更为理想。在不同来源成骨细胞的研究中，增殖能力以骨髓基质干细胞最好，钙化能力以骨膜成骨细胞和松质骨成骨细胞最好，而胶原合成，骨钙素表达以及碱性磷酸酶活性以骨膜成骨细胞最好。组织工程化人工骨所需要的种子细胞应具备强的增殖能力和良好的成骨功能，可见3种来源细胞都不能达到骨组织工程的理想要求，解决组织工程种子细胞的途径是建立标准成骨细胞系，通过基因工程技术对成骨细胞进行改造，使其转变为既有较强增殖能力．又有较强成骨能力的标准细胞。 2 成骨细胞的分化调控因子的研究进展
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 卵子发生 原始卵泡 初级生长卵泡 次级生长卵泡 成熟中的卵泡 成熟卵泡（滤泡）和成熟卵 卵母细胞和卵泡细胞的关系 卵的结构 细胞核 染色体 核仁 细胞质 色素 皮层颗粒 环层板 卵黄 卵的类型 卵膜 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 动物成熟的雌性生殖细胞，亦称卵子。一般呈球形或椭球形，较大，多不能活动。它除具有一般细胞所共有的细胞核、细胞质、细胞器和质膜外，还有一些专供受精后发育所需的营养物质。以哺乳类为例，性成熟后，在神经和激素调控下自卵巢中排出的成熟卵，其外有透明带和放射冠包围，在透明带和质膜之间为充满液体的卵周隙（图1）。 卵（动物） 卵子发生
在性成熟之前卵巢皮层中有相当数量的卵原细胞。卵原细胞是在胚胎时期原始生殖细胞迁移到生殖嵴内分裂繁殖而产生的。卵原细胞之间存在着细胞间桥，所以发育的同步化程度较高。但同步化只限于这一时期，卵原细胞转变为初级卵母细胞时，细胞间桥消失，彼此分开，这点与精子发生不同。哺乳类在胎儿出生前或出生后不久，卵原细胞全部发育为初级卵母细胞。在个体性成熟之前初级卵母细胞不生长。性成熟后卵巢皮层中的、被卵泡细胞包围着的初级卵母细胞在激素刺激下生长，细胞核进行DNA复制,然后进入成熟分裂的前期变化。生长到一定的体积后，初级卵母细胞进行第一次成熟分裂，产生一个次级卵母细胞和第一极体；次级卵母细胞再进行第二次成熟分裂，产生卵子和第二极体。这些变化都是在卵泡中进行的(图2)。卵子和卵泡的发育大致可以划分为： 卵（动物） 原始卵泡尚未开始发育的卵泡，位于卵巢的皮层，由一个卵原细胞和外围一层扁平的卵泡细胞组成，数量很多，但在各类动物中差别很大。 初级生长卵泡卵泡细胞由扁平变为立方形，从一层增殖为几层，卵母细胞也开始增大，细胞核发生一系列成熟分裂前期的变化，产生大量核液，形似球状；在卵母细胞周围开始出现透明带。在透明带中有从卵母细胞和卵泡细胞的表面伸出的微绒毛，它们相互接触，构成卵泡细胞给卵母细胞输送物质的通道。 次级生长卵泡卵泡不断增大，外围的卵泡细胞有几层到十几层，在卵泡细胞之间出现充满透明液体的不规则腔隙，其中的液体即卵泡液。这时卵母细胞也长到最大的体积，并为一层较厚的透明带所包裹。 成熟中的卵泡卵原细胞过渡到卵母细胞，已长到最大体积，并准备成熟分裂；它周围的腔隙逐渐合并越来越大，卵泡仍可继续生长。 成熟卵泡（滤泡）和成熟卵此时体积到达最大限度。初级卵母细胞渐位于卵泡一侧，向腔内突出，仍为卵泡细胞包围，此即卵丘。人的卵泡直径可达1厘米,并从卵巢表面突出。卵泡中的卵母细胞已完成第一次成熟分裂并停止于第2次成熟分裂的中期，等待排卵（图3）。
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
卵母细胞的核相分为：待成熟受抑制状态的生发泡(Germinalvesicle，GV)期(根据发育程度进一步细分为GⅥ期-GVⅣ期)、进入成熟状态的生发泡破裂（Germinalvesiclebreakdown，GVBD)和之后的减数分裂(Meiosis，M)期(分为MⅠ期和MⅡ期，MⅠ进一步细分为中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ)。 生发泡破裂是卵细胞发育过程中的一步，它标志着卵细胞的成熟，此时卵细胞由GV 期（germinal vesicle）进入GVBD期（germinal vesicle breakdown）。[1]主要特征是染色质高度凝集，核仁消失，核膜破裂，卵母细胞将从M1期进入M2期，排出第一极体达到成熟状态。 GV期特征：GV期卵母细胞是卵原细胞成为初级卵母细胞之后,经细线期、偶线期、粗线期发育到双线期。在双线期后期,卵母细胞的核很大,染色质高度疏松,外包完整的核膜,此时的细胞核又称GV M1期特征：染色体浓缩成清楚的单体，并整齐的排列在赤道板上。 后期1：染色体向卵子两极移动，有些可隐约看到纺锤体。 末期1：课件两团染色体存在，并未完全分离。 M2期：卵周隙中见到第一极体排出，另一团染色体呈分散状态。 众所周知, 卵泡的发育经历了始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡、排卵前卵泡阶段。初级卵泡阶段, 卵母细胞周围开始围绕一层颗粒细胞, 颗粒细胞供给卵母细胞生长发育所需的85%的营养[6]。随后, 颗粒细胞开始出现突起, 卵母细胞也出现微绒毛, 两者之间以桥粒和缝隙连接相连, 很快卵母细胞产生一层富含糖蛋白的物质形成透明带。发展到窦状卵泡阶段, 颗粒细胞增殖到6~12层, 窦腔形成, 颗粒细胞开始分化为功能及解剖上不尽相同的2 类细胞: 壁层颗粒细胞(granulosa cells,GCs)和卵丘细胞(cumulus cells, CCs)卵泡中的缝隙连接使GCs、CCs 与卵母细胞共同形成一个结构和功能上的合胞体。 卵细胞胞质中游离钙的升高时受精过程中启动卵子激活的一个重要因素 卵受精之前，代谢水平很低，无DNA的合成活动，RNA和蛋白质的合成都极少。因此排出的卵子，如果未受精，很快就夭折。当精子与卵子表面融合时，卵子的代谢速率迅速提高，并开始合成DNA。有关卵子激活的详细机理还不清楚，只知精子仅起到打开程序开关的作用。除了精子，一些其他非专一的化学的或物理的处理，也能使卵激活，例如针刺蛙卵，也能使之激动。激动的起始无需任何新蛋白质的合成。 排卵期成熟的卵细胞由卵巢排出﹐进入输卵管的壶腹部﹐此时宫颈粘液稀薄﹐适宜精子进入。性交时﹐精液射到阴道后穹窿﹐部分精子通过宫颈管﹑宫腔﹑输卵管口﹐到输卵管峡部与壶腹部交界处。穿进卵细胞前必须经过形态﹑生理及生物化学的变化﹐称为精子获能﹐获能后的精子头部入卵细胞﹐尾部留在卵细胞外(精子的头部几乎不含细胞质，所以受精卵的细胞质遗传物质可认为全部来自卵子，称为细胞质遗传)﹐精子与卵细胞融合成为一个新的合体细胞﹐此过程称为受精。已受精的卵细胞称为受精卵或孕卵。人类的孕卵含有46个染色体(来自父母的各23个)。
高中生物人教版必修2 第2章第1节减数分裂和受精作用卵细胞的形成过程（I） 卷 姓名:________ 班级:________ 成绩:________ 一、单选题 (共12题；共24分) 1. （2分） (2019高一下·江门月考) 下列关于同源染色体和四分体“一定”的叙述，正确的是（） A . 同源染色体在细胞分裂过程中一定能够配对 B . 含有四条姐妹染色单体的一定是四分体 C . 一个四分体一定是一对同源染色体 D . 一对同源染色体一定是一个四分体 【考点】 2. （2分）(2019·浙江会考) 图①~④表示人类精子产生过程中染色体的部分行为。下列叙述错误的是（） A . 图中各行为出现的先后顺序是①③②④ B . 图①中的交叉现象在精子产生过程中常有发生 C . 图③所示行为发生的同时，非同源染色体自由组合 D . 发生图④所示行为的细胞是初级精母细胞 【考点】 3. （2分） (2017高一下·成都期中) 下列说法正确的是（）
A . 研究两对相对性状时，每一对相对性状的遗传都遵循分离定律，那么两对之间就一定遵循自由组合定律 B . 某奶牛的一个精原细胞，减数分裂后可能产生4种或2种精子 C . 子代性状的多样性导致的原因只与配子形成时的多样性有关 D . 某生物测交后代只有两种表现型，则该生物一定只含一对等位基因 【考点】 4. （2分） (2015高二上·余杭期末) 图表示细胞分裂和受精作用过程中，核DNA含量和染色体数目的变化，据图分析，正确的是（） A . a表示有丝分裂，b表示减数分裂，c表示受精作用和有丝分裂 B . DE、HI和PQ段均发生了着丝粒分裂 C . GH段和OP段的细胞中含有的染色体数目是相等的 D . MN段和AB段的细胞中核DNA含量相同 【考点】 5. （2分）同一生物细胞分裂图解，在动物卵巢中见不到的是（） A .
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/e410823099.html, 哺乳动物卵母细胞成熟相关因子研究 作者：张羽芳阳美霞汤亚茹张虹亮王水莲 来源：《医学信息》2020年第14期 摘要：哺乳动物卵母细胞主要参与动物繁殖活动，其体外成熟技术也是体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的关键。卵母细胞从胚胎期至青春期前始终维持停滞状态，直到青春期减数分 裂恢复，随后卵母细胞成熟。在此期间，表皮生长因子、马绒毛膜促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素、环磷酸腺苷、成熟促进因子及卵泡液等因子均参与卵母细胞成熟的调控。本文主要分析上述6种因子对卵母细胞成熟调控的影响，旨在完善卵母细胞成熟的相关理论机制，为卵母细胞体外成熟培养体系提供参考。 关键词：卵母细胞;成熟;表皮生长因子;人绒毛膜促性腺激素;成熟促进因子 中图分类号：R321; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ;文献标识码：A; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ;DOI： 10.3969/j.issn.1006-1959.2020.14.007 文章编号：1006-1959（2020）14-0017-04 Study on Factors Related to Maturation of Mammalian Oocytes ZHANG Yu-fang，YANG Mei-xia，TANG Ya-ru，ZHANG Hong-liang，WANG Shui-lian （Department of Veterinary Medicine，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China） Abstract：Mammalian oocytes are mainly involved in animal reproduction activities， and their in vitro maturation technology is also the key to in vitro fertilization-embryo transfer （IVF-ET）. Oocytes remain stagnant from embryonic stage to pre-pubertal period， until meiosis in puberty recovers， and then the oocyte matures. During this period， factors such as epidermal growth factor， horse chorionic gonadotropin， human chorionic gonadotropin， cyclic adenosine monophosphate， maturation promoting factor， and follicular fluid are involved in the regulation of oocyte maturation. This article mainly analyzes the influence of the above six factors on the regulation of oocyte maturation， and aims to perfect the relevant theoretical mechanism of oocyte maturation，and provide a reference for the in vitro maturation culture system of oocytes. Key words：Oocyte;Maturation;Epidermal growth factor;Human chorionic gonadotropin;Maturation promoting factor
生物学通报２００７年第４２卷第９期细胞体外培养时为什么会贴到培养皿壁上 刘梅芳徐国恒‘（北京大学医学都生理系北京１０００８３） 北京市第２２中学的生物学教师陈珊问：动物细胞培养时为什么会出现贴壁现象？ 答：第１。绝大部分细胞在机体内的环境下是与其他细胞或者细胞外基质结合的，不是孤立存在的。第２，细胞与细胞或者细胞外基质结合的物质基础以及在体外培养中贴壁的物质基础是什么。 在体内，大部分细胞不是孤立存在的（血液中的细胞除外）。一般一种细胞具有一种特定的功能．不同种细胞有机组合在一起就构成能够完成较为完整的一项功能的器官。细胞之问，细胞与细胞外基质之间结合在一起，这使得每一部分组织或者器官具有一定的外形及特定的功能。血液在体内是起运输作用的，不停地流动，要通过只有几个“ｍ的毛细血管，所以血液中的细胞是单个存在的。否则就会发生血管阻塞。但是它们受到刺激．其表面与黏附有关的蛋白会被激活然后与其他细胞或细胞外基质结合．如血小板接触到破损内皮下的胶原被激活而黏附在局部，从而发挥止血的功能；如巨噬细胞可以将衰老的红细胞、血液中凋亡的中性粒细胞结合并将其吞噬，这些都应该是属于细胞之间的结合。另外有些研究表明细胞必须与其他的细胞发生联系才能够生存．如果没有其他细胞或者细胞外基质与之结合．此细胞就会发生凋亡，称为失巢凋亡。 细胞在体外培养的条件下的贴壁，首先并不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁，但大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁。贴壁的过程可能是这样的。细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（培养瓶，培养皿的底面），然后细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。所以细胞贴壁与否与细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关。 细胞贴壁的过程使形态发生很大变化．细胞变形运动是细胞内骨架本身和细胞外基质共同作用的结果。细胞为什么要贴壁，可以想象一下．密度大于培养基的细胞（绝大部分细胞）会沉在底面上，那么细胞要生存必定改善这个环境。分泌细胞外基质，然后很自然就贴附在底面上了，而悬浮细胞．如淋巴细胞由于重力原因沉在培养瓶的底面，但是并不贴附，这可能与细胞表面的黏附分子少，以及分泌的细胞外基质过少有关．有人研究用细胞外基质处理培养器皿的底面．即增加细胞外基质，可以使悬浮的淋巴细胞贴壁。另外悬浮生长的细胞系ＴＨＰ一１受到某些药物刺激之后也可以贴壁．这可能与细胞本身分泌的细胞外基质以及细胞表面的黏附分子表达增多有关。密度小于水的细胞，如脂肪细胞，漂浮在液面上。所以不可能贴在底面上．但是如果将培养液加满，那么细胞能够与培养瓶上面的壁接触同样可以贴壁。因此可以说，细胞贴壁是适应环境的一种反应。 （Ｅ—ＩＩｌａｉｌ：ｘｕｇ＠ｂｊｗＬＩ．ｅｄｕ．ｃｎ） （ＢＨ） 欢迎订阅２００８年《生物学教学》杂志 《生物学教学）杂志是由华东师范大学主办，向国内外正式发行的全国教育类核心期刊。国内统一刊号：ｃＮ３１一Ｉ００９，ｃ４．国际标准刊号：１００４—７５４９。读者对象以中学生物学教师为主，兼顾高校和其他生物学工作者。主要栏目有：生物科学综述、国家课程标准与实验教材、现代教育论坛、教育教学研究、课堂教学设计与实践、信息技术、国外教育动态、考试与命题、实验教学、科技活动、教学参考、生物学科技信息、科学技术与社会、读者之窗等。另外，封面、封底刊登生物照片。 《生物学教学》杂志为８０页，月刊，国际标准１６Ｋ，２００８年定价：７．００元，全年８４元。国内订购：全国各地邮局，代号４—４５０。国外订购：中国国际图书贸易公司（北京３９９信箱，邮编：１０００４４），代号：Ｍ５１０５。如果错过了邮局订购时间，可以与杂志社联系邮购。杂志社地址：华东师范大学《生物学教学》杂志社，邮编：２０００６２．电话０２ｌ一６２２３２２２５。电子信箱：ｓｗｘｉｗ＠ｂｉｏ．ｅｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。